犬去黏膜回腸輸尿管新生黏膜上皮性質(zhì)鑒定

楊登浩,唐 文,沈 雷,趙澤駒

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 泌尿外科,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 外科手術學實驗室,貴州 遵義 563099)

輸尿管超過15 cm的缺損為輸尿管嚴重損傷,臨床上主要采用回腸代輸尿管治療[1]。其術后黏膜相關并發(fā)癥多以至改進不斷,裁剪去黏膜回腸代輸尿管前期研究顯示效果較好[2]。模型犬術后第3個月開始發(fā)現(xiàn)代輸尿管新生黏膜,形態(tài)類似小腸黏膜[3],部分樣本新生黏膜與小腸黏膜形態(tài)結(jié)構差異較大,存在鑒定必要性;MUC2、UPK2分別為腸黏膜杯狀細胞、尿路上皮細胞標記物;CK7、CK20在腸和尿路上皮中呈現(xiàn)不同表達,聯(lián)合檢測有助于上皮性質(zhì)鑒定,本實驗將通過檢測上述指標加以鑒別,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用比格犬9只(由重慶沃森生物技術有限公司提供);切片機、冷凍臺、漂烘儀、干燥箱、修復儀、脫色搖床、漩渦混勻儀、掌上離心機、移液槍、數(shù)字切片掃描儀、刀片、載玻片、蓋玻片;蘇木素染色劑、伊紅染色劑、蒸餾水、二甲苯、多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、檸檬酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAPI染色試劑、正常山羊血清、一抗(CK 7;ABclonal,A12004)、一抗(CK20,ABclonal,A0248)、一抗(MUC2;ABclonal,A14659)、一抗(UPK2;ABclonal,A10813)、二抗(FITC標記山羊抗兔,Servicebio,GB22303)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與取材 比格犬術前禁飲禁食12 h,3%戊巴比妥肌肉注射麻醉,麻醉生效后仰臥位固定,術區(qū)備皮,消毒鋪巾。經(jīng)腹正中,從劍突至恥骨聯(lián)合上方約4 cm進入腹腔,打開后腹膜,分離左側(cè)腎蒂,止血鉗鉗夾腎蒂,切除左腎,4號絲線縫扎腎蒂近端;分離右側(cè)輸尿管,將輸尿管與腎盂、膀胱連接處分別剪斷,切除輸尿管,膀胱輸尿管殘端結(jié)扎,形成輸尿管全段缺損。據(jù)回盲部15 cm處取帶蒂回腸約15 cm,回腸斷端端端吻合,檢查無漏后,連續(xù)縫合腸系膜裂口;帶蒂回腸段用0.5%碘伏沖洗,18 F尿管結(jié)扎阻斷帶蒂回腸段系膜血管,電刀沿腸系膜血管對側(cè)縱向切開腸管,再次0.5%碘伏沖洗腸腔,留取部分回腸作為陽性對照組,裁剝法去除其黏膜層及黏膜下層,留取部分組織作為陰性對照組,將F5雙“J”管放置于腸腔面,3-0可吸收線連續(xù)縫合為管狀,其近端與腎盂吻合,遠端與膀胱吻合,松開系膜血管;觀察見尿液至造瘺流出,檢查腹腔未見尿瘺、腸瘺及活動性出血后,逐層關閉腹腔,術后7 d連續(xù)肌肉注射頭孢唑林抗感染,術后1月拔出雙J管,術后3、6、12月分別選取3只比格犬處死,留取去黏膜回腸輸尿管樣本作為實驗組,按取材月份將實驗組樣本分為術后3、 6、 12月組,10%甲醛溶液固定保存(圖1)。

A:術中開始剝脫黏膜;B:術中回腸輸尿管成形。圖1 比格犬建模效果

1.2.2 HE染色 將組織樣本放入裝有液態(tài)石蠟的模具中固定,用切片機制備5 μm切片并于40 ℃水浴鍋中舒展撈片,切片置于80 ℃烤箱烘干,然后將切片至于二甲苯中脫蠟,脫蠟后將切片放入乙醇溶液中水化,隨后用PBS溶液洗片,最后通過蘇木素及伊紅染色,封片后采集圖像及分析。

