發(fā)酵對(duì)米粉生產(chǎn)的降鎬作用及其微生物學(xué)機(jī)理

徐文華 ，張文釗 ，侯海軍 ，魏文學(xué) ，盛榮

（1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站，湖南 常德 415700；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

水稻是我國(guó)的主要糧食作物之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)稻谷產(chǎn)量約占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的30%，水稻的安全生產(chǎn)在我國(guó)糧食安全中具有舉足輕重的地位。鎘是一種重金屬元素，在土壤中含量較低，主要以水溶態(tài)、吸附態(tài)、絡(luò)合態(tài)和礦物態(tài)等形態(tài)存在[1]。由于采礦煉礦和工廠排污等問(wèn)題導(dǎo)致部分稻田鎘含量超標(biāo)而生產(chǎn)出“鎘大米”。近些年，大米鎘含量超標(biāo)事件屢見(jiàn)不鮮，給水稻的安全生產(chǎn)帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。根據(jù)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部2014 年發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國(guó)土壤總超標(biāo)率為16.1%，其中鎘污染超標(biāo)點(diǎn)位最多，達(dá)到7%。在一些污染地區(qū)的大米樣品調(diào)查中，約56%～87%的大米樣品超過(guò)中國(guó)食品安全限值0.2 mg/kg（《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量（GB2762-2017）》），其平均鎘含量達(dá)到0.33～0.69 mg/kg[2]。鎘是人體的非必需元素，膳食攝入是非吸煙人群接觸鎘的主要來(lái)源，鎘進(jìn)入人體后會(huì)選擇性積累在各器官中，生物半衰期長(zhǎng)達(dá)幾十年之久，其毒性表現(xiàn)為引發(fā)人體多種綜合癥，包括貧血、高血壓、心力衰竭、肝肺損傷、腎功能衰竭等，被列為第一類致癌物質(zhì)[3]。因此，稻米鎘超標(biāo)已成為影響國(guó)家糧食安全和人體生命健康的重要隱患，如何實(shí)現(xiàn)稻谷的安全生產(chǎn)和鎘超標(biāo)稻米的安全利用備受社會(huì)和學(xué)者關(guān)注。

目前，針對(duì)“鎘大米”問(wèn)題主要有三個(gè)解決方向：一是從源頭入手，即采取物理[4-6]、化學(xué)、生物修復(fù)等方法降低土壤中的鎘含量。生物修復(fù)又包括動(dòng)物修復(fù)、植物修復(fù)、微生物修復(fù)[7]；二是通過(guò)編輯相關(guān)基因或蛋白調(diào)控水稻中鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累來(lái)選育新型水稻品種[8-10]；三是對(duì)已收獲的鎘含量超標(biāo)稻米進(jìn)行再加工使鎘含量達(dá)標(biāo)[11]。其中土壤修復(fù)以及水稻選育都需要較長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)程，而對(duì)“鎘大米”進(jìn)行加工降鎘不僅能使部分鎘超標(biāo)大米實(shí)現(xiàn)安全利用，減少浪費(fèi)，而且周期短，見(jiàn)效快，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。關(guān)于稻米加工降鎘的方法主要包括物理法、化學(xué)法以及生物法。物理法是指利用物理過(guò)程將稻米鎘含量降低的方法，包括加水浸泡[12]和礱谷加工[13]等方法，操作簡(jiǎn)單且對(duì)大米品質(zhì)影響較小，但降鎘效果一般難以使鎘含量較高的稻米鎘含量達(dá)標(biāo)?；瘜W(xué)法多采用酸堿浸泡使鎘元素從稻米中遷出，降鎘率較高且耗時(shí)較短，但若應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)則需消耗大量的酸堿，廢酸廢堿處理不當(dāng)可能會(huì)造成環(huán)境污染，加工成本也相對(duì)較高，且是否存在因使用化學(xué)試劑導(dǎo)致試劑殘留進(jìn)而引發(fā)食品安全問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究[14-15]。生物法主要指微生物發(fā)酵法，稻米發(fā)酵是食品生產(chǎn)過(guò)程中較常見(jiàn)的技術(shù)，廣泛應(yīng)用在米粉、米酒、米飲料等生產(chǎn)制作過(guò)程。研究表明，某些種類的微生物可以通過(guò)將金屬離子結(jié)合到其細(xì)胞表面或?qū)⑵滢D(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存在其細(xì)胞內(nèi)從而達(dá)到去除發(fā)酵體系中重金屬的效果[16]，如芽孢桿菌[17]、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌等[18-20]。研究人員通過(guò)對(duì)幾種傳統(tǒng)發(fā)酵微生物菌種的初步探索發(fā)現(xiàn)，利用乳酸菌或羅伊氏乳桿菌+發(fā)酵乳桿菌+植物乳桿菌混菌發(fā)酵可有效降低大米和果蔬汁中的鎘含量[21-24]。此外，微生物發(fā)酵還可能通過(guò)降解大米中的蛋白質(zhì)，使結(jié)合態(tài)鎘游離出來(lái)[25]。而且，利用微生物發(fā)酵不僅能有效消減稻米中的鎘，還能提升大米的食用口感[26]。因此，利用微生物發(fā)酵降鎘有望成為“鎘大米”安全利用的重要手段。然而，目前關(guān)于大米發(fā)酵降鎘的主要功能微生物類群及其關(guān)鍵作用機(jī)制還缺乏清晰的認(rèn)知，嚴(yán)重制約我們對(duì)降鎘微生物資源的挖掘利用和稻米高效、安全降鎘技術(shù)的研發(fā)。

