中藥基于線粒體功能防治阿霉素心臟毒性研究進展

徐東辰 李泉紅 穆雪平 單晶晶

阿霉素(doxorubicin,DOX)屬于蒽環(huán)類抗生素,對臨床上許多惡性腫瘤療效顯著,但其產(chǎn)生的心臟毒性促使患者罹患心肌鈣化、擴張性心肌病、心力衰竭等疾病,縮短其生存時間,降低生活質(zhì)量。目前DOX引發(fā)心臟損傷的機制尚在探索中。近年發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥通過調(diào)控線粒體參與多種生物調(diào)節(jié)過程,涉及氧化應激、能量代謝、離子穩(wěn)態(tài)、自噬凋亡等環(huán)節(jié),在保護DOX心臟毒性的病理機制中取得積極成效。

中醫(yī)認為,化療藥物性溫燥,與癌毒病邪共同劫傷氣血津液,加劇線粒體功能障礙,影響心臟細胞的呼吸功能和能量代謝[1-2]。癌癥患者久病傷及正氣,防御外邪與驅(qū)邪外出之效能低下,導致線粒體自噬等免疫功能更易于受損[3]。氣虛無力行血,陰虛無以濡養(yǎng)血脈,最終血管僵化,充血不利,使瘀血留滯體內(nèi),臟腑之氣不能通于經(jīng)絡之氣,阻礙心肌收縮功能。由此可見,DOX毒性通過氣血與線粒體聯(lián)系密切,為中醫(yī)藥調(diào)控DOX心臟毒性提供了理論依據(jù)。本文基于國內(nèi)外新進展就DOX心臟毒性相關(guān)機制及中藥防治作用進行闡述,以期為抑制DOX誘導的心臟毒性臨床策略提供新思路。

1 通過抗氧化應激發(fā)揮對線粒體保護作用防治DOX心臟毒性

1.1 降低活性氧水平

MU等[10]發(fā)現(xiàn)熊果酸可以促進蛋白激酶B和eNOS磷酸化,下調(diào)NADPH氧化酶4以抑制eNOS解耦聯(lián),增加NO產(chǎn)生,競爭性降低ROS含量,減少氧化及亞硝化應激和炎癥反應,改善DOX小鼠心臟左室收縮功能。盧均坤等[11]發(fā)現(xiàn),化療前4天起連續(xù)給藥Wistar大鼠至化療結(jié)束,姜黃素聯(lián)合谷胱甘肽組較對照組與阿霉素組的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白水平明顯下降,IκB蛋白表達升高,有效抵抗脂質(zhì)過氧化,阻止新活性氧和炎癥反應,以減少DOX造成的急性心肌線粒體變性。

中藥抗氧化特性在抑制ROS產(chǎn)生及釋放方面具有天然亮點,可通過增加其他穩(wěn)定性氧化物、阻斷電子傳遞、調(diào)節(jié)反應物氧化結(jié)合能力等有效控制內(nèi)源性ROS爆裂,減輕其造成的毒性損傷,進而改善線粒體和心肌細胞超微結(jié)構(gòu),恢復心功能指標。

1.2 調(diào)控氧化酶活性

心臟較其他器官相比,含有抗氧化酶水平更低,更易受到DOX藥物的過氧化損傷。DOX在代謝轉(zhuǎn)化過程中,會引發(fā)NADPH氧化酶、NO和H2O2過度激活,導致脂質(zhì),蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷[12];DOX代謝物會與不同內(nèi)源性抗氧化酶和GSH的巰基(-SH)基團相互作用,使其失活[13];積累的自由基也會增加內(nèi)源性抗氧化酶和谷胱甘肽的消耗,進一步增加自由基釋放[13-14]。此外,DOX治療會增強嘌呤代謝,促使心臟組織中的黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)通過增加過氧化氫產(chǎn)生及上調(diào)鐵凋亡途徑,誘導左心室相關(guān)的心臟功能受損[15]。新研究還發(fā)現(xiàn)體內(nèi)單胺氧化酶(mono amine oxidase,MAO)通過催化心臟相關(guān)的生物胺脫氨,協(xié)同增強DOX誘導的急性心肌損傷;而抑制MAO能夠消除多項線粒體功能障礙,包括線粒體膜電位、通透性轉(zhuǎn)變、氧化還原電位、Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體形態(tài)和肌節(jié)組織,從而調(diào)節(jié)異常細胞上游的線粒體ROS生成,阻止DOX引發(fā)新生大鼠和成年小鼠的腔室擴張和心功能不全[16-17]。