1.2.3 免疫熒光 參照免疫熒光實驗方法,檢測各時段樣本MUC2、UPK2、CK7和CK20表達,石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15 min,二甲苯Ⅱ 15 min,二甲苯Ⅲ 15 min,無水乙醇Ⅰ5 min;無水乙醇Ⅱ5 min,85%酒精5 min,75%酒精5 min,蒸餾水洗;抗原修復:將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐高火加熱10 min,停火8 min,中高火再加熱10 min;冷卻后,PBS洗3次,每次5 min;血清封閉:滴加山羊血清封閉液,室溫20 min;滴加一抗(一抗?jié)舛葹?CK7 1∶100;CK20 1∶100;MUC2 1∶100;UPK2 1∶50),4 ℃過夜;PBS洗3次,每次5 min;滴加與一抗同源二抗(稀釋比1∶100),37 ℃ 30 min;PBS洗3次,每次5 min;滴加DAPI,室溫孵育10 min;PBS洗3次,每次5 min;使用顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集,每張切片先于100倍下觀察全部組織,再分別采集200倍顯微圖像,共采集3個視野。采用Image-J圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的熒光強度和面積,并計算每張圖像的平均熒光強度,使用3張圖像的平均熒光強度再計算平均數(shù),得出每例樣本的平均熒光強度。DAPI染細胞核為藍色,CK7、CK20、MUC2、UPK2顯示出的陽性表達均為綠色。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 術后2 d 1只犬死亡,購買比格犬造模補充,2只犬腹部切口紅腫、溢膿,給與清創(chuàng)縫合后愈合;術后3、6、12月解剖觀察見腹腔輕度粘連、無積液、積膿;新輸尿管光滑、完整,無瘢痕、漏口;腎臟無增大,腎盂無擴張;新輸尿管腔面光滑、通暢,無瘢痕及潰瘍。

2.2 HE染色 陽性對照組回腸結(jié)構完整、層次清晰,由內(nèi)向外分為黏膜層、黏膜下層、肌層與漿膜層(圖2A)。陰性對照組黏膜剝脫干凈,黏膜下層、肌層和漿膜層結(jié)構完整(圖2B);實驗組術后3、6、12個月均見新生黏膜,其形態(tài)各異,但其有許多共同點與陽性對照組(正?；啬c黏膜)相似,即黏膜層均向腸腔突出,形成小腸的特征性結(jié)構小腸絨毛狀結(jié)構(圖2C～E)。

A:陽性對照組;B:陰性對照組;C:術后3月組;D:術后6月組;E:術后12月組。圖2 對照組回腸與實驗組去黏膜回腸HE染色結(jié)果對比

2.3 免疫熒光 陽性對照組與術后3、6、12月組CK7陰性表達(圖3 A～D),CK20陽性表達(圖3 E～H),UPK2陰性表達(圖3 I～L),MUC2陽性表達(圖3 M～P)。與陽性對照組相比,術后3月組CK20表達明顯降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陽性對照組與術后6、12月組相比,CK20表達量未見明顯差異,無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1);與陽性對照組相比,術后3月組MUC2表達明顯降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),陽性對照組與術后6、12月組相比,MUC2表達量未見明顯差異,無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

表1 CK20平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果

表2 MUC2平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果

A～D:陽性對照組與術后3、6、12月組相比,CK7的表達情況(免疫熒光,×200); E～H:陽性對照組與術后3、6、12月組相比,CK20的表達情況(免疫熒光,×200);I～L:陽性對照組與術后3、6、12月組相比,UPK2的表達情況(免疫熒光,×200);M～P:陽性對照組與術后3、6、12月組相比,MUC2的表達情況(免疫熒光,×200)。圖3 各組裁剪去黏膜回腸輸尿管CK7、CK20、UPK2和MUC2的表達情況