鮮濕米粉口感好，食用方便，作為主食或早餐深受我國(guó)廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，常德市一米粉廠雖然使用了鎘輕度超標(biāo)大米為原料，但生產(chǎn)出的米粉鎘含量遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中大米的發(fā)酵過(guò)程可能是降鎘的關(guān)鍵步驟。本項(xiàng)研究基于常德米粉加工過(guò)程的降鎘現(xiàn)象展開(kāi)，探究稻米自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的組成結(jié)構(gòu)，揭示稻米鎘含量降低過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)傳統(tǒng)的微生物分離方法獲得優(yōu)勢(shì)菌株并研究其降鎘功能及作用機(jī)制，為大米發(fā)酵液中高效降鎘菌株的開(kāi)發(fā)利用提供參考。該項(xiàng)研究將豐富鎘超標(biāo)大米的降鎘微生物資源和降鎘技術(shù)，為鎘超標(biāo)大米安全利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試稻米：米粉發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程微生物種群演變及降鎘作用研究采用早秈米（鎘含量約為0.49 mg/kg），原始米樣、成品米粉、經(jīng)1、3、4 d 自然發(fā)酵的米樣均采集于常德市一米粉廠；為進(jìn)一步探討分離出的發(fā)酵功能微生物菌株的降鎘能力，實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵試驗(yàn)采用鎘重度超標(biāo)的晚秈米（鎘含量約為1.05 mg/kg），取自鎘污染試驗(yàn)基地。

發(fā)酵液：2020 年12 月，采集于米粉廠中經(jīng)1、2、3、4 d 發(fā)酵的大米發(fā)酵原液（分別記作D1、D2、D3 和D4），每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液分別取3次重復(fù)，米粉廠原料為早秈米。

LB 瓊脂培養(yǎng)基每升含量：蛋白胨10.0 g、酵母膏粉5.0 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15.0 g，最終pH 7.0 ± 0.2。

MRS 瓊脂培養(yǎng)基每升含量：蛋白胨10.0 g、牛肉膏粉5.0 g、酵母膏粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、碳酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2 g、硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g、瓊脂15.0 g、最終pH 6.2 ± 0.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品中鎘含量測(cè)定 采集于米粉廠的發(fā)酵過(guò)程米樣、米粉產(chǎn)品以及模擬發(fā)酵試驗(yàn)的米樣的處理參考GB5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》中的干試樣制備。

米樣中鎘含量的測(cè)定：參考GB5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》中的濕式消解法，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀ICP-MS7900（美國(guó)安捷倫科技有限公司）測(cè)定消化液中的鎘含量。