因此,針對線粒體靶向SOD,抑制促氧化酶或增強抗氧化酶活性以提高氧化防御能力,是治療DOX衍生的線粒體及心肌病的重要策略。

1.3 介導信號通路

細胞信號轉(zhuǎn)導是探討DOX心臟毒性發(fā)病機制及治療的研究熱點。缺乏Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1(Grb2-associated binding protein 1,Gab1)的DOX治療小鼠顯示出氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡損傷的增強,推測與Gab1協(xié)助下調(diào)PI3K/Akt信號通路有關(guān)[22]。實驗發(fā)現(xiàn),DOX會抑制Akt和GSK-3β的磷酸化,下調(diào)Sirt1蛋白水平,增加炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平和mRNA表達,說明心臟毒性作用至少部分歸因于Akt/GSK-3β和Sirt1信號通路調(diào)節(jié)[23]。

姜黃二酮是中藥莪術(shù)的關(guān)鍵成分之一。研究發(fā)現(xiàn),姜黃二酮降低了DOX誘導的Erk1/2和c-Jun-N-末端激酶的磷酸化,通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路降低ROS和Bax水平,活化Bcl-2表達,保護DOX心肌氧化及凋亡損傷[24]。水飛薊可激活SIRT3信號,介導氧化應激和細胞凋亡,明顯改善心肌“空泡化”變性[25]。LIN等[26]發(fā)現(xiàn)黃酒多酚類化合物可促進Nrf2核易位,減弱DOX誘導的ROS和下調(diào)TGF-β1/smad3通路,抑制心肌纖維化。香青蘭總黃酮可抑制DOX引發(fā)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,前者促進非受體酪氨酸激酶和黏著斑激酶表達,升高eNOS磷酸化,同時增強VEGF-B/AMPKα通路活性,保護微血管內(nèi)皮細胞增殖,維持心臟屏障完整[27]。芍藥醇可以抑制DOX誘導的心力衰竭大鼠模型中miR-21-5p表達,并上調(diào)S相激酶相關(guān)蛋白2(S-phaseKinase-associatedProtein2,SKP2)表達量,轉(zhuǎn)染處理和蛋白質(zhì)印跡顯示細胞活性和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)提高,Bcl-2和線粒體Cyt c表達降低,Bax、C-caspase-3和細胞質(zhì)Cyt c表達增加,說明芍藥醇通過調(diào)節(jié)miR-21-5p/SKP2軸減少了DOX誘導的心肌細胞凋亡和ROS產(chǎn)生[28]。

多項研究發(fā)現(xiàn),14-3-3γ通過氧化應激參與阿霉素心臟毒性機制。實驗結(jié)果表明,姜黃素、川芎嗪預處理均可上調(diào)細胞14-3-3γ表達,協(xié)助Bcl-2自胞漿移位至線粒體,抑制氧化應激,改善線粒體功能,發(fā)揮抗DOX毒效作用[29-30]。CHEN等[31]發(fā)現(xiàn)槲皮素也可上調(diào)14-3-3γ表達,上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶水平;敲除14-3-3γ基因會消除槲皮素預處理后心肌細胞產(chǎn)生ROS的抑制。WU等[32]發(fā)現(xiàn)山奈酚既可以上調(diào)14-3-3γ,抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔開放,維持MMP,改善線粒體功能;還能促進eNOS磷酸化,增加NO合成,減輕DOX誘導的內(nèi)皮細胞毒性?？梢?中藥上調(diào)14-3-3γ具有綜合干預ROS、抗氧化酶、凋亡基因、膜電位等潛力,展示出靶向線粒體以應對氧化應激的新型治療方法。