3 討論

臨床上長段輸尿管損傷(>15 cm)時有發(fā)生,治療較為棘手,目前多采用回腸代輸尿管[4]。但術后梗阻、電解質(zhì)紊亂等黏膜相關并發(fā)癥長期困擾著患者和醫(yī)生。裁剪去黏膜回腸代輸尿管實驗顯示黏膜相關并發(fā)癥顯著減少[5],延長模型犬飼養(yǎng)時間,術后3個月起HE染色觀察到代輸尿管新生黏膜長出,隨時間延長逐漸類似小腸黏膜[3],部分樣本新生黏膜與小腸黏膜層形態(tài)結(jié)構差異較大。為明確再生黏膜的性質(zhì)和推測其可能的來源,檢測黏膜上皮部分標記物,以期望通過標記物的組合表達論證其屬性,將有助于探究新生黏膜出現(xiàn)的可能來源及機制,為裁剪去黏膜回腸代輸尿管提供理論支持。

上皮組織細胞標記物較多,本實驗用回腸裁剪去黏膜代輸尿管,再生黏膜來源于腸黏膜隱窩處干細胞和尿源性干細胞分化的可能性較大,上皮組織細胞標記物在腸黏膜上皮和尿路上皮細胞中特異性表達的相對較少,并以CK7、CK20、MUC2和UPK2為常見。

CK7、CK20是細胞角蛋白家族中的成員,為構成細胞骨架的重要物質(zhì)。CK7 存在于大多數(shù)上皮組織和尿路上皮細胞中,在胃腸黏膜上皮細胞中不表達[6],CK20存在于正常的胃腸道黏膜上皮、尿路上皮等細胞中[7],CK7、CK20的聯(lián)合表達被廣泛應用與上皮細胞、上皮組織來源腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤組織類型的鑒別[8-9],CK7-/CK20+提示該組織為胃腸上皮組織的可能性大,CK7+/CK20+則提示該組織或腫瘤可能為尿路上皮,但其特異性不足,通常需聯(lián)合其它特異性標記物聯(lián)合評估[7,10-11]。為更準確鑒別新生黏膜為腸黏膜上皮還是尿路上皮細胞,故增加其各自的特異性免疫標志物尿路上皮細胞分化特異性糖蛋白2(uroplakin2,UPK2)和粘蛋白2(mucin2,MUC2),將有助于提高檢測的特異性[12-13],本次實驗通過上述指標的檢測辨別新生黏膜的組織類型。

研究結(jié)果顯示,HE染色觀察見新生黏膜存在小腸絨毛狀結(jié)構,其類似于小腸黏膜,免疫熒光顯示新生黏膜上皮CK7-/CK20+提示該組織為腸黏膜上皮可能性大,同時結(jié)合MUC2陽性表達,UPK2陰性表達,說明新生黏膜上皮為腸黏膜上皮。與對照組相比,術后3月組CK20表達明顯降低(P<0.05),對照組與術后6、12月組CK20表達量未見明顯差異(P>0.05);與對照組相比,術后3月組MUC2表達明顯降低(P<0.05),對照組與術后6、12月組MUC2表達量未見明顯差異(P>0.05);表明裁剪去黏膜后1～6月新生黏膜開始逐漸長出并不斷成熟,6月后新生黏膜發(fā)育成熟。

上述結(jié)果說明回腸黏膜剝脫后發(fā)生了再黏膜化,新生黏膜為腸黏膜上皮,其機制可能為回腸黏膜層剝脫時,凹進黏膜下層及基底層的隱窩的腸干細胞(intestinal stem cells,ISC)未被剝脫消除,且腸壁黏膜下層、肌層、漿膜層結(jié)構基礎尚存,故可能由殘存的隱窩腸干細胞分化而來[14-16]。是否存在其它上皮再生的可能性目前尚不清楚,理論上去黏膜的代輸尿管腔面黏膜下層具備細胞載體功能,存在尿源性干細胞定植和循環(huán)干細胞歸巢可能性,還需在今后的實驗中做進一步探究。