試樣中鎘含量的計(jì)算公式為：

式中：CCd為樣品中鎘含量（mg/kg），Cs為樣品消化液中鎘含量測(cè)定值（μg/L），C0為試劑空白溶液中鎘含量的測(cè)定值（μg/L），V為樣品消化液定容總體積（mL），m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2 發(fā)酵液中微生物種群組成分析 取3 mL 發(fā)酵液于離心管中，離心后棄上清液濃縮至1 mL。采用FastDNA? Spin Kit for Soil DNA 提 取 試 劑 盒（MP，美國(guó)）提取發(fā)酵液DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA 質(zhì)量，檢驗(yàn)合格后用于發(fā)酵液微生物種群組成分析。采用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）以 及806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）為：10 μmol/L 引 物 各2 μL，2×PCR mix（Takara）25 μL，DNA 模板（20 ng/μL）2 μL，無(wú)菌水19 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃，2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建Miseq 文庫(kù)，送至Illumina Miseq PE300 平臺(tái)（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 發(fā)酵液中微生物的分離鑒定 取第3 d 的發(fā)酵液（D3），進(jìn)行梯度稀釋，分別吸取1×10-4和1×10-5稀釋度樣品100 μL 涂布于MRS 和LB 固體培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。于35 ℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～5 d。觀察并挑選外觀形態(tài)特征不同的單菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線分離，經(jīng)過(guò)2～3 次劃線純化后得到單一菌株，對(duì)分離出的單菌落進(jìn)行菌體形態(tài)觀察，并對(duì)形態(tài)特征有明顯差異的菌株進(jìn)行16S rRNA 基因序列分析。

16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增和測(cè)序引物采用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 或8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），25 μL 菌落PCR 反應(yīng)體系：2×Easy Taq Master Mix 12.5 μL（含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、緩沖液、MgCl2、溴酚藍(lán)），10 μmol/L 引物各1 μL，ddH2O 10.5 μL，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落到反應(yīng)體系中。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢驗(yàn)合格后將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。通過(guò)NCBI-BLAST（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov），將 獲得的16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)獲取目標(biāo)菌株的分類學(xué)信息。

1.2.4 菌株降鎘效率試驗(yàn) 制備接種菌液：從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種至裝有20 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基的50 mL 錐形瓶中，設(shè)置不接種對(duì)照，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)6～7 h 至液體培養(yǎng)基渾濁，離心后去上清液，將菌體沉淀用無(wú)菌水洗滌兩次，最后用無(wú)菌水重懸菌體。利用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定調(diào)整菌液OD600值為0.8，即為接種菌液。

發(fā)酵體系：在潔凈工作臺(tái)中，將50 g 晚秈米加入250 mL 錐形瓶中，再加入75 mL 滅菌的去離子水，按1%接種量接入菌液（即0.75 mL），對(duì)照組加入等量滅菌的去離子水，封瓶膜封口。體系中料液比（g/mL）為1.0:1.5。在整米發(fā)酵與大米粉發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)中，考慮到大米粉的吸水性較高，發(fā)酵體系料液比（米水比例（g/mL））調(diào)整為1:3，具體如下：將50 g 粉碎過(guò)篩的晚秈米粉或整米分別裝入滅菌的250 mL 錐形瓶，加入150 mL 滅菌的去離子水，按1%接種量接入菌液（即1.5 mL）。對(duì)照組加入等量滅菌的去離子水。

1）單菌株降鎘效率試驗(yàn)。初步排重后選取不同菌種進(jìn)行單菌株降鎘效率的試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照。每個(gè)菌株的發(fā)酵體系設(shè)置三次重復(fù)，置于35 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。采集發(fā)酵后的米樣測(cè)定其鎘含量。

2）高效菌株組合降鎘效率試驗(yàn)。選取單菌株降鎘試驗(yàn)中降鎘效率較高的菌株，進(jìn)行兩株菌、三株菌、四株菌的組合發(fā)酵試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照，不同組合的發(fā)酵體系中總的菌液接種量為1%，多菌株接種菌液中各菌株所占的比例相等。每個(gè)組合的發(fā)酵體系設(shè)置三次重復(fù)。置于35 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。處理發(fā)酵后的米樣后測(cè)定其鎘含量。

發(fā)酵后米樣的處理：發(fā)酵結(jié)束后傾倒發(fā)酵液，在錐形瓶中加入300 mL 左右的去離子水將米樣洗滌四次。洗滌后的米樣置于培養(yǎng)皿上，在70 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干。烘干后的米樣一半保存于自封袋中，另一半用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)35 目篩后保存于自封袋中。粉碎的米樣用于后續(xù)鎘含量的測(cè)定（參考GB5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》中的干試樣制備）。

降鎘效率的計(jì)算公式為：

式中：W表示降鎘效率（%），W0是原料大米中的鎘含量，W1是發(fā)酵后大米的鎘含量。

1.2.5 探究發(fā)酵降鎘的微生物機(jī)理 選擇L4 和L4+L8 兩種菌液分別接種至整米發(fā)酵體系和大米粉發(fā)酵體系中，控制總接種量為1%，探究大米形態(tài)對(duì)降鎘效率的影響。

