甜瓜新鐮刀菌果腐病病原菌Fusarium asiaticum的生物學(xué)特性研究及抗病品種篩選

郝芳敏 臧全宇 丁偉紅 馬二磊 黃蕓萍 王毓洪

摘 ? ?要：由鐮刀菌屬引起的甜瓜果腐病是全球甜瓜生產(chǎn)的重要真菌性病害之一，2020年從浙江寧海發(fā)病甜瓜上分離獲得一株亞洲鐮刀菌（Fusarium asiaticum）Fa-25，可引起浙江省的甜瓜果腐病，為明確該亞洲鐮刀菌的生物學(xué)特性，開展Fa-25的最適生長條件和致病力的探究。結(jié)果表明，亞洲鐮刀菌Fa-25的最適生長溫度為28 ℃，比較適合的碳源為葡萄糖和乳糖，比較適合的氮源為KNO3、甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸，尿素則不利于生長。該病原菌喜光，菌絲致死溫度為35 ℃，最適的pH為6。利用亞洲鐮刀菌Fa-25對瓜類果實(shí)進(jìn)行刺傷接種，篩選到柏格、HXC12和P80這3個較抗的甜瓜材料。此外，F(xiàn)a-25還可對西瓜和黃瓜產(chǎn)生致病力。

關(guān)鍵詞：甜瓜；果腐病；亞洲鐮刀菌；生物學(xué)特性；刺傷接種

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）06-016-07

Biological characteristics of a new pathogen Fusarium asiaticum causing melon fruit Fusarium rot and selection of disease-resistant varieties

HAO Fangmin， ZANG Quanyu， DING Weihong， MA Erlei， HUANG Yunping， WANG Yuhong

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）

Abstract： Melon fruit rot caused by Fusarium is one of the most important fungal diseases worldwide. In this study， a strain of Fusarium asiaticum Fa-25 was isolated from melon infected in Ninghai in 2020， which can cause melon fruit rot in Zhejiang Province， we studied the biological characteristics of this F. asiaticum Fa-25， the result shows that Fa-25 is suitable for cultivation in light environment， the optimum culture temperature of F. asiaticum was 28 ℃， the lethal temperature was 35 ℃， and pH 6 is the best. Glucose， lactose and raffinose were the best carbon sources， KNO3， glycine， leucine and alanine could be used as nitrogen sources， while urea was not conducive to growth. Fa-25 was inoculated by stab wound， and three resistant muskmelon materials were screened， including Berg， HXC12 and P80. In addition， Fa-25 could also cause virulence to watermelons and cucumbers.

Key words： Melon; Fruit rot; Fusarium asiaticum; Biological characteristics; Stab wound inoculation

甜瓜是全球性的重要園藝作物，在全球的栽培選育過程中，面臨著枯萎病、蔓枯病、白粉病、霜霉病、根腐病和細(xì)菌性果斑病等多種病害的威脅，嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中細(xì)菌性果斑病可危害甜瓜果實(shí)，是一種細(xì)菌性病害，發(fā)病初期病斑只存在于果實(shí)表面，隨后病菌開始向果實(shí)內(nèi)部侵染，造成果肉腐爛[1-2]。由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）引起的甜瓜果腐病是全球甜瓜生產(chǎn)的重要真菌性病害之一。多危害半成熟和成熟的果實(shí)，發(fā)病初期果實(shí)呈水漬狀病斑，后期內(nèi)部開始腐爛，病部長出白色或粉紅色霉層[3-4]。該病害初期不易被發(fā)現(xiàn)，不能夠及時進(jìn)行防治，一旦發(fā)生，果實(shí)出現(xiàn)腐爛，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量，對整個甜瓜產(chǎn)業(yè)造成極大的損失。同時鐮刀菌可分泌多種毒素，人畜誤食會中毒，因此該病一旦發(fā)生就是毀滅性的。不同品種間抗性存在差異，選育抗病品種是防治甜瓜果腐病最主要的方式之一。

