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    酸體系下改良分散固相萃取用于茶葉農(nóng)殘快速檢測(cè)的前處理技術(shù)

    2023-07-03 07:02:18吳正浩鄭芹芹郝振霞王晨陳紅平魯成銀
    茶葉科學(xué) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:咖啡堿兒茶素提取液

    吳正浩,鄭芹芹,郝振霞,王晨,陳紅平,魯成銀

    1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,浙江 杭州 310008;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310008;3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(杭州),浙江 杭州 310008;4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081

    農(nóng)藥殘留是茶葉質(zhì)量安全首要關(guān)注因子,亦是阻礙我國(guó)茶葉出口貿(mào)易的主要風(fēng)險(xiǎn)因子。靈敏可靠的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)是契合檢測(cè)時(shí)效性、降低篩查成本和保障茶葉質(zhì)量安全的有力手段。酶抑制農(nóng)殘速測(cè)卡、免疫分析試紙條等農(nóng)殘快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中。但是,這些方法和產(chǎn)品在茶葉實(shí)樣檢測(cè)中往往表現(xiàn)出極高的假陽性率,嚴(yán)重限制了其在茶葉檢測(cè)中的應(yīng)用。基質(zhì)干擾是造成檢測(cè)假陽性的最主要原因。茶葉中含有豐富的茶多酚、嘌呤堿、植物色素、芳香物質(zhì)等基質(zhì)成分[1]。這些成分不僅可以改變檢測(cè)體系的顏色影響信號(hào)采集和結(jié)果辨別,更重要的是它們大多數(shù)具有生物活性,極易對(duì)快速檢測(cè)中使用的生物試劑(如膽堿酯酶、抗體等)性能產(chǎn)生影響,造成檢測(cè)失敗,嚴(yán)重影響了快速檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與有效性[2-3]。以酶抑制法為例,茶葉中大量存在的咖啡堿和茶多酚會(huì)抑制乙酰膽堿酯酶的活性,導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[4-6]。另外,沒食子酸和天冬氨酸等內(nèi)源酸性物質(zhì)通過破壞金屬粒子-抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性,導(dǎo)致膠體金免疫分析試紙條無法用于檢測(cè)茶葉樣品[7]。

    雖然目前分散固相萃取等前處理方法在茶樣的色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等儀器檢測(cè)中應(yīng)用已經(jīng)較為成熟,但是這些方法對(duì)茶樣基質(zhì)的去除率普遍較低,處理后的待測(cè)樣品中仍含有大量茶多酚、咖啡堿等基質(zhì)成分,因而無法直接應(yīng)用于對(duì)基質(zhì)敏感的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)[8]。開發(fā)一種去除效率高、選擇性好的茶葉基質(zhì)去除方法,對(duì)提高農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)結(jié)果的可靠性、保障茶葉質(zhì)量安全具有重要意義。

    前期研究發(fā)現(xiàn),咖啡堿、茶多酚和氨基酸是茶葉農(nóng)藥殘留殘快速檢測(cè)基質(zhì)干擾的最主要來源[8],特別是咖啡堿和茶多酚對(duì)快速檢測(cè)的干擾最為顯著。由于咖啡堿在水與常見有機(jī)溶劑中均易溶解,且其難以被實(shí)驗(yàn)室常見凈化材料吸附,咖啡堿干擾成為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)需要攻克的一大難題。分子印跡技術(shù)通過構(gòu)建與咖啡堿分子匹配的作用位點(diǎn),能夠一定程度上特異性吸附咖啡堿[9-10]。然而,吸附容量小、模板構(gòu)建復(fù)雜等短板因素限制了其在茶葉前處理中的應(yīng)用。聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)側(cè)鏈羰基與多酚質(zhì)子之間易成氫鍵,因而對(duì)多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的特異性吸附[11-14],是茶葉樣品前處理開發(fā)的理想吸附劑。目前茶葉中氨基酸的分離大多采用陽離子樹脂交換、超濾膜富集等方法[15],試驗(yàn)成本及操作難度相對(duì)較高。