收集發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，對(duì)發(fā)酵液中pH 值與乳酸含量進(jìn)行測(cè)定。pH 值的測(cè)定：使用pH 計(jì)對(duì)發(fā)酵液的pH 值進(jìn)行測(cè)定。乳酸含量的測(cè)定：發(fā)酵液通過(guò)一次性細(xì)菌過(guò)濾器（0.22 μm）過(guò)濾后注入上樣瓶中，使用氣相色譜儀7890A（美國(guó)安捷倫科技有限公司）進(jìn)行檢測(cè)。探究發(fā)酵液pH 值、乳酸含量與降鎘效率的關(guān)系。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Excel 和Origin 軟件進(jìn)行繪圖。顯著性差異采用SAS 9.4 軟件進(jìn)行分析，采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan 法進(jìn)行方差分析和多重比較。測(cè)序獲得的序列用MEGA7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。所有分離菌株的16S rRNA 基因序列均已提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得了相應(yīng)的序列登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程米樣及米粉產(chǎn)品鎬含量變化

在常德米粉加工過(guò)程中，稻米會(huì)在發(fā)酵池中加水浸泡靜置4～5 d，且發(fā)酵液（前一批發(fā)酵產(chǎn)物）的接種是米粉制作不可或缺的步驟。通過(guò)采集測(cè)試分析米粉廠中不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的米樣以及成品米粉中的鎘含量發(fā)現(xiàn)（圖1），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，米樣中的鎘含量逐漸降低。其中從第1 d 到第3 d，米樣中的鎘含量降低了約37%；到第4 d，米樣中鎘含量降低了近80%，降幅可達(dá)0.25 mg/kg，稻米中殘留的鎘含量?jī)H為0.06 mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.20 mg/kg。將發(fā)酵過(guò)的稻米加工成米粉的過(guò)程中，鎘含量也有所下降，進(jìn)一步降至0.04 mg/kg?？梢?jiàn)，發(fā)酵過(guò)程對(duì)稻米中鎘含量的降低發(fā)揮了巨大作用，因此推測(cè)，發(fā)酵液中的微生物在稻米降鎘過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

圖1 米粉廠不同發(fā)酵時(shí)間和成品樣品中的鎬含量Fig. 1 Cadmium content in the rice noodles and rice samples during the fermentation process

2.2 發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)演變及菌株分離與分子鑒定

通過(guò)分析不同發(fā)酵時(shí)間大米發(fā)酵液中細(xì)菌的種群組成結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)（圖2），稻米發(fā)酵前三天（D1，D2，D3）的發(fā)酵液細(xì)菌屬水平組成結(jié)構(gòu)比較相似，乳桿菌屬的物種總豐度占比幾乎達(dá)100%，為大米發(fā)酵液中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。但第4 d（D4）的發(fā)酵液的細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，主要表現(xiàn)在乳桿菌屬的相對(duì)豐度急劇下降至9.08%，而乳球菌（Lactococcus）、叢毛單胞菌（Comamonas）迅速增長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度分別占總豐度的33.04%和31.08%。

圖2 不同時(shí)間發(fā)酵液中種和屬分類水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征Fig. 2 Characteristics of bacterial community structure at the level of species and genus in diff erent samples

進(jìn)一步從種水平上分析發(fā)現(xiàn)，前三天發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌種主要是一些未分類的乳桿菌（unclassif iedLactobacillus）、黏膜乳桿菌（Lactobacillus mucosaeLM1）、解 淀 粉 乳 桿 菌（Lactobacillusamyloνorus,Lactobacillusamylolyticus）、唾液乳桿菌（Lactobacillus saliνarius）等。第1 d（D1）發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌種為未分類的乳桿菌和黏膜乳桿菌，其占比約為90%；第2 d（D2）發(fā)酵液中未分類的乳桿菌和黏膜乳桿菌占比分別下降20%和10%左右，解淀粉乳桿菌所占比例較第1 d 提高了20%左右；第3 d（D3）發(fā)酵液中未分類的乳桿菌和黏膜乳桿菌的占比較第2 d 有所提高但仍低于第1 d，而解淀粉乳桿菌含量相對(duì)減少。然而在第4 d（D4）的發(fā)酵液中乳桿菌屬的未分類的乳桿菌、解淀粉乳桿菌和黏膜乳桿菌等急劇減少，取而代之出現(xiàn)大量乳球菌（Comamonastestosteroni）和叢毛單胞菌（Comamonas kerstersii）以及穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、庫(kù)爾特氏桿菌屬（Kurthia）、莫氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii）等致病菌或腐敗菌，這些菌成為優(yōu)勢(shì)類群。此結(jié)果說(shuō)明，在米粉生產(chǎn)發(fā)酵體系中，前三天的發(fā)酵狀況趨于穩(wěn)定，菌種組成穩(wěn)定，乳桿菌為主要的發(fā)酵菌種，但在第4 d 時(shí)致病菌或腐敗菌大量出現(xiàn)，如果繼續(xù)發(fā)酵將可能影響發(fā)酵效果和米粉品質(zhì)。結(jié)合2.1 中的結(jié)果，推測(cè)前三天發(fā)酵液中微生物即乳桿菌，在降鎘效應(yīng)中發(fā)揮了主要作用。

