白藜蘆醇/siRNA 膠束復(fù)合物的載藥和釋藥性能研究

賈 莉，苗 方，張衛(wèi)敏，安 蕓，董曉輝，馬 蘭

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

基聚乙二醇-聚丙交酯-聚組氨酸-（二硫鍵合）-聚乙烯亞胺（mPEG-b-PLA-PHis-ss-OEI）共聚物，利用OEI 與siRNA 之間的靜電作用力，制備并研究了單獨(dú)包載siRNA 的遞送系統(tǒng)[2]。由于共聚物中具有疏水嵌段PLA 和PHis，可包載疏水性中藥單體Res 和siRNA 形成膠束復(fù)合物MCpH/抗腫瘤治療中，利用納米載體共遞送藥物可實(shí)現(xiàn)腫瘤多靶點(diǎn)精準(zhǔn)靶向、高滲透性、快速高效的細(xì)胞攝取、降低毒副作用，達(dá)到協(xié)同抗癌作用[1]。然而，聯(lián)合遞送藥物的載藥和釋藥性能是共遞送藥物發(fā)揮抗腫瘤治療作用的前提和關(guān)鍵。本研究前期成功合成了pH 和還原性雙響應(yīng)功能的單甲氧Redox@Res-siRNA。本研究深入研究了MCpH/Redox@Res-siRNA 的載藥和釋藥性能，為其實(shí)現(xiàn)共遞送藥物應(yīng)用于抗腫瘤治療研究奠定了堅(jiān)實(shí)的制劑基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

DL-180 型超聲儀（浙江省象山縣石浦海天電子儀器廠）；超高速低溫離心機(jī)（美國貝克曼公司）； FA 1104 電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；TDL-16B 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微量移液器（美國Thermo 公司）；SPR-DT12A 藥物溶出度儀（天津賽普瑞實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪華儀器廠制造）。

MCpH/Redox@Res-siRNA（ 實(shí) 驗(yàn) 室 自制， 批 號20210103）；FAM-siRNA（ 上 海 吉瑪 制 藥 技 術(shù) 有 限 公 司，Sense strand5’-3’：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，5’-3’：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)；白藜蘆醇（純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司），Amicon?Ultra-4 超濾管（NMWL=50 kD）；透析袋（進(jìn)口分裝，上海綠鳥科技有限公司）；甲醇、乙腈、PBS 緩沖液等試劑（分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 Res 體外分析方法的建立[3]配制一定濃度的Res、FAM-siRNA 和空白膠束的溶液，以甲醇為空白對照，于200 ～ 800 nm 波長范圍內(nèi)掃描并繪制紫外-可見吸收光譜。Res 在306 nm 波長處有最大吸收，F(xiàn)AM-siRNA 和空白膠束在此處均無吸收，因此確定306 nm 為Res 的檢測波長。該方法專屬性符合要求。

取Res 適量，精密稱定后，配置成濃度約1.0 mg/mL 的Res 甲醇儲(chǔ)備液。精密量取Res 甲醇儲(chǔ)備液溶液適量，加甲醇溶液配置成系列濃度的Res 標(biāo)準(zhǔn)溶液。紫外分光光度法（檢測波長為306 nm）測定系列濃度Res 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值A(chǔ)，繪制吸光度值A(chǔ)-濃度C 標(biāo)準(zhǔn)曲線。取高、中、低濃度的Res 標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 份，測定日內(nèi)和日間精密度。取適量空白膠束和FAM-siRNA 混合溶液，加入適量Res 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定并計(jì)算回收率。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2.2 FAM-siRNA 體外分析方法的建立[4]取1 OD FAM-siRNA 粉末加入125 μL DEPC 水溶液溶解，配置成FAM-siRNA 儲(chǔ)備液。取適量的FAMsiRNA 儲(chǔ)備液，用DEPC 水溶液分別配置系列濃度的FAM-siRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用熒光分光光度法，選擇激發(fā)波長（Ex）為480 nm、發(fā)射波長（Em）為520 nm，測定各濃度FAM-siRNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度F，并繪制熒光強(qiáng)度F-濃度C 標(biāo)準(zhǔn)曲線。取高、中、低濃度的FAM-siRNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，測定日內(nèi)和日間精密度。取適量空白膠束和Res 混合溶液，加入適量FAM-siRNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定并計(jì)算回收率。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2.3 Res 包封率和載藥量測定 采用超速離心法分離 游 離Res，測 定MCpH/Redox@Res-siRNA 的包封率（EE%）和載藥量(DL%)。取適量MCpH/Redox@Res-siRNA 溶 液，于12 000 rpm 離心10 min 后，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜。精密吸取該溶液1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容后，按建立的“2.1 Res 體外分析方法”測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算Res 濃度，計(jì)算得MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 的 量。 另 取1.0 mL MCpH/Redox@Res-siRNA 溶 液，置 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，測定吸光度值A(chǔ)，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Res 濃度，得MCpH/Redox@RessiRNA 中Res 的總量，上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