    本研究針對(duì)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)對(duì)茶葉基質(zhì)高效去除的需求,擬根據(jù)目標(biāo)基質(zhì)成分的分子結(jié)構(gòu)開發(fā)特異性去除方法,建立一種簡(jiǎn)單、高效、高選擇性的茶葉樣品前處理方法。該方法在酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的成功應(yīng)用,將實(shí)現(xiàn)茶葉中農(nóng)藥殘留的快速、靈敏、可靠檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,咖啡堿購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司,PVPP、乙酰膽堿酯酶(AChE,電鰻魚C3389,EC 3.1.1.7)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)片劑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司,牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京寶如億生物技術(shù)有限公司,無水Na2HPO4、無水KH2PO4購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,N-丙基乙二胺硅烷(PSA)購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司,石墨化炭黑(GCB)購(gòu)自天津博納艾爾杰公司。色譜級(jí)乙酸乙酯、乙腈、甲酸、甲酸銨均購(gòu)自德國(guó)Merck 公司,NaCl 購(gòu)自浙江華東醫(yī)藥有限公司。12 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%)分別購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司、天津農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所和天津阿爾塔科技有限公司。Whatman No.1 濾紙購(gòu)自英國(guó)Maidstone 公司,高靈敏度農(nóng)殘速測(cè)卡購(gòu)自廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司,靛酚乙酸酯(IPA)根據(jù)文獻(xiàn)[16]中方法于實(shí)驗(yàn)室合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Waters 2695 高效液相色譜儀,美國(guó)Waters有限公司;API 3200 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀,美國(guó)AB SCIEX 公司;SYKNBM 氨基酸自動(dòng)分析儀 S-433D,德國(guó) Sykam 公司;ColorQube 8580 蠟印打印機(jī),日本FujiXerox有限公司;Perfection V550 Photo 掃描儀,日本EPSON 有限公司。

    1.3 茶葉樣品

    有機(jī)綠茶樣品來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 茶葉樣品前處理

    茶葉樣品經(jīng)過粉碎后,稱取0.5 g 樣品加入2.5 mL 1.5 mol·L-1H2SO4和500 mg PVPP,混勻靜置2 min 后加入2.5 mL 乙酸乙酯,渦旋2 min,以4 500 r·min-1離心5 min。取1 mL上清液加入5 mL PBS 緩沖液(400 mmol·L-1,pH 8.0)調(diào)節(jié)pH。移取0.5 mL 上清液至含有PSA、GCB 的離心管中,混勻靜置后備用。前處理過程如圖1 所示。

    圖1 前處理方法應(yīng)用于茶葉基質(zhì)成分特異性去除的方案Fig. 1 The scheme of tea matrix component removal by the established pretreatment method

    1.4.2 提取液組分測(cè)定

    采用液相色譜測(cè)定兒茶素和咖啡堿含量,色譜柱選擇C18柱。流動(dòng)相A 相為乙腈,B 相為含0.1%(V∶V)甲酸的水溶液。梯度洗脫程序:0~16.0 min,100% A;16.0~20.0 min,100%~25%A;20.0~25.0 min,25% A;25.0~25.5 min,25%~100% A。流速1 mL·min-1,進(jìn)樣體積10 μL。

    采用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定,樹脂柱選擇Na+型磺酸基強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。儀器條件如下:顯色劑為茚三酮,進(jìn)樣量10 μL,流速0.45 mL·min-1。

    1.4.3 基于微流控紙芯片(μPADs)的克百威農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法

    采用本課題組前期制備的微流控紙芯片,并用于農(nóng)殘快速檢測(cè)[17]。具體檢測(cè)方法如下:將1.10 μL 樣品溶液依次滴加在各檢測(cè)區(qū)中央,室溫條件下靜置5 min 后在相同位置滴加1.10 μL 100 U·mL-1AChE(含有0.1% BSA)。37 ℃孵育10 min 后,在芯片中央加入25 μL 3 mmol·L-1IPA 溶液,從液體進(jìn)入通道開始計(jì)時(shí),7 min后掃描并保存結(jié)果。利用Photoshop 軟件提取掃描文件中各檢測(cè)區(qū)的顏色強(qiáng)度信號(hào)。

    使用Origin 軟件的Hill 1 方程擬合紙芯片信號(hào)強(qiáng)度與樣品溶液中農(nóng)藥濃度的關(guān)系,建立對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的校正曲線,并計(jì)算半抑制濃度(IC50)。樣品回收率計(jì)算公式如下:

