海螺望春花優(yōu)株花蕾不同時(shí)期化學(xué)成分比較分析

駱緒美，韓文妍，程明偉，蘭偉，任杰

（1.安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，安徽合肥 230088；2.阜陽師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽 236037；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，安徽合肥 230031）

海螺望春花（Yulania denudatecv. Hailuo）原產(chǎn)安徽懷寧縣石鏡鄉(xiāng)鄧林村海螺山，為安徽省特有木蘭科玉蘭屬優(yōu)良種質(zhì)資源，其干蕾為藥用辛夷的一種。從16 世紀(jì)起，石鏡鄉(xiāng)就以采收海螺望春花花蕾作中藥而馳名國內(nèi)外[1-2]。辛夷性溫味辛，歸肺胃經(jīng)，具有抗炎、抗菌、抗過敏等作用，主治風(fēng)寒頭痛、鼻塞、鼻淵和鼻流濁涕等病癥[3-11]。

辛夷現(xiàn)代研究多集中在揮發(fā)油和木蘭脂素等化學(xué)成分和藥理研究上，對(duì)其最佳采摘時(shí)間多以花蕾形態(tài)描述。如宋代《本草圖經(jīng)》[12]和明代《本草品匯精要》[13]均記載：“花蕊縮者良，已開者劣，謝者不佳?！泵鞔侗静菥V目》[14]記載：“河尖銳儼如筆頭，重重有青黃茸毛順鋪?！薄吨袊幉膶W(xué)》[15]記載：“本品以完整未開花蕾，內(nèi)瓣緊密，色綠，無枝梗，香氣濃郁為佳?！睂?duì)其花蕾采摘時(shí)間描述上有2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，唐代《新修本草》記載：“正月、二月好采”，《吳普本草》和《名醫(yī)別錄》中記載：“九月采實(shí)，曝干?！辫b于各種說法不一，為摸清辛夷最佳采蕾期及優(yōu)良單株間花蕾生長差異，筆者自海螺望春花當(dāng)年花蕾花芽分化開始，每月定株定量采摘花蕾，直至翌年3 月花開止，對(duì)其花蕾的揮發(fā)油等主要化合物含量進(jìn)行測(cè)定分析，旨在掌握花蕾內(nèi)含物生長規(guī)律及其最佳采蕾期，為辛夷采摘時(shí)間提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

試驗(yàn)樣品采自懷寧縣石鏡鄉(xiāng)海螺山，為前期優(yōu)選的望春花優(yōu)良單株，樹齡均為100 年以上，樣品采集時(shí)間自2019 年10 月至2020 年3 月。每個(gè)樣品采集1 500 g 鮮蕾，將采回的樣品進(jìn)行干燥處理，烘箱中65℃下烘干至恒重，粉碎機(jī)打碎后過80 目篩。并將粉末放入樣品瓶中置于3℃～4℃的低溫樣品保存柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試驗(yàn)儀器。液相色譜儀（Agilent 1260 高效液相色譜儀系統(tǒng)，安捷倫科技公司）；超聲波清洗器（KQ-500，江蘇昆山超聲儀器有限公司）；電子天平（FA1104，上海天平儀器廠）；低速離心機(jī)（SC-3610，安徽中科中佳科學(xué)儀器公司）；高速離心機(jī)（TG16-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；氮吹儀（EVAPTM112，美國Organomation Associates，Jnc.公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A，上海一恒科技有限公司）；1 000 mL 和100 mL 移液器（德國艾本德公司）；揮發(fā)油提取器（鄭州益康化工產(chǎn)品有限公司）；50 mL和15 mL 離心管，10 mL 容量瓶、100 mL 量筒、1 000 mL圓底燒瓶、進(jìn)樣瓶等。

1.2.2 試驗(yàn)試劑。α-蒎烯、桉葉油素（ACROS 公司）；β-蒎烯、月桂烯、樟腦（北京伊諾凱科技有限公司）；乙腈、甲醇（HPLC 級(jí)，美國TIDEA 公司）；乙酸乙酯（AR 級(jí)，西隴化工股份有限公司）；PSA（40～60 μm）為農(nóng)殘級(jí)（北京艾杰爾科技有限公司）；C18為農(nóng)殘級(jí)（北京艾杰爾科技有限公司）；GCB 為農(nóng)殘級(jí)（Agela Technologies 公司）；超純水（UPT-II-10T 型，成都超純科技有限公司）。