筆者在2019年陸續(xù)在浙江寧海、寧波本地等多個田塊鑒定到由亞洲鐮刀菌（F．a(chǎn)siaticum）引起的甜瓜果腐病，均發(fā)生在甜瓜成熟后期，發(fā)病率高達(dá)70%，部分田塊甚至出現(xiàn)絕產(chǎn)，嚴(yán)重制約甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，這也是全球范圍內(nèi)首次報(bào)道由亞洲鐮刀菌（F．a(chǎn)siaticum）引起的甜瓜果腐病[5]。由于鐮刀菌普遍存在于土壤中，而甜瓜的種植，大部分采用爬地栽培，果實(shí)與土壤的接觸不可避免，另一方面，網(wǎng)紋甜瓜在網(wǎng)紋形成時，會出現(xiàn)大量裂瓜現(xiàn)象，很容易被鐮刀菌感染。引起甜瓜果腐病的鐮刀菌種類很多，包括木賊鐮刀菌（F. equiseti）、磚紅鐮刀菌（F. lateritium）、變紅鐮刀菌（F. incarnatum）、F. falciforme，F(xiàn). sulawesiense、F. pernambucanum、F. kalimantanense、F. nanum和F. luffae等[4，6-8]。因此筆者開展亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）的生物學(xué)特性研究以及篩選抗該病害的甜瓜品種，以期為該病害發(fā)生規(guī)律的研究及其防控提供理論依據(jù)，有效減少甜瓜果腐病的發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收，對甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到技術(shù)支撐作用。

1 材料方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

供試病原菌：亞洲鐮刀菌Fa-25于2020年從浙江省寧海市腐爛的甜瓜果實(shí)表面上分離獲得[5]，在 PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，作為供試菌株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，121 ℃滅菌 20 min。察式培養(yǎng)基（Czapeks medium）：硝酸鈉（NaNO3） 3.00 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1.00 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0.50 g、 氯化鉀（KCl） 0.50 g、硫酸亞鐵（FeSO4）0.01 g、蔗糖 30.00 g、瓊脂 15.00 g ，蒸餾水 1000 mL，調(diào)pH至7.3，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 供試甜瓜、西瓜和黃瓜品種

筆者所用的厚皮甜瓜材料和品種為2926、ZHT-9、LB2、P60、P51、柏格、西州密25號、P59、CX5-5、CX5-4、P80、翠蜜6號、P42、Gsh-1和HXC12；薄皮甜瓜材料和品種為鮮脆1號、21c23、21c56、21c32、21c43、21c18、21c31、21c44、21c24和翡翠綠寶；西瓜材料和品種為東城佳美、卓越16號、22W-37、蘭芯、22XB-18、22XB-22和22XB-5；黃瓜材料和品種為HS×DM、津優(yōu)1號、土×HS、JY4×土和碧翠20。其中，柏格為上?；莺头N業(yè)有限公司提供，西州密25號為新疆葡萄瓜果開發(fā)研究中心提供，翠蜜6號、卓越16號為安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司提供，津優(yōu)1號為天津市黃瓜研究所提供，碧翠20為浙江勿忘農(nóng)種業(yè)科學(xué)研究院提供，其他品種均由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.3 生物學(xué)特性研究

設(shè)置不同溫度、不同光照時間、不同碳源、不同氮源及不同pH值對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量的影響，明確甜瓜果腐病病原菌亞洲鐮刀菌Fa-25的生物學(xué)特性。

1.3.1 溫度對Fa-25生長速度和產(chǎn)孢量的影響 所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，設(shè)置5、15、20、25、28、30、35 ℃共7個溫度處理并于黑暗中培養(yǎng)。

1.3.2 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖用等質(zhì)量的蔗糖、乳糖、木糖、菊糖、棉子糖、可溶性淀粉等不同碳源替換，制成不同碳源的固體培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)。

1.3.3 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 察式培養(yǎng)基中的硝酸鈉用等量的尿素、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸和硝酸鉀等替換，制成不同氮源的固體培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)。

1.3.4 不同光照對病原菌菌絲生長的影響 所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，分別于光照24 h·d-1、黑暗24 h·d-1、光照12 h·d-1和黑暗12 h·d-1進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.5 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 對PDA培養(yǎng)基用PBS緩沖液設(shè)定 pH為5、6、8和10共4個處理，制成不同pH的固體培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)。

生長速度的測定：用滅菌的打孔器（6 mm）取菌餅，分別于上述條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)，每個重復(fù)5皿，十字交叉法測量菌落直徑。菌絲生長速度=（48 h所測病斑直徑-24 h所測病斑直徑）/2。