    式中,c1表示加標(biāo)茶樣中的農(nóng)藥檢出濃度,c0表示相應(yīng)樣品中的加標(biāo)濃度。

    1.4.4 基于速測(cè)卡的滅多威農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法

    根據(jù)高靈敏度農(nóng)藥速測(cè)卡說明書開展試驗(yàn),移取80 μL 氮吹復(fù)溶的提取液滴于白色酶片(即速測(cè)卡),將速測(cè)卡置于便捷式農(nóng)藥殘留速測(cè)儀中孵育。10 min 后對(duì)折速測(cè)卡,反應(yīng)3 min 后,根據(jù)顏色深淺判定結(jié)果。

    1.4.5 UPLC-MS/MS 條件

    色譜條件:色譜柱為 Waters ACQUITY HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。流動(dòng)相,A 相為含0.1%(V∶V)甲酸+1 mmol·L-1甲酸銨的水溶液,B 相為含0.1%(V∶V)甲酸+1 mmol·L-1甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0~1.0 min,90% A;1.0~3.0 min,90%~0% A;3.0~10.0 min,0% A;10.0~10.1 min,0%~90%A;10.1~12.0 min,90% A。流速0.25 mL·min-1,柱溫40 ℃,進(jìn)樣體積3.0 μL。質(zhì)譜條件:采用電噴霧正離子掃描方式(ESI+),氣簾氣(Curtain gas)壓力20 psi,碰撞氣(Collision gas)壓力5 psi,噴霧電壓5 500 V,離子源溫度500 ℃,霧化氣(GS1)壓力50 psi,輔助氣(GS2)壓力50 psi。碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)、定性與定量離子對(duì)等參數(shù)見表1。

    表1 12 種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件參數(shù)和LogP 值Table 1 The MS parameters and LogP of 12 pesticides

    2 結(jié)果與分析

    2.1 茶葉農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)前處理方法優(yōu)化

    2.1.1 咖啡堿的特異性去除

    咖啡堿是干擾農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)結(jié)果的主要茶葉基質(zhì)成分之一,本研究從其分子結(jié)構(gòu)特征角度入手開發(fā)特異性去除方法??Х葔A分子中存在2 個(gè)酰胺氮原子,其中1 個(gè)呈弱堿性,另1 個(gè)堿性極弱且接近弱酸性。由于弱堿性酰胺氮原子在酸性條件下易捕獲質(zhì)子而離子化,故嘗試采用酸溶液處理并結(jié)合有機(jī)溶劑浸提的方式來減少提取液中的咖啡堿含量。

    在H2SO4電離產(chǎn)生的H+作用下,咖啡堿中酰胺基團(tuán)被離子化。在水相溶液中,帶正電荷的離子型咖啡堿可在硫酸根陰離子的電荷相互作用下保持穩(wěn)定。隨著H2SO4濃度的提高,水相中咖啡堿的電離平衡逐漸向生成離子的方向移動(dòng),促使有機(jī)相中咖啡堿分子經(jīng)重新分配后進(jìn)入水相,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乙酸乙酯層中咖啡堿含量降低。在當(dāng)前提取條件(V酸液∶V乙酸乙酯=1∶1)下,與純水浸提相比,H2SO4濃度達(dá)到1.5 mol·L-1時(shí),乙酸乙酯中的咖啡堿含量下降95%以上。進(jìn)一步增加酸液濃度,咖啡堿去除率無明顯變化(圖2)??紤]到高濃度硫酸對(duì)試驗(yàn)操作的潛在風(fēng)險(xiǎn),選擇 1.5 mol·L-1H2SO4溶液作為咖啡堿去除的最佳條件。

    圖2 不同濃度H2SO4 處理下茶葉樣品中咖啡堿的去除率Fig. 2 Caffeine removal rate in tea samples after the addition of different H2SO4 concentrations

    圖3 不同提取方法對(duì)氨基酸去除效果的色譜圖Fig. 3 Chromatography of amino acid removal by different extraction methods

    2.1.2 氨基酸的特異性去除

    茶葉中普遍存在的各種氨基酸成分對(duì)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)結(jié)果的影響不可忽視。目前開發(fā)的氨基酸分離方法大多基于水相溶液[18-19],不適合直接應(yīng)用在以有機(jī)相為主的農(nóng)殘?zhí)崛l件中。本研究借助氨基酸在水相中溶解度遠(yuǎn)高于有機(jī)相的特點(diǎn),嘗試運(yùn)用2.1.1 章節(jié)中開發(fā)的酸液結(jié)合乙酸乙酯浸提的方法降低提取液中的氨基酸含量。