1.3 揮發(fā)油的提取

采用《藥典》提供的水蒸餾提取法提取揮發(fā)油[4]。取50 g 干燥海螺望春花粉末置于容量1 000 mL 蒸餾燒瓶中，加入適量的去離子水與其混合均勻，并將其進(jìn)行加熱回流。加熱至微沸時(shí)，保持5 h 的微沸狀態(tài)進(jìn)行提取，蒸餾結(jié)束后關(guān)閉電源。冷卻1 h 后，讀取并收集所提取的揮發(fā)油，用無水硫酸鈉去水，避光封閉保存，放置過夜，濾除固體無水硫酸鈉后，稱重[16]。

1.4 揮發(fā)油中活性成分的GC-MS 測(cè)定

氣相色譜- 質(zhì)譜分析：HP-GC-5890-5970BMSD 型色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱：SE-54（25 m×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；色譜柱程序升溫條件：初始溫度80℃，保持8 min 后，以4℃/min 的速率升溫至220℃并保持15 min；載氣He，柱前壓為49 kPa，分流比為1∶50；進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度260℃；電離電壓70 eV；質(zhì)量掃描范圍：30～400 amu。

1.5 活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別將1 000 mg/L 的α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、桉葉油素、樟腦標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜正己烷稀釋配得50、30、20、10、5 mg/L 等系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以5 種有效成分的質(zhì)量（ng）與峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中y 為5 種有效成分峰面積，x 為有效成分濃度（mg/L）。由圖1 可知，5 種活性成分的樣量均在5～50 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 揮發(fā)油活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方程

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期總揮發(fā)油含量

對(duì)3 株優(yōu)株不同時(shí)期的揮發(fā)油含量進(jìn)行測(cè)定分析，得出（表1）：1～3 號(hào)優(yōu)株干燥花蕾的揮發(fā)油凈提取率均在1%以上，符合《藥典》對(duì)于辛夷的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。1 號(hào)優(yōu)株不同時(shí)期的揮發(fā)油凈提取率介于3.31%～6.71%，其中翌年1、2 月（6.71%）最高，3 月（3.31%）最低。2 號(hào)和3 號(hào)優(yōu)株的揮發(fā)油凈提取率較為相近；2 號(hào)優(yōu)株揮發(fā)油凈提取率介于2.60%～3.96%，翌年2 月（3.96%）最高，3 月（2.60%）最低；3號(hào)優(yōu)株揮發(fā)油凈提取率介于1.73%～3.37%，2 月（3.37%）最高，3 月（1.73%）最低。

表1 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期總揮發(fā)油含量

2.2 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期5 種有效成分含量

不同時(shí)間段（10 月、11 月、12 月、翌年1 月、2 月、3 月）對(duì)優(yōu)株花蕾的α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、1，8-桉葉素、樟腦內(nèi)含物含量進(jìn)行測(cè)定分析得出（表2）：1 號(hào)優(yōu)株α-蒎烯提取率介于0.11%～0.28%，最高為11 月（0.28%）；2 號(hào)優(yōu)株α-蒎烯提取率介于0.06%～0.20%，最高為1 月（0.20%）；3 號(hào)優(yōu)株α-蒎烯提取率介于0.04%～0.17%，最高為12 月（0.17%）。1 號(hào)優(yōu)株β-蒎烯提取率介于0.30%～0.73%，最高為11 月（0.73%）；2號(hào)優(yōu)株β-蒎烯提取率介于0.11%～0.46%，最高為2 月（0.46%）；3 號(hào)優(yōu)株β-蒎烯提取率介于0.09%～0.47%，最高為12 月（0.47%）。1 號(hào)優(yōu)株月桂烯提取率介于0.13%～0.40%，最高為11 月（0.40%）；2 號(hào)優(yōu)株月桂烯提取率介于0.02%～0.88%，最高為11 月（0.88%）；3 號(hào)優(yōu)株月桂烯提取率介于0.04%～0.17%，最高為3 月（0.17%）。1 號(hào)優(yōu)株1，8-桉葉素提取率介于0.81%～1.83%，最高為11 月（1.83%）；2 號(hào)優(yōu)株1，8-桉葉素提取率介于0.23%～0.80%，最高為1 月（0.80%）；3 號(hào)優(yōu)株1，8-桉葉素提取率介于0.17%～0.45%，最高為12 月（0.45%）。樟腦的提取量較少，株間差距較大，僅1 號(hào)優(yōu)株能提取，且各月份間差異不大。

表2 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期5 種有效成分的含量%

總體來看（圖2），1 號(hào)優(yōu)株的5 種有效成分提取量均高于其他優(yōu)株，最高提取量為11 月（3.25%）；2 號(hào)優(yōu)株5種有效成分最高提取量為1 月（2.23%）；3 號(hào)優(yōu)株的5 種有效成分最高提取量為12 月（1.22%）。