其中：Wtotal 是制備時(shí)加入Res 的量，WRes和Wcopolymer 分別為膠束復(fù)合物中Res 和共聚物材料的量。

2.4 FAM-siRNA 包封率測定 采用超濾離心法測定MCpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 的包封率。精密吸取1.0 mL MCpH/Redox@Res-siRNA，加至Amicon? Ultra-4 超濾管（NMWL=30 kD）中，于6 000 rpm 離心10 min。精密吸取0.5 mL 管套中所得的濾液，用DEPC 水定容至10 mL，按建立的“2.2 FAM-siRNA 體外分析方法”，測定熒光強(qiáng)度F，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算游離FAM-siRNA 濃度。按下述公式計(jì)算FAM-siRNA包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

其中：ntotal 為加入FAM-siRNA 總量，nfree為未包裹入膠束復(fù)合物FAM-siRNA 量。

2.5 不同pH 及還原條件下膠束復(fù)合物的藥物觸發(fā)釋放行為[5]取MCpH/Redox@Res-siRNA 溶液2.0 mL，置于截留分子量為30 000 的透析袋中。采用溶出度測定儀，將透析袋固定在槳上，分別置于pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 的透析介質(zhì)中（PBS 緩沖溶液，200 mL，37±0.5℃），設(shè)置轉(zhuǎn)速1 000 rpm，按照事先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣，同時(shí)補(bǔ)充相同溫度和體積的新鮮透析介質(zhì)。按照Res 體外分析方法和FAM-siRNA 體外分析方法測定樣品中Res 和FAM siRNA 的含量，計(jì)算24 h 藥物累計(jì)釋放量，并繪制累計(jì)釋放曲線，上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用± s 表示。

3 結(jié)果

3.1 Res 體外分析方法的建立 Res 的體外分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.124C+0.0622，R2=0.9995，符合分析要求。測定高、中、低濃度的Res 溶液的日內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為（1.03±0.21）%、（4.95±1.06）%、（10.05±1.11）%；日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為（1.05±0.09）%、（5.01±0.05）%、（10.09±1.22）%，日內(nèi)和日間的精密度均良好，符合方法學(xué)要求。取適量空白膠束和FAM-siRNA混合溶液，加入適量Res 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定回收率為（99.5±1.75）%，符合方法學(xué)要求。

3.2 FAM-siRNA 體外分析方法的建立 FAMsiRNA 的體外分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為F=1083.7C-328.59，R2=0.9999，符合分析要求。測定高、中、低濃度的FAM-siRNA 溶液的日內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為（1.31±0.12）%、（5.35±0.87）%、（13.40±0.98）%；日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為（1.32±0.25）%、（5.36±0.95）%、（13.30±1.20）%，日內(nèi)和日間的精密度均良好，符合方法學(xué)要求。取適量空白膠束和Res 混合溶液，加入適量FAMsiRNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定回收率為（99.5±1.23）%，符合方法學(xué)要求。

3.3 膠束復(fù)合物的包封率和載藥量 采用超速離心法測定MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 包封率和載藥量分別為（92.2±1.74）%、（9.72±1.63）%。采用超濾離心法測定MCpH/Redox@Res-siRNA 的siRNA 包封率為（94.5±1.42）%。

3.4 膠束復(fù)合物的釋藥性能 MCpH/Redox@RessiRNA 中Res 在不同pH 及還原性條件下的累計(jì)釋放曲線如圖1A 所示，pH7.4 生理?xiàng)l件下，無明顯的凸釋現(xiàn)象，釋放曲線平緩。隨著pH 降低至5.5，Res 釋放速度明顯增加，2 h 的累計(jì)釋放量即達(dá)到了（43.8±4.23）%，表明MCpH/Redox@RessiRNA 的Res 釋放具有pH 敏感性，pH 降低，釋放速度和累積釋放量均顯著增加。而DTT 還原性條件對膠束復(fù)合物中Res 的釋放幾乎無影響。