2.3 大米發(fā)酵液中微生物的分離鑒定

為進(jìn)一步明確發(fā)酵液中微生物是否具有降鎘功能，選取第3 d 的發(fā)酵液進(jìn)行了微生物菌種的分離鑒定。結(jié)果顯示，從發(fā)酵液（D3）中共分離出58 株可培養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA 分子鑒定，主要分布在4 個(gè)不同的細(xì)菌屬，9 個(gè)細(xì)菌種。其中乳桿菌屬Lactobacillus（63.79%）所占比例最高，與上文推測(cè)一致，其次是片球菌屬Pediococcus（25.86%）和微球菌屬M(fèi)icrococcus（8.62%），僅分離出一株芽 孢 桿 菌 屬Bacillus菌 株：L8（Bacillus subtilis）。初步排重以及排除一個(gè)不易培養(yǎng)的菌種粘膜乳桿菌（L. mucosae）后，選取以下8 株細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)：發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）L4、德氏乳桿菌（L. delbrueckiisubsp.）M30、乳酸片球菌（P.acidilactici）P1、藤黃微球菌（M. luteus）L19、云南微球菌（M. yunnanensis）L20、蘆薈微球菌（M.aloeνerae）L24、微球菌（Micrococcussp.）L25、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L8（表1）。所選菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖3 所示。

表1 代表菌株的基本信息Table 1 Related information of the representative isolated strains

圖3 基于代表菌株的16S rRNA 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic (original) tree based on 16S rRNA gene sequence of representative isolated strains

2.4 分離菌株的降鎬效果

2.4.1 單菌降鎘效果 通過(guò)分離菌株對(duì)重度鎘超標(biāo)稻米的降鎘試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與不接種對(duì)照相比，發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸片球菌、芽孢桿菌均表現(xiàn)出不同程度的降鎘能力（圖4）。其中，乳酸片球菌P1 菌株的降鎘能力最高，發(fā)酵48 h 的降鎘量達(dá)到0.55 mg/kg。發(fā)酵乳桿菌L4 的降鎘能力與P1 相近，為0.54 mg/kg，其次是芽孢桿菌L8 和德氏乳桿菌M30，其降鎘量分別為0.34 和0.33 mg/kg。相比之下，其他菌株的48 h 降鎘能力均在0.15 mg/kg 以下，且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，來(lái)源于發(fā)酵液中的乳酸菌確實(shí)有較強(qiáng)的降鎘作用，但因本試驗(yàn)使用的稻米為重度超標(biāo)的晚秈米（1.05 mg/kg），導(dǎo)致其降鎘效率分別僅為51.75%、51.08%、31.83%和30.90%，其超高的鎘含量和致密的種質(zhì)結(jié)構(gòu)可能是影響降鎘效率的重要因素。

圖4 8 株代表菌株的降鎬量和降鎬效率Fig. 4 The cadmium removal capacity and effi ciency of the representative strains

2.4.2 復(fù)合菌株降鎘效果 由于以往研究顯示，多種功能互補(bǔ)菌群進(jìn)行組合有助于提升發(fā)酵品質(zhì)，如德氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌具有多種互補(bǔ)益生性能，被廣泛應(yīng)用在多種發(fā)酵工業(yè)和食品行業(yè)[27-28]。故本研究選取乳酸片球菌P1、發(fā)酵乳桿菌L4、德氏乳桿菌M30、芽孢桿菌L8 四株高效降鎘菌株進(jìn)行組合發(fā)酵試驗(yàn)。

結(jié)果顯示（圖5），與單菌株發(fā)酵效果相比，在總接種量一致的條件下，雙菌組合發(fā)酵的降鎘效率并未顯著提升。其中L4+L8 的降鎘效率顯著高于其他雙菌組合，48 h 內(nèi)可去除晚秈米中0.46 mg/kg的鎘，降鎘效率達(dá)到43.59%，其次為L(zhǎng)4+P1 組合，其降鎘量和降鎘效率分別為0.42 mg/kg 和39.45%，但其降鎘能力均低于L4 或P1 單菌株。L8+M30 的降鎘能力最差，48 h 鎘去除量?jī)H為0.19 mg/kg，降鎘效率為17.82%。