圖2 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期5 種有效成分含量總和變化

2.3 花蕾最佳采集時(shí)間和最佳優(yōu)良單株

對(duì)3 株優(yōu)株不同月份揮發(fā)油凈提率進(jìn)行比較（圖3）可知，1 號(hào)優(yōu)株的月?lián)]發(fā)油提取率遠(yuǎn)高于2 號(hào)、3 號(hào)優(yōu)株，1號(hào)優(yōu)株揮發(fā)油提取率最高為1—2 月，2 號(hào)、3 號(hào)優(yōu)株揮發(fā)油提取率最高為2 月。3 種優(yōu)株揮發(fā)油含量月變化規(guī)律較為一致，10 月至翌年1 月花蕾揮發(fā)油含量一直處于上升積累期，至2 月達(dá)最高值，3 月花即將開放時(shí)明顯下降，故2 月為其花蕾采集最佳時(shí)間。

圖3 優(yōu)株花蕾不同時(shí)期揮發(fā)油提取率

海螺望春花優(yōu)株10 月至次年3 月花干蕾揮發(fā)油含量月平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（表3）結(jié)果顯示，1 號(hào)優(yōu)株的揮發(fā)油月平均提取率（5.00%）高于2 號(hào)優(yōu)株（2.99%）和3 號(hào)優(yōu)株（2.55%），且具有顯著的差異性（P＜0.05）。

表3 優(yōu)株花蕾揮發(fā)油提取率月平均值

海螺望春花優(yōu)株從10 月至次年3 月花干蕾5 種有效成分總量平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差（表4）的結(jié)果顯示，1 號(hào)優(yōu)株的5 種有效成分總含量（2.3%）均高于2 號(hào)（1.2%）和3 號(hào)優(yōu)株（0.07%），具有顯著的差異性（P＜0.05）。

表4 優(yōu)株花蕾5 種有效成分總和的平均值

3 結(jié)論與討論

3.1 最佳優(yōu)良單株選擇

海螺望春花干燥花蕾的揮發(fā)油凈提取率遠(yuǎn)高于《藥典》中規(guī)定的辛夷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（1%）。1 號(hào)優(yōu)株不論是揮發(fā)油提取率還是5 種有效成分的總含量均顯著高于2 號(hào)和3號(hào)優(yōu)株，其單株花蕾結(jié)實(shí)量大（前期研究基礎(chǔ)上），花蕾揮發(fā)油提取率最高，為6.71%，5 種共有成分總量也為最高（3.25%）；1 號(hào)優(yōu)株的揮發(fā)油月平均提取率（5.0%）明顯高于2 號(hào)優(yōu)株（2.99%）和3 號(hào)優(yōu)株（2.55%），差異顯著。因此1 號(hào)優(yōu)株為最佳藥用辛夷采蕾優(yōu)良單株。

3.2 優(yōu)株不同生長期揮發(fā)油提取的規(guī)律性

海螺望春花優(yōu)株的揮發(fā)油提取率在不同的生長期內(nèi)均呈拋物曲線變化，揮發(fā)油的提取率隨花蕾生長而增加，至翌年1、2 月相對(duì)較高，2 月達(dá)峰值，翌年3 月均明顯下降。這與徐植靈等[17]研究發(fā)現(xiàn)海螺望春花提取率在不同的生長期規(guī)律性較為一致。該研究結(jié)果表明，2 月為海螺望春花優(yōu)株花蕾最佳采集時(shí)期。

3.3 優(yōu)株不同生長期5 種有效成分提取的規(guī)律性

徐植靈等[17]曾對(duì)市面上9 種海螺望春花花蕾有效成分進(jìn)行了對(duì)比，其中α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、樟腦、α-松油醇等是辛夷揮發(fā)油所共有的化學(xué)成分。該試驗(yàn)對(duì)選取的5 種有效成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同活性成分所表現(xiàn)出的高低規(guī)律有較大差異，無顯著相關(guān)性，1、2 號(hào)優(yōu)株5種有效成分含量月變化規(guī)律較為一致。每種活性成分的最高值出現(xiàn)在不同的月份，故可針對(duì)性地在不同時(shí)間內(nèi)提取，以獲取單種成分最高值。

海螺望春花優(yōu)株花蕾活性成分在生長期內(nèi)沒有呈現(xiàn)一致的規(guī)律性，可能有以下幾點(diǎn)原因：其一，花蕾生長至開花前，要褪去3 層苞片，部分月份在采摘花蕾時(shí)可能正在褪苞片，影響其當(dāng)月試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果；其二，該試驗(yàn)僅采集了3 株優(yōu)株，數(shù)量較少，會(huì)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)造成較大的影響，故后期應(yīng)加大試驗(yàn)樣品的數(shù)量，重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。