圖1 MCpH/Redox@Res-siRNA 膠束復(fù)合物中Res 和siRNA 在 pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 條件下的累計(jì)釋放曲線（n=3）

MCpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 在 不 同pH 及還原性條件下的釋放行為如圖1B 所示。與Res 釋放行為不同，siRNA 的釋放呈現(xiàn)pH 和還原環(huán)境依賴性。在pH 5.5+DTT 環(huán)境中，siRNA 累積釋放量為（82.5±6.04）%。與正常生理環(huán)境（pH 7.4）相比，溶酶體環(huán)境（pH 5.5+20mM DTT）可顯著提高M(jìn)CpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 的累積釋放。

4 討論

4.1 MCpH/Redox@Res-siRNA 的載藥性能 Res是目前抗腫瘤治療中極具前景的中藥單體，具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性。由于白藜蘆醇口服生物利用度和在水中的溶解度均較低，限制其藥物的應(yīng)用[6]。本研究構(gòu)建的MCpH/Redox@Res-siRNA 具有mPEG為親水性外殼，PLA-PHis 為疏水性內(nèi)核的球形結(jié)構(gòu)。疏水性藥物Res 可以通過疏水作用包載于膠束內(nèi)核結(jié)構(gòu)，包封率和載藥量均較高。

siRNA 本身非常不穩(wěn)定，在血液中會(huì)被核酸酶降解，另外，siRNA 結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)磷酸酯鍵而帶有大量的負(fù)電荷，很難進(jìn)入到帶負(fù)電的細(xì)胞膜之內(nèi)[2]。膠束復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的PEI 嵌段具有多個(gè)亞胺正電荷，可與siRNA 通過靜電作用結(jié)合，將siRNA 包裹至膠束內(nèi)部，包封率較高。

4.2 MCpH/Redox@Res-siRNA 的釋藥性能 膠束復(fù)合物用于抗腫瘤藥物遞送，具有靶向性高、生物利用度高等獨(dú)特優(yōu)勢[7]。膠束復(fù)合物將藥物遞送至腫瘤細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，藥物只有在腫瘤細(xì)胞的溶酶體環(huán)境(pH 4.5～5.5，還原性)中快速釋放，才能發(fā)揮其抗腫瘤治療作用。MCpH/Redox@RessiRNA 結(jié)構(gòu)中的PHis 嵌段具有pH 敏感性。在酸性環(huán)境中，組氨酸結(jié)構(gòu)質(zhì)子化造成PHis 嵌段其由疏水-親水轉(zhuǎn)變，PHis 嵌段由疏水性膠束內(nèi)核向親水性膠束外殼遷移[8]，膠束內(nèi)核結(jié)構(gòu)紊亂，原來由疏水作用力包載至膠束內(nèi)核的Res，快速釋放。與此同時(shí)，與聚組氨酸嵌段相連的二硫鍵暴露，還原性環(huán)境致使其斷裂，實(shí)現(xiàn)siRNA 觸發(fā)釋放。

5 結(jié)論

本研究建立了紫外可見分光光度法測定Res和熒光分光光度法測定FAM-siRNA 的體外分析方法，并測定了MCpH/Redox@Res-siRNA 的包載性能。研究結(jié)果顯示MCpH/Redox@Res-siRNA 包載性能良好，可用于Res 和siRNA 的聯(lián)合遞送。MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 和siRNA 釋放行為結(jié)果表明，在正常生理?xiàng)l件下，MCpH/Redox@Res-siRNA 能夠穩(wěn)定包載Res 和siRNA，釋放速度較慢，而在腫瘤細(xì)胞溶酶體環(huán)境（酸性，還原性）中，MCpH/Redox@Res-siRNA 能夠快速響應(yīng)低pH 和還原性環(huán)境，均可以快速釋放Res 和siRNA，MCpH/Redox@Res-siRNA 具有良好的釋放性能。本研究為MCpH/Redox@Res-siRNA 用于抗腫瘤治療，提供了堅(jiān)實(shí)的制劑學(xué)基礎(chǔ)。