    取干茶樣品經(jīng)乙酸乙酯提取前后的樣品溶液,分析其氨基酸含量,結(jié)果如圖3 所示。僅用水浸提時(shí),提取液中檢測(cè)到多種氨基酸組分,其中茶氨酸含量達(dá)到142.58 mg·L-1。經(jīng)乙酸乙酯處理后,有機(jī)相中氨基酸含量在儀器檢出限以下,表明應(yīng)用前述開發(fā)的酸性水-乙酸乙酯提取方法可直接實(shí)現(xiàn)氨基酸的高效去除。

    2.1.3 茶多酚的特異性去除

    由于茶多酚與 PVPP 材料間容易形成分子間氫鍵,PVPP 可特異性去除提取液中的多酚類物質(zhì)[13-14]。本研究將PVPP 作為去除茶葉內(nèi)源性多酚的專一性吸附劑,優(yōu)化其使用量。

    試驗(yàn)中在茶葉樣品前處理中加入吸附劑,分析 PVPP 用量與不同兒茶素組分去除率之間的關(guān)系。由表2 可知,與酯型兒茶素(EGCG和ECG)相比,相同用量條件下非酯型兒茶素(EGC、C、EC)的去除效果較好。以使用量50 mg·mL-1PVPP 為例,非酯型兒茶素去除率( 53.7%~61.4%) 約為酯型兒茶素(15.5%~28.3%)的2 倍。徐悅[20]分析經(jīng)PVPP處理的茶湯(水相)后,認(rèn)為羥基數(shù)量多的酯型兒茶素更容易被吸附去除。從分子結(jié)構(gòu)角度分析,非酯型兒茶素的基團(tuán)親水性強(qiáng),在兩相分配中更傾向于水相。本研究以乙酸乙酯層(有機(jī)相)中兒茶素組分為分析對(duì)象,故檢測(cè)到的非酯型兒茶素去除率較高。此外,非酯型兒茶素的分子量一般小于酯型兒茶素,符合PVPP 優(yōu)先結(jié)合并去除較小分子量酚類物質(zhì)這一特點(diǎn)[21]。

    表2 PVPP 處理后茶葉樣品中兒茶素的去除率Table 2 Removal rates of catechins from tea samples after PVPP addition

    隨著PVPP 使用量增多,兒茶素被吸附并去除的比例逐漸增加。尤其是使用量由 100 mg·mL-1增加到200 mg·mL-1時(shí),酯型兒茶素去除率大幅提高,隨之變化幅度趨緩??紤]處理成本、去除效率與操作難度等因素,確定200 mg·mL-1PVPP 使用量作為茶多酚類物質(zhì)去除的最佳條件。

    2.1.4 茶葉樣品前處理方法開發(fā)與評(píng)價(jià)

    在前述優(yōu)化的特異性去除條件下,建立了適用于茶葉樣品的前處理方法。茶葉樣品經(jīng)1.5 mol·L-1H2SO4浸泡,在200 mg·mL-1PVPP條件下采用乙酸乙酯提取,提取液經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后加入100 mg·mL-1GCB、200 mg·mL-1PSA,取出上清液用于檢測(cè)(圖1)。

    選取直接浸提與前處理后的試液,利用色譜分析評(píng)估基質(zhì)成分去除效果。由圖4A 可知,樣品經(jīng)本方法前處理后咖啡堿和茶多酚(EGC、C、EC、EGCG、ECG)含量均接近或低于色譜儀器的檢出限水平。與直接浸提相比,提取液中對(duì)應(yīng)的基質(zhì)成分去除率均大于99.99%,表明該前處理方法可有效降低目標(biāo)基質(zhì)成分含量。

    圖4 經(jīng)前處理后茶葉樣品中兒茶素和咖啡堿的去除效果Fig. 4 Removal of catechins and caffeine from tea samples after pretreatment

