微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定DPP-4 抑制劑原料藥中7 種元素雜質(zhì)

喬敏莎，鄭秋瑩，喬曉娜，張綠茵，蘭為環(huán)，路曉慧，潘曉男

（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研究院，天津 300410）

2 型糖尿?。═2DM），又名非胰島素依賴型糖尿病，是由于體內(nèi)血糖水平提高而引發(fā)的代謝障礙性疾病[1]。它不僅會增加缺血性心臟病、中風(fēng)等風(fēng)險(xiǎn)，而且還會對患者的身體健康構(gòu)成巨大的威脅，甚至危及其生命[2-5]。近年來，二肽肽酶-IV 抑制劑已成為2型糖尿病的一種前沿治療方法[6-7]，它不僅可以保持人體血糖水平的穩(wěn)定性，而且還可以抑制胰島β 細(xì)胞的生長，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、促進(jìn)代謝、減輕高血糖并預(yù)防糖尿病發(fā)生的目的，這一優(yōu)勢遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了傳統(tǒng)的藥物[8]。

藥品生產(chǎn)過程中的元素雜質(zhì)一旦進(jìn)入人體，會對人體的正常新陳代謝和生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重的損害[9-10]，因此，在藥品生產(chǎn)過程中對元素雜質(zhì)進(jìn)行全面的風(fēng)險(xiǎn)評估，嚴(yán)格控制元素雜質(zhì)的含量至關(guān)重要。無機(jī)元素的檢測方法主要包括原子吸收光譜法（AAS）、原子吸收光譜法（ICP-AES）和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）等，其中，ICPMS 法則擁有更加出色的抗干擾特性、更高的靈敏度、更寬的線性范圍以及更加高效的分析速率，因此，它已成為痕量元素的最佳檢測設(shè)備。

TSL0319 是在研的1.1 類DPP-4 抑制劑新藥。作者根據(jù)ICHQ3D《元素雜質(zhì)指南》要求，對自研DPP-4 抑制劑原料藥的整個(gè)制備過程進(jìn)行元素雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評估，然后在文獻(xiàn)[11-14]的基礎(chǔ)上，建立微波消解-ICPMS 法測定其原料藥中1 類和2A 類共7 種元素雜質(zhì)（汞、鎳、鈷、鎘、釩、砷、鉛）的方法，旨在為DPP-4 抑制劑的藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：iCAP Q 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾公司；MARS6 型微波消解儀，美國CEM 公司；Milli-Q 型純水機(jī)，美國密理博公司；XS205DU型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

試劑：硝酸，優(yōu)級純，德國默克公司；過氧化氫，優(yōu)級純，上海遠(yuǎn)大過氧化物有限公司；鹽酸，優(yōu)級純，美國密理博公司；Ge、In、Bi、Au、Hg、Ni、Co、Cd、V、As、Pb 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1 000 mg·L-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；超純水，通過純水機(jī)制備，電阻率18.2 mΩ·cm-1。

1.2 儀器工作條件

微波消解條件：消解溫度程序?yàn)椋?～ 10 min，由室溫上升至180 ℃；10～ 20 min，由180 ℃上升至200 ℃，20～ 35 min，消解溫度保持在200 ℃；消解功率設(shè)置為自動(dòng)。

ICPMS 儀器條件：儀器功率1.55 kW；氣體流量：霧化氣1.0 L·min-1，冷卻氣14.0 L·min-1；輔助氣0.8 L·min-1；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速40 r·min-1，采樣錐和截取錐均為鎳錐；采樣深度為5.0 mm；采用KED 碰撞池模式；重復(fù)測定次數(shù)3 次；積分時(shí)間0.023 s。內(nèi)標(biāo)法定量，即測定標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液時(shí)，在線添加內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密量取鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋得到每1 mL 含鍺20 ng、銦0.5 ng、鉍0.5 ng 的混合溶液。