圖5 不同菌種組合的降鎬量和降鎬效率Fig. 5 The cadmium removal capacity and effi ciency of the diff erent strains’ combinations

在雙菌組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行三菌或四菌組合發(fā)酵，并未提升發(fā)酵體系的降鎘效率，甚至有所降低（圖5）。例如，與L4 和L8 雙菌組合相比，L4+L8+M30 的降鎘效果顯著降低（P＜0.05），鎘去除量為0.41 mg/kg，降鎘效率為38.64%。L4+P1雙菌組合改為L(zhǎng)4+P1+M30 三菌組合或四菌組合后，其降鎘能力也發(fā)生顯著下降（P＜0.05）。但將L8+M30 組合轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)8+M30+P1 組合后，其降鎘能力從0.19 mg/kg 顯著提高到0.40 mg/kg，漲幅達(dá)到1.12 倍，說(shuō)明在低活性發(fā)酵體系中添加功能活性較強(qiáng)的菌株可有效提高發(fā)酵體系降鎘功能。

其余三菌或四菌組合與雙菌組合的降鎘效率較為接近，降鎘量均在0.35～0.40 mg/kg 之間，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，在接種總量一定的發(fā)酵體系中，降鎘功能主要以高活性菌株為主導(dǎo)，當(dāng)以相對(duì)低活性菌株替換部分高活性菌株生態(tài)位時(shí)，降鎘能力也會(huì)有所損失。因此，在后續(xù)混菌組合發(fā)酵試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)考慮菌種比例合理性，在保障高活性菌種接種量的基礎(chǔ)上添加無(wú)拮抗作用的功能輔助菌。

2.4.3 米粉發(fā)酵過(guò)程降鎘機(jī)制探索 由于已有的研究表明，微生物發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸和蛋白酶的產(chǎn)生可能在蛋白結(jié)合態(tài)金屬消解過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此，本研究選取對(duì)照組與試驗(yàn)組（L4 單菌株、L4+L8 組合），探究其發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液的pH 值與乳酸含量差異，結(jié)果表明（表2），發(fā)酵結(jié)束時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組均為酸性環(huán)境，但與對(duì)照組相比，L4 和L4+L8 組合處理發(fā)酵液pH 值分別顯著降低了0.60和0.53 個(gè)單位（P＜0.05）。試驗(yàn)組L4 和L4+L8 組合發(fā)酵液中的乳酸含量也顯著增加，分別達(dá)到對(duì)照組的1.53 倍和1.68 倍（P＜0.05），這與其發(fā)酵液中低pH 值相符。由此我們可以推測(cè)，大米發(fā)酵液中微生物產(chǎn)生的有機(jī)酸等物質(zhì)促進(jìn)了鎘結(jié)合蛋白質(zhì)的溶出，從而降低稻米中的鎘含量。

表2 不同處理發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵液pH 值和乳酸含量及降鎬效率和降鎬量Table 2 The pH and lactic acid content of the rice fermentation broth of the diff erent treatments andthe cadmium removal capacity and effi ciency

在本研究的稻米模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，微生物菌種添加并未將重度鎘污染的晚秈米（鎘含量約為1.05 mg/kg）的鎘含量降至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以下，推測(cè)原因可能是其超高的鎘含量和致密的種質(zhì)結(jié)構(gòu)影響了降鎘效率。為進(jìn)一步證實(shí)這一推測(cè)，本研究采用大米粉（粉碎的鎘超標(biāo)大米）為試驗(yàn)材料，對(duì)比分析了對(duì)照組與試驗(yàn)組（L4 單菌株、L4+L8 組合）的降鎘能力、發(fā)酵液pH 和乳酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與整米處理相比，采用大米粉為原料可大幅提高降鎘效率，其中L4 和L4+L8 處理的降鎘量分別提高到0.64 和0.56 mg/kg，降鎘效率分別達(dá)到67.14%和59.10%，顯著高于稻米處理（P＜0.05）。與此同時(shí)，其發(fā)酵液的pH 下降幅度更大，分別比對(duì)照下降了1.52 和1.54個(gè)單位（P＜0.05），而乳酸含量分別達(dá)到了對(duì)照組的6.55 倍和7.11 倍。由此可見(jiàn)，在鎘超標(biāo)大米加工利用過(guò)程中，粉碎處理可進(jìn)一步促進(jìn)稻米中鎘的溶出。