2 通過改善能量代謝發(fā)揮對線粒體保護作用防治DOX心臟毒性

線粒體為心肌組織提供了大部分能量。蒽環(huán)類藥物會誘導發(fā)生線粒體功能障礙,抑制脂肪酸氧化代謝,迫使心肌細胞轉(zhuǎn)而使用葡萄糖、乳酸和少量酮體產(chǎn)生能量,然而改變底物利用率能補償早期能量損失,但不能滿足細胞的長期能量需求,最終誘發(fā)代謝紊亂和能量衰竭[33]。研究顯示,DOX誘導的大鼠心力衰竭模型中出現(xiàn)氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂代謝異常和糖酵解紊亂,作用機制與介導上調(diào)上游靶點蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B),抑制胰島素受體底物1(insulin receptor substrate,IRS-1)磷酸化來損害HIF-1α表達有關(guān)[34]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPARs)是一類參與調(diào)控碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)合成與代謝的轉(zhuǎn)錄因子,在肝臟、心臟和血管壁中高度表達[35]。DOX給藥的荷瘤小鼠心臟中PPARα表達降低,而通過重組腺相關(guān)病毒血清型9(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)遞送PPARα基因可直接調(diào)節(jié)間充質(zhì)同源盒1(mesenchymal homeobox 1,MEOX1)表達,減少DOX誘導的小鼠能量代謝紊亂和心功能不全;敲除MEOX1的小鼠顯示PPARα心臟保護作用被消除[36]。

上述研究說明,提高線粒體功能代謝對減輕阿霉素心臟毒性具有積極意義。實驗證明,干姜水煎液0.5 mg/mL組細胞外酸化率、ATP水平均顯著升高,H+質(zhì)子滲漏水平顯著降低,說明細胞氧化磷酸化、糖酵解、ATP合成升高,線粒體能量代謝明顯改善[37]。提高線粒體ATP酶活性是增加能量代謝率的另一個節(jié)點?？鄥A是一種來自苦豆子的生物堿,徐煒棉等[38]發(fā)現(xiàn)150 mg/L苦參堿組能顯著增加線粒體Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性,改善DOX誘導的H9c2心肌細胞ATP酶損害,緩解線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷。

尋求靶點減少阿霉素對心臟線粒體能量代謝的損傷不失為有效策略,但未來能否增加線粒體對多種底物的綜合能量轉(zhuǎn)換效率,尋找持續(xù)性供能策略,以彌補DOX造成的心臟能量損害,延遲心力衰竭進展,還需更多實驗論證。

3 通過維持鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)揮對線粒體保護作用防治DOX心臟毒性

適當Ca2+進入線粒體可以協(xié)助氧化磷酸化及ATP產(chǎn)生,然而鈣超載會觸發(fā)p53介導細胞周期停滯和細胞凋亡。研究證實,DOX會觸發(fā)持續(xù)性胞質(zhì)Ca2+釋放,刺激線粒體Ca2+超負荷,導致代謝功能障礙和細胞凋亡[39]。連接蛋白43(connexin43,Cx43)是一種心臟間隙連接和半通道的主要蛋白質(zhì)構(gòu)建塊。DOX處理促使小鼠心肌母細胞中Cx43在線粒體定位表達減少,Ser368上磷酸化的Cx43表達增加并調(diào)控縫隙連接、電與化學解耦,誘導Ca2+穩(wěn)態(tài)改變并最終觸發(fā)心臟損傷[40]。另有研究表明,核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號傳導在DOX治療后顯著降低,通過激活Bnip3基因與下游親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D,CypD)介導線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放,大量鈣流入導致線粒體擾動和死亡[41]。

異鼠李素是植物沙棘的主要成分,可以緩解胞漿內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電位,降低Cytc和Caspase-9表達,維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài),修復線粒體功能,從而減輕阿霉素誘導的心肌細胞凋亡[42]。人參皂苷Rb1是人參根部提取物,可提高線粒體鈉鈣交換體(mitochondrial Na+/Ca2 +exchanger,NCLX)、鈣離子攝入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)及電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)水平,降低線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體( mitochondrial calcium uniporter,MCU)水平,促進鈣離子轉(zhuǎn)出,改善膜電位水平和線粒體腫脹程度,緩解DOX誘導的心力衰竭[43]。