金標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密量取金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋得到每1 mL 含金25 μg的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別精密量取鎘、鉛、砷、汞、鈷、釩、鎳單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋得到每1 mL 分別含鎘、鉛、砷、汞、鈷、釩、鎳 為250 ng、250 ng、750 ng、1 500 ng、2 500 ng、5 000 ng、10 000 ng 的標(biāo)準(zhǔn)儲備母液，然后用硝酸稀釋10 倍，即得標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，置于50 mL 容量瓶中，精密加入金標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，用2%硝酸溶液稀釋，制成每1 mL 分別含鎘0 ng、0.15 ng、0.25 ng、0.5 ng、0.75 ng、1 ng，含鉛0 ng、0.15 ng、0.25 ng、0.5 ng、0.75 ng、1 ng，含砷0 ng、0.45 ng、0.75 ng、1.5 ng、2.25 ng、3 ng，含 汞0 ng、0.9 ng、1.5 ng、3 ng、4.5 ng、6 ng，含鈷0 ng、1.5 ng、2.5 ng、5 ng、7.5 ng、10 ng，含釩0 ng、3 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng，含 鎳0 ng、6 ng、10 ng、20 ng、30 ng、40 ng 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

供試品溶液的制備：精密稱取0.2 g 原料藥，放入消解罐中，然后加入5 mL 濃硝酸（體積比為65%），加蓋密封后進(jìn)行微波消解。待消解完成并降溫后，緩慢打開消解罐蓋子，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，精密添加200 μL 金標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白溶液的配制：制備方法同供試品溶液，但不加金標(biāo)準(zhǔn)溶液。

元素對照品溶液的配制：精密量取1 mL 混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用2%硝酸稀釋至50 mL，搖勻，即得。

加標(biāo)供試品溶液的配制：精密稱取0.2 g 原料藥，放入消解罐中，精密加入100 μL 混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲備母液，加入5 mL 濃硝酸（體積比為65%），加蓋密封后進(jìn)行微波消解。消解后的處理步驟同供試品溶液制備方法。

1.3.2 方法學(xué)考察步驟

專屬性：取“1.3.1 項(xiàng)”的供試品溶液、空白溶液、元素對照品溶液和加標(biāo)供試品溶液，分別上機(jī)測試，記錄響應(yīng)值，然后分別比較對照品溶液與空白溶液、加標(biāo)供試品溶液與供試品溶液的響應(yīng)值是否有明顯差異。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：依次測定系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以測量值（3 次讀數(shù)的平均值）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢出限：按“1.3.1 項(xiàng)”配制10 份空白溶液，分別上機(jī)測試，記錄空白溶液的響應(yīng)值，按照式（1）計(jì)算所對應(yīng)的各元素的濃度作為檢測限。

式中LOD——檢測限；

SD——目標(biāo)元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。定量限：按“1.3.1 項(xiàng)”配制10 份空白溶液，分別上機(jī)測試，記錄空白溶液的響應(yīng)值，按照式（2）計(jì)算所對應(yīng)的各元素的濃度作為定量限。

式中LOQ——定量限；

SD——目標(biāo)元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。重復(fù)性：按“1.3.1 項(xiàng)”分別配制6 份加標(biāo)供試品溶液，注入儀器中，計(jì)算各元素含量的RSD值。

準(zhǔn)確度：精密稱取已知濃度的原料藥樣品9 份，每份約0.2 g，分成3 組。每組分別精密加入至30%限度濃度、100%限度濃度、150%限度濃度的混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。然后在“1.2 項(xiàng)”條件下處理得到準(zhǔn)確度測試用的供試品溶液，上機(jī)測試，計(jì)算各元素的回收率以及含量的RSD值。

中間精密度：不同實(shí)驗(yàn)人員于不同日期配制“1.3.1 項(xiàng)”溶液，并測定加標(biāo)供試品溶液，計(jì)算RSD值。

系統(tǒng)適應(yīng)性：精密量取1.5 mL 混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用2%硝酸溶液稀釋至50 mL，搖勻，得到系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。然后取系統(tǒng)適用性溶液于供試品溶液分析前后分別進(jìn)行檢測，記錄濃度值，并計(jì)算偏移值，計(jì)算公式如下：

式中C前——樣品分析前系統(tǒng)適用性溶液的濃度；

C后——樣品分析后系統(tǒng)適用性溶液的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了不同的酸體系對樣品的消解效果，發(fā)現(xiàn)使用王水（濃鹽酸∶濃硝酸=3 ∶1）消解樣品時(shí)7 種元素的重復(fù)性優(yōu)于硝酸消解效果，均低于2%，但75As 和51V 的回收率較差，經(jīng)分析，75As 存在40Ar·35Cl 干擾、51V 存在35Cl·16O 干擾，而雙氧水和硝酸的混合體系同樣存在加標(biāo)回收率差的問題。因此，從方法學(xué)準(zhǔn)確度和試劑使用安全性的角度考慮，選擇純硝酸體系作為消解液，進(jìn)行樣品的微波消解前處理。