3 討論

3.1 大米自然發(fā)酵液中的降鎬微生物及其降鎬能力

本文通過(guò)對(duì)大米發(fā)酵液樣本中的細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序以及微生物分離鑒定，結(jié)果表明，乳桿菌為發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種。這與前期稻米等糧食作物發(fā)酵過(guò)程微生物菌群組成的研究發(fā)現(xiàn)基本一致[29-30]，認(rèn)為植物乳桿菌為大米發(fā)酵液的主要細(xì)菌物種，其中的大多數(shù)菌種具有消化淀粉、糖、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的能力[29]。由于鎘元素在大米的各個(gè)部位都有分布，因此這些菌種可能也具有一定的降鎘能力。在本研究的降鎘試驗(yàn)中，乳酸片球菌P1、發(fā)酵乳桿菌L4、德氏乳桿菌M30、芽孢桿菌L8 均表現(xiàn)出不同程度的降鎘效果。乳酸菌具有較好的降鎘效果，這與前期初步研究結(jié)果一致[21-24]。而在其他領(lǐng)域的降鎘過(guò)程中，芽孢桿菌也是一種常用的降鎘微生物。例如，在重金屬污染的廢水中，芽孢桿菌與生物炭共同作用對(duì)鎘的去除有良好的效果[17,31]；亞馬遜本地的芽孢桿菌可降低可可植株中的鎘積累[32]，同理，在其他地區(qū)植株的根際也可能存在可以降低植株鎘積累的菌株。在本研究中，也分離到有降鎘作用的芽孢桿菌。

通過(guò)分析各菌株的降鎘能力發(fā)現(xiàn)，單菌株在48 h內(nèi)的降鎘量高達(dá)0.55 mg/kg，但因本試驗(yàn)使用的稻米為重度超標(biāo)的晚秈米（1.05 mg/kg），導(dǎo)致其降鎘效率在60%以下，未能將其鎘含量降到國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)以下。盡管如此，由于我國(guó)鎘超標(biāo)大米中鎘含量范圍普遍在0.33～0.69 mg/kg，大部分屬輕度或中度鎘超標(biāo)，因此該系列菌株在我國(guó)“鎘大米”安全利用中仍具有巨大的應(yīng)用前景。鑒于以往研究表明，多菌株混合發(fā)酵有助于提升發(fā)酵效率[33]，因此本研究進(jìn)一步分析了多菌株發(fā)酵體系對(duì)稻米鎘含量的影響。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌種等比例組合發(fā)酵似乎沒(méi)有顯示出菌種多樣性的優(yōu)勢(shì)，其降鎘效率甚至低于單菌或雙菌發(fā)酵，這可能與功能菌接種比例和總量有關(guān)。本研究所有處理接種總量均為1%，當(dāng)發(fā)酵體系中部分高活性的菌株（如L4 和P1）被替換為相對(duì)低活性的菌株（如L8 和M30）時(shí)，其發(fā)酵體系的降鎘能力明顯下降。在同一發(fā)酵體系中，不同菌種對(duì)資源空間的競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用可能是影響降鎘效率的重要原因[34]。李蕓[26]的研究也發(fā)現(xiàn)混菌培養(yǎng)時(shí)兩種菌均未達(dá)到單菌培養(yǎng)時(shí)的最大生物量。在混合菌發(fā)酵體系中菌種間互作機(jī)理及其對(duì)發(fā)酵體系產(chǎn)生的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。基于上述結(jié)果，在后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)中，可考慮在優(yōu)先保障高效菌株接種量的基礎(chǔ)上添加功能互補(bǔ)型菌株，以進(jìn)一步強(qiáng)化發(fā)酵體系的降鎘功能，提高組合發(fā)酵的降鎘效率從而應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