1.4 抗病品種的篩選

將供試菌株亞洲鐮刀菌Fa-25置于PDA平板上于28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，用滅菌的打孔器（直徑6 mm）在供試菌株菌落邊緣打取菌塊，用消毒的牙簽在果實(shí)（厚皮甜瓜，薄皮甜瓜、西瓜，黃瓜）上刺傷，并將菌塊接種到果實(shí)上，然后放置于鋪有濕潤吸水紙的塑料盆中，不含有菌絲的瓊脂塊接種作為CK，3次重復(fù)，每個重復(fù)3個果實(shí)，每個果實(shí)上接種1個菌絲塊。用保鮮膜覆蓋接種盆，將接種盤置于28 ℃下培養(yǎng)，8 d后測量果實(shí)接種塊周圍的病斑直徑，采用軟件graphpad prism 9進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌生物學(xué)特性測定

2.1.1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 由圖1可知，亞洲鐮刀菌Fa-25的氣生菌絲為白色，生長致密，菌落邊緣較整齊，背面為粉紅色（圖1-a）。菌絲適宜的生長溫度為20～28 ℃，以28 ℃最適，生長速度為10.56 mm·d-1，在30 ℃條件下可以緩慢生長，而在35 ℃培養(yǎng)時，菌絲無法生長（圖1-b）。

2.1.2 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 由圖2可知，F(xiàn)a-25可在供試的7種碳源進(jìn)行培養(yǎng)，可利用多種碳源促進(jìn)生長（圖2-a），其中在含有葡萄糖（11.85 mm·d-1）和乳糖（11.05 mm·d-1）的培養(yǎng)基上生長差異不顯著，但是在含有蔗糖、木糖、菊糖、可溶性淀粉和棉子糖的培養(yǎng)基上的生長速度極顯著低于在含有葡萄糖的培養(yǎng)基（圖2-b）。

2.1.3 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 由圖2可知，F(xiàn)a-25可在供試的5種氮源進(jìn)行培養(yǎng)，可利用多種氮源促進(jìn)生長（圖2-a），在含有KNO3、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸這4種氮源的培養(yǎng)基上生長速度無顯著性差異，在含有尿素的培養(yǎng)基上生長速度顯著低于上述氮源培養(yǎng)基（圖2-c）。

2.1.4 不同光照對病原菌菌絲生長的影響 由圖3可知，F(xiàn)a-25適宜在全光照的條件下培養(yǎng)，生長速度最快，極顯著高于在全黑暗和12 h 光照/12 h 黑暗的條件下培養(yǎng)（圖3）。

2.1.5 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 由圖4可知，F(xiàn)a-25在pH為6的環(huán)境下培養(yǎng)生長速度最快，生長速度為10.81 mm·d-1，在pH為10的條件下極顯著降低，降低到2.00 mm·d-1，菌落生長緩慢，邊緣不規(guī)則（圖4）。

2.2 抗病品種的篩選

采用刺傷接種的方法，對15種厚皮甜瓜品種和材料進(jìn)行致病力的測定，結(jié)果表明Fa-25在柏格、HXC12和P80這3個材料和品種上致病力較弱，接種7 d后，病斑直徑均小于1.30 cm（圖5）；對10個薄皮甜瓜材料進(jìn)行接種，致病力均比較強(qiáng)，無抗病品種（圖6）；Fa-25對7個西瓜品種和材料進(jìn)行接種，均可發(fā)病，對東城佳美和蘭芯的致病力較弱（圖7）；對5種黃瓜品種和材料進(jìn)行接種，均可發(fā)病，在土×HS、JY4×土這2個材料上發(fā)病較弱（圖8）。

3 討論與結(jié)論

前人研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬真菌寄主范圍廣泛，可引起包括南瓜[10]、香蕉[11]、荔枝[12]、西瓜[13]、黃瓜[14]、火龍果[15]、杧果[16]、柑橘[17]等作物的果腐病發(fā)生。在我國北至黑龍江省，西至甘肅省，東至浙江省均有由不同鐮刀菌引起的甜瓜果腐病發(fā)生[4-6，18]。該病害多危害半成熟和成熟的果實(shí)，發(fā)病初期果實(shí)呈水漬狀病斑，后期內(nèi)部開始腐爛，病部長出白色或粉紅色霉層。初期不易被發(fā)現(xiàn)，由于防治不及時和沒有引起足夠的重視，在病害發(fā)生后，已經(jīng)無法控制，所以預(yù)防非常重要。而選育抗病品種是控制甜瓜果腐病這一病害最有效的途徑之一。加強(qiáng)田間管理，選擇適宜的栽培管理模式對病害的防控有積極的指導(dǎo)意義。