實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)校正的方式進(jìn)行檢測，保證分析方法的精度，并采用KED 模式進(jìn)行分析，該模式具有動(dòng)能歧視和質(zhì)量篩選功能，能夠有效地降低基質(zhì)干擾。另外，實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定記憶效應(yīng)非常強(qiáng)的Hg元素，為保證Hg 元素檢測的準(zhǔn)確性和記憶效應(yīng)的消除，添加了Au 標(biāo)準(zhǔn)液作為穩(wěn)定劑。

2.2 專屬性

專屬性結(jié)果如表1 所示。實(shí)驗(yàn)表明，對照品溶液與空白溶液相比，加標(biāo)供試品溶液與供試品溶液相比，均有明顯響應(yīng)，符合要求。

表1 7 種元素的專屬性結(jié)果Tab.1 Results of Specific for 7 elements

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

各元素的線性、范圍及檢出限、定量限如表2所示。結(jié)果表明，7 種元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999 3～ 0.999 9，檢出限低于0.013 ng·mL-1，定量限低于0.038 ng·mL-1，滿足分析要求。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限及定量限Tab.2 Standard curves，linear ranges，limit of detection and limit of quantitation

2.4 重復(fù)性

表3 為7 種元素重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢钥闯?，所測7 種元素的RSD 值均在3.0%以內(nèi)，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of repeatability test

2.5 準(zhǔn)確度

表4 是7 種元素的準(zhǔn)確度結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，各元素的回收率在92.27%～ 107.58%，即在70.0%～ 150.0%，重復(fù)性低于5.0%，符合痕量分析要求。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the recovery rate

2.6 中間精密度

不同日期及不同操作人員進(jìn)行中間精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，51V、59C o、60N i、75A s、111Cd、202Hg、208Pb 7種元素的加標(biāo)回收率范圍分別是98.21%～ 107.16%、97.77%～ 106.55%、9 7.5 2%～ 1 0 6.4 1%、9 5.7 0%～ 1 0 6.6 1%、9 5.0 4%～ 1 0 4.2 6%、9 3.6 8%～ 1 0 3.2 4%、91.67%～ 112.90%，均在70.0%～ 150.0%；7個(gè)元素的重復(fù)性均低于3.57%，即不大于USP233中規(guī)定的25.0%，說明方法的中間精密度符合分析要求。

2.7 系統(tǒng)適應(yīng)性

表5 是進(jìn)樣前后系統(tǒng)適用性溶液檢測結(jié)果及偏移值結(jié)果，從表中可以看出，各元素的偏移值均小于20.0%，說明方法的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

表5 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果Tab.5 Results of the system adaptation

2.8 原料藥中元素雜質(zhì)測定結(jié)果

限度用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，本品每1 g 含鎘不得過35 μg，含鉛不得超過35 μg，含砷不得超過107 μg，含汞不得超過214 μg，含鈷不得超過257 μg，含釩不得超過714 μg，含鎳不得超過1 428 μg。按實(shí)驗(yàn)建立的方法，對三批原料藥中7 種元素雜質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果如表6 所示。實(shí)驗(yàn)表明，三批原料藥的定量結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)中的限度要求。

表6 樣品中各元素含量Tab.6 Concentrations of the seven elements in samples

3 結(jié)束語

本研究通過微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜建立了DPP-4 抑制劑原料藥中釩、鈷、鎳、砷、鎘、汞、鉛7 種元素雜質(zhì)的含量測定方法，并對方法學(xué)進(jìn)行了全面的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)表明，所建立方法的線性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率、專屬性、中間精密度等均符合分析要求，測定的3 批樣品中7 種元素的含量均遠(yuǎn)小于其限度值。因此，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，可用于DPP-4抑制劑原料藥中元素雜質(zhì)的分析檢測，也可為藥物的質(zhì)量控制研究提供參考依據(jù)。