3.2 米粉發(fā)酵過(guò)程降鎬機(jī)制探索

大量研究表明，部分鎘元素在稻米中的存在形式是蛋白結(jié)合態(tài)[13,33,35]，發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸片球菌等均會(huì)分泌大量乳酸[28,36-37]，乳酸可以通過(guò)其ɑ-羥基結(jié)構(gòu)的羧基與肽鏈上的基團(tuán)形成氫鍵促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出[21-22,38]，從而表現(xiàn)出降鎘作用。而枯草芽孢桿菌往往具有產(chǎn)蛋白酶性能[27,39]，其分泌的蛋白酶直接作用于稻米蛋白，使得枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出降鎘作用。本研究通過(guò)對(duì)比分析對(duì)照組與試驗(yàn)組（L4 單菌株、L4+L8 組合）發(fā)酵液的pH值與乳酸含量差異發(fā)現(xiàn)，L4 和L4+L8 組合處理均顯著降低了發(fā)酵液pH 值，同時(shí)顯著提高了其乳酸含量，進(jìn)一步證實(shí)了大米發(fā)酵液中微生物產(chǎn)生的有機(jī)酸和蛋白酶等使發(fā)酵體系處于較低pH，促進(jìn)了鎘結(jié)合蛋白質(zhì)的溶出，使米粉生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程表現(xiàn)出降鎘效應(yīng)。這為高效降鎘菌株的開(kāi)發(fā)提供了一種思路，可篩選一些性能優(yōu)良的工業(yè)微生物如高產(chǎn)酸菌、高產(chǎn)蛋白酶菌等運(yùn)用到食品降鎘行業(yè)，從而進(jìn)一步豐富降鎘功能微生物資源。

此外，稻米的質(zhì)地形態(tài)可能也是影響其降鎘效率的重要因素，本研究通過(guò)對(duì)比分析整米和大米粉（經(jīng)過(guò)粉碎的大米）在微生物發(fā)酵體系中的降鎘效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，采用粉碎后的稻米為原料可將發(fā)酵體系降鎘效率提升50%以上。這可能是因?yàn)榉鬯楹蟮牡久诪槲⑸锾峁┝烁嗟臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支持微生物生長(zhǎng)，同時(shí)也增加了微生物與鎘結(jié)合態(tài)蛋白的作用面積，促進(jìn)了鎘元素的游離或溶出。研究結(jié)果中大米粉發(fā)酵體系的pH 下降幅度更大，乳酸含量也顯著增加的數(shù)據(jù)可進(jìn)一步證實(shí)大米粉發(fā)酵體系中降鎘微生物活性更高。由此可見(jiàn)，在鎘超標(biāo)大米加工利用過(guò)程中，粉碎可進(jìn)一步提高功能微生物的發(fā)酵活性，加速稻米中鎘的溶出。

4 結(jié)論

本研究以鮮濕米粉加工過(guò)程中的發(fā)酵液為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液微生物高通量測(cè)序、功能微生物的分離培養(yǎng)及降鎘能力試驗(yàn)等，研究了米粉生產(chǎn)過(guò)程中的降鎘作用及其微生物學(xué)機(jī)理，結(jié)論如下：

1）鮮濕米粉加工工藝中的發(fā)酵過(guò)程可有效降低稻米鎘含量，而發(fā)酵液中的微生物起關(guān)鍵作用。第1～3 d 的發(fā)酵液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，均以乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，第4 d 的發(fā)酵液中出現(xiàn)一些致病菌或腐生菌，因此實(shí)際生產(chǎn)中稻米最佳發(fā)酵時(shí)間以三天為宜。

2）通過(guò)對(duì)稻米發(fā)酵液中微生物的分離培養(yǎng)和降鎘能力試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中分離的發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸片球菌和枯草芽孢桿菌等菌株均表現(xiàn)出較好的降鎘效果，48 h 內(nèi)的最高降鎘量可達(dá)0.55 mg/kg，在我國(guó)“鎘大米”安全利用中有巨大的潛力。其中發(fā)酵乳桿菌和乳酸片球菌的降鎘效率顯著高于德氏乳桿菌和枯草芽孢桿菌。菌種組合試驗(yàn)表明，除L4+L8（發(fā)酵乳桿菌+芽孢桿菌）組合外，其他組合均未表現(xiàn)出比單菌更高的降鎘效率，在后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)中可優(yōu)化菌種配比，保障高效功能菌株接種量基礎(chǔ)上添加適量功能輔助菌，以進(jìn)一步強(qiáng)化發(fā)酵體系的降鎘功能。

3）菌種添加使發(fā)酵液pH 顯著降低、乳酸含量升高，進(jìn)而促進(jìn)鎘結(jié)合態(tài)蛋白分解，可能是米粉加工過(guò)程中稻米鎘含量降低的主要作用機(jī)制。稻米粉碎可提高功能微生物活性并增加作用面積，大幅提升發(fā)酵體系降鎘效率。該項(xiàng)研究對(duì)鎘超標(biāo)大米安全利用具有重要的實(shí)踐意義，并提供了有效的降鎘微生物菌種資源。