筆者針對浙江省新發(fā)現(xiàn)的由亞洲鐮刀菌引起的甜瓜果腐病，開展對引起甜瓜果腐病的亞洲鐮刀菌Fa-25進(jìn)行生物學(xué)特性和致病性的研究，結(jié)果表明Fa-25喜光，最適宜的溫度為28 ℃，不耐高溫，在35 ℃時無法生長，不同于朱迎迎等[15]研究發(fā)現(xiàn)引起火龍果果腐病的單隔鐮刀菌（F. dimerum）的致死溫度為75 ℃，F(xiàn)a-25最適宜的pH為6；最適宜的碳源和氮源有多種。綜合分析表明Fa-25不耐高溫，在光照充足、弱酸和富含有機(jī)營養(yǎng)的環(huán)境有利于該菌的生長和繁殖。

由亞洲鐮刀菌引起甜瓜的果腐病是首次在世界上報(bào)道[5]，目前國內(nèi)外并沒有亞洲鐮刀菌引起瓜類果腐病的報(bào)道，但有其他鐮刀菌引起的瓜類果腐病報(bào)道。杜莉芳等[18]報(bào)道的哈密瓜果腐病是由變紅鐮刀菌ZJHM-01侵染引起的，該病原菌宿主具廣譜性，光照能促進(jìn)生長，最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7～9，最適碳源為淀粉、山梨醇和葡萄糖，最適氮源為蛋白胨和牛肉膏，但沒有測定致病力，與本研究的Fa-25的生物學(xué)特性有所差異。此外，除了鐮刀菌可引起甜瓜果腐病之外，劉志恒等[19]報(bào)道茄絲核菌（Rhizoctonia solani）在遼寧省可引起甜瓜果腐病，主要危害成熟果實(shí)，發(fā)病部位初期呈褐色，逐漸擴(kuò)展呈深褐色，從侵染中心開始逐漸外擴(kuò)，生出白色霉層，外圍呈水漬狀濕腐，濕度大時白色霉層覆滿整個病部，后期果實(shí)腐爛。無論是鐮刀菌還是茄絲核菌引起的瓜類果腐病，均為真菌性病害，發(fā)病果實(shí)從外到內(nèi)開始腐爛，不同于西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）引起的細(xì)菌性果斑病，發(fā)病果實(shí)從內(nèi)到外開始腐爛。

未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)變，選育抗病品種是我國農(nóng)業(yè)未來的發(fā)展的核心，減少甜瓜果腐病的發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收，對甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到技術(shù)支撐作用。利用Fa-25對果實(shí)進(jìn)行刺傷接種，篩選到柏格、HXC12和P80這3個較抗甜瓜果腐病的厚皮甜瓜材料，而在薄皮甜瓜材料上進(jìn)行接種，致病力均比較強(qiáng)，無抗病品種。亞洲鐮刀菌Fa-25也可對西瓜和黃瓜致病，表明亞洲鐮刀菌Fa-25的寄主范圍較為廣泛。盡管目前尚沒有亞洲鐮刀菌引起西瓜和黃瓜果腐病的報(bào)道，但由于鐮刀菌普遍存在于土壤中，在土壤中進(jìn)行傳播，因此篩選抗亞洲鐮刀菌的甜瓜、西瓜和黃瓜品種仍然非常必要，同時改善土壤連作障礙及進(jìn)行土壤消毒也可減少土壤中鐮刀菌和其他病原菌的數(shù)量，減少果腐病及其他病害的發(fā)生。

綜上，筆者通過對浙江寧海腐爛的甜瓜果實(shí)上分離的亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）Fa-25進(jìn)行生物學(xué)特性和致病力的分析，明確該亞洲鐮刀菌Fa-25的最適生長條件，F(xiàn)a-25喜光，最適生長溫度為28 ℃，比較適合的碳源為葡萄糖、乳糖和棉子糖，比較適合的氮源為KNO3、甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸，尿素則不利于生長。該病原菌菌絲致死溫度為35 ℃，最適的pH為6。利用亞洲鐮刀菌Fa-25對葫蘆科作物進(jìn)行抗病篩選，篩選到柏格、HXC12和P80這3個較抗的厚皮甜瓜材料，此外，F(xiàn)a-25還可對西瓜和黃瓜產(chǎn)生致病力，F(xiàn)a-25對東城佳美和蘭芯這2個西瓜品種的致病力較弱，對土×HS、JY4×土這2個黃瓜材料的致病力較弱。

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