鈣離子參與心臟電傳導和心肌收縮,受到細胞膜鈣通道、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體協(xié)同調(diào)節(jié)[44]。分泌通路Ca2+-ATP酶SPCA2可以通過激活與非儲存依賴性Ca2+進入來驅(qū)動乳腺癌細胞中G1/S檢查點的進展,有益于細胞存活和DOX化療耐藥性[45]。因此,促進Ca2+從線粒體轉(zhuǎn)出,改善細胞呼吸和線粒體膜電位是中藥改善DOX化療毒性的有效發(fā)展方向。

4 通過調(diào)節(jié)線粒體動力學發(fā)揮對線粒體保護作用防治DOX心臟毒性

線粒體動力學是線粒體維持質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié),涉及線粒體融合和裂變、生物發(fā)生、降解(包括線粒體自噬)、及細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等過程[46]。

4.1 線粒體融合和裂變

線粒體動力學失衡會影響線粒體數(shù)量,形態(tài)和功能改變,導致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病發(fā)展[47]。DOX能抑制線粒體融合蛋白1(mitochondrial fusion protein 1,MFN1)、線粒體融合蛋白2(mitochondrial fusion protein 2,MFN2)和線粒體視神經(jīng)萎縮蛋白1(mitochondrial optic atrophy protein1,OPA1),增加線粒體動力樣蛋白(dynamin-like protein1,Drp1)磷酸化以促進線粒體過度裂變,最終損害線粒體功能,導致心臟損傷[48]。此外,DOX誘導FoxO1上調(diào),通過與其啟動子位點結(jié)合抑制Mfn2轉(zhuǎn)錄和線粒體融合,而靶向Mfn2介導的線粒體融合術(shù),顯示出防御DOX誘導的心臟毒性及通過代謝轉(zhuǎn)移來提高抗腫瘤的效力[49]。這提示線粒體融合和裂變過程中或許存在多種轉(zhuǎn)錄因子和生長因子參與DOX化療,以發(fā)揮保護心功能和抗癌的雙重優(yōu)勢。

燧心膠囊(藥物組成:附子、紅參、熟地黃、麥冬、丹參、茯苓、白術(shù)、澤瀉)可溫腎助陽以引火歸元、化氣行水,郭丹丹等[50]發(fā)現(xiàn)中、高劑量組燧心膠囊能有效改善心衰大鼠的線粒體數(shù)目、線粒體嵴形態(tài),促進Mfn1、Mfn2 mRNA和蛋白表達,增強線粒體融合、代謝以減輕其功能障礙。史有陽等[51]發(fā)現(xiàn)木犀草素能促進大鼠H9c2心肌細胞MIEF1表達及Drp1蛋白Ser637位點磷酸化,阻止線粒體過度分裂,抑制線粒體Caspase-3凋亡信號通路的激活。DING等[52]發(fā)現(xiàn)芍藥醇通過激活Stat3磷酸化直接與Mfn2啟動子結(jié)合,上調(diào)PKCε轉(zhuǎn)錄表達,促進MFN2介導的線粒體融合,以保護DOX的心臟毒性和抗癌活性。中醫(yī)藥介導其他信號通路以參與線粒體融合和裂變的途徑有待進一步探究。

4.2 自噬和凋亡

自噬和凋亡是心臟穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)環(huán)節(jié),能夠提高心臟對壓力過激的適應力。如果缺乏有效及時地清除,損傷線粒體的積累會誘導心肌細胞死亡,對心功能造成不可逆的傷害。實驗發(fā)現(xiàn),DOX上調(diào)大鼠Bax/Bcl-2 mRNA表達比,升高Bax和半胱天冬酶-3蛋白表達及TUNEL陽性核,病理檢查顯示左、右心室出現(xiàn)間質(zhì)膠原纖維增加且結(jié)蛋白表達紊亂,說明線粒體誘導的凋亡途徑被激活并造成心室損傷[53]。