    分別在空白茶葉樣品中添加12 種有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥,通過加標(biāo)回收試驗(yàn),分別考察本方法對(duì)農(nóng)藥回收率的影響(圖5)。在2.5 mg·kg-1的農(nóng)藥加標(biāo)濃度下,目標(biāo)農(nóng)藥的回收率均在64.5%~116.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.29%~19.38%(n=3)范圍。因此,綜合基質(zhì)成分去除效果和農(nóng)藥加標(biāo)回收結(jié)果兩方面考慮,該前處理方法具有高效、高選擇性凈化茶葉基質(zhì)的能力,有望滿足茶葉農(nóng)殘快速檢測(cè)的分析需求。

    圖5 12 種農(nóng)藥經(jīng)前處理后的回收率Fig. 5 Recoveries of 12 pesticides by the current pretreatment method

    2.2 前處理方法在茶葉農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用

    2.2.1 酶抑制法

    茶葉基質(zhì)成分會(huì)顯著干擾μPADs 上酶抑制法的檢測(cè)信號(hào),即使痕量的EGCG、咖啡堿等基質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的農(nóng)殘檢測(cè)假陽性結(jié)果(圖6)。氨基甲酸酯類農(nóng)藥在茶葉中檢出與受關(guān)注程度較高,因此本研究選擇克百威和滅多威兩種典型的氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為模型,分別采用酶抑制法與速測(cè)卡法進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證本方法的實(shí)用性。利用2.1 章節(jié)開發(fā)的方法進(jìn)行空白茶樣前處理,并用提取液配制克百威工作液測(cè)定工作曲線,結(jié)果如圖7 所示??税偻舛扰c芯片上感應(yīng)區(qū)的顏色信號(hào)呈負(fù)相關(guān),定量關(guān)系符合Hill 1 方程。利用建立的工作曲線,所有芯片的校正決定系數(shù)(Adj.R2)均大于0.93,以半抑制濃度計(jì)算該方法對(duì)茶提取液中克百威的檢出限為(0.113±0.001)mg·L-1(n=3),即對(duì)應(yīng)茶樣中克百威的檢出限為(0.565±0.005)mg·L-1(n=3)。在綠茶樣品中添加0.75 mg·kg-1水平的克百威標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率為(92.65±2.17)%(RSD=2.35%,n=3)。

    圖6 茶葉中典型基質(zhì)成分對(duì)μPADs 上酶抑制法檢測(cè)信號(hào)的影響Fig. 6 The effect of typical matrix components in tea on the signal of enzyme inhibition method based on μPADs

    圖7 克百威的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig. 7 Dose-response curves for carbofuran detected by the enzyme inhibition method

    2.2.2 速測(cè)卡法

    茶葉中內(nèi)源性基質(zhì)成分對(duì)農(nóng)殘速測(cè)卡的可靠檢測(cè)提出了巨大的挑戰(zhàn)。茶葉樣品經(jīng)水提取時(shí),農(nóng)藥殘留速測(cè)卡對(duì)其檢測(cè)的結(jié)果呈現(xiàn)明顯的假陽性。經(jīng)前處理后,提取液中的茶葉基質(zhì)成分得到有效去除,速測(cè)卡對(duì)空白提取液的檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為陰性。當(dāng)茶樣中滅多威的濃度提高至0.20 mg·kg-1時(shí),檢測(cè)結(jié)果可被肉眼識(shí)別為陽性(表3),表明前處理過程有效提高了農(nóng)殘速測(cè)卡在茶葉中應(yīng)用的可靠性。

    表3 基質(zhì)去除前后與滅多威加標(biāo)濃度的速測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of rapid test card with different methomyl spiked concentrations before and after pretreatment

    3 結(jié)論

    本研究以茶葉農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的實(shí)際需求為導(dǎo)向,針對(duì)樣品典型基質(zhì)成分的分子結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)去除流程,開發(fā)了一套基質(zhì)去除效率高、特異性強(qiáng)的茶葉前處理方法。與純水浸提相比,該方法對(duì)茶樣提取液中目標(biāo)基質(zhì)的去除率達(dá)到99.99%以上,結(jié)合酶抑制農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶葉中以克百威、滅多威為代表的農(nóng)藥殘留快速、靈敏、可靠檢測(cè)。本方法基質(zhì)去除效果好、適用性廣、操作便捷,可以顯著降低農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)茶葉樣品的基質(zhì)干擾,滿足對(duì)茶葉基質(zhì)敏感的快速檢測(cè)方法的需求。

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