中藥可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白,以介導線粒體自噬凋亡途徑。體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),西紅花酸能顯著降低ROS水平,減輕氧化損傷造成的線粒體膜電位降低,增強Bcl-2同時降低Bax表達,抑制DOX誘導的細胞凋亡,提高H9c2細胞存活率[54]。在DOX誘導的大鼠心力衰竭模型中,參芪利心湯通過上調(diào)PGC-1αm RNA表達,升高ATP含量,雙向調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因,即兼顧升高Bcl-2表達,與降低Bax、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) mRNA、p53表達,促進線粒體生物合成以逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)[55]。譚娜等[56]發(fā)現(xiàn),20、40 mg/kg芍藥苷組和右丙亞胺組均能顯著抑制雄性SD大鼠因DOX氧化應激誘導的心肌凋亡,推測與減少線粒體Cyt c釋放至細胞漿,降低Caspase-3表達有關(guān)。體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),積雪草酸呈現(xiàn)濃度依賴趨勢增加線粒體膜通透性,激活線粒體凋亡程序,促進Cyt C被釋放,對乳腺癌4T1細胞增殖抑制效果顯著;同時提高胞內(nèi)ROS水平,誘導凋亡蛋白Bax表達[57]。

然而,線粒體自噬在DOX心臟毒性中的作用存在矛盾結(jié)論[58]。這可能與缺乏特異性及系統(tǒng)的統(tǒng)計方法、線粒體損傷程度、潛在的年齡差異等多因素相關(guān)。調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路被推測是化療藥物毒性應激引發(fā)的關(guān)鍵介質(zhì)[59]。研究發(fā)現(xiàn),人參糖蛋白能上調(diào)Sirt3和Bcl-2蛋白表達水平、下調(diào)Bax蛋白表達水平、減少Cyt c釋放以及Caspase-3 裂解、調(diào)節(jié)MAPK通路,從而有效減少DOX誘導的H9c2心臟細胞凋亡[60]。香青蘭總黃酮可以調(diào)控MAPK、PISK/ Akt通路及下游凋亡分子的表達,以保護DOX損傷細胞[61]。黑芥子苷明顯降低Bax水平,抑制p38、JNK磷酸化,升高Bcl-2表達水平,介導p38/JNK MAPK信號通路,減少心肌細胞凋亡,緩和DOX誘導的心臟毒性[62]。

對于現(xiàn)代醫(yī)學無法確定線粒體自噬對癌癥或DOX心臟毒性進展是驅(qū)動或抑制作用,中藥顯示出雙向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢,在不同病理發(fā)展態(tài)勢上均可協(xié)助治療兩個極端變化,平衡陰陽,緩和病勢發(fā)展。

5 小結(jié)與展望

DOX引發(fā)的心臟毒性是化療藥物臨床治療的重大挑戰(zhàn),以線粒體為靶標的分子機制成為近年研究熱點。值得肯定的是,功能失調(diào)的線粒體與DOX心臟毒性的病理改變存在強烈的因果關(guān)系,修復線粒體功能有助于制約DOX心臟病的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)認為,氣血為能量之源,健脾益胃以調(diào)補氣血,可協(xié)助恢復線粒體的呼吸功能和能量代謝。DOX毒性易損心絡,心主血脈,血絡瘀滯,致心臟功能障礙[2]。故中醫(yī)藥干預以益氣、養(yǎng)陰、活血為主,加之辨證論治,在全面改善臨床癥狀、恢復甚至逆轉(zhuǎn)線粒體功能等方面上有獨特優(yōu)勢,但仍存在一些不足。首先,中醫(yī)藥抑制DOX心臟毒性損傷機制研究多集中在小樣本動物模型或H9c2心肌細胞模型,缺乏大規(guī)模的臨床改善率。其次,鑒于DOX對心臟損傷具有時間依賴性,且時間越久,損傷可逆轉(zhuǎn)性難度更大,中藥對不同成熟度的DOX誘導心肌細胞可能存在不同的藥物—通路—效應關(guān)系。其次,中藥機理研究大多偏向單一、直接,對主要信號通路的實驗研究較少,可能與設備限制、線粒體功能測量及信號因子的追蹤存在困難有關(guān)。期待中醫(yī)藥加強建立更科學的評價機制,構(gòu)建中醫(yī)學防治DOX心臟毒性的理論體系,促進中藥與分子細胞生物學結(jié)合發(fā)展,為臨床抗癌、開發(fā)新藥、減輕副反應提供思路。