復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒的制備與鑒別及促小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的研究

陳躍玲,陳一川,羅 婷,王艷梅,陳 霞,范光忠,郭步伐,楊德志,孫成新

(1.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,貴州 畢節(jié) 551700;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 遵義 563099;3.畢節(jié)市中醫(yī)院,貴州 畢節(jié) 551701)

瘰疬最早出現(xiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的《靈樞·寒熱》篇:“寒熱瘰疬在于頸腋者,皆何氣使生?”“此皆鼠瘺寒熱之毒氣也,留于脈而不去者也”[1]。瘰疬是一種常見的、慢性的感染性外科疾病,多生長(zhǎng)于頸部,累累如串珠,歷歷可數(shù)。該病在體弱兒童或青年女性中尤為常見,多因肺腎陰虛,肝氣久郁,虛火內(nèi)灼,煉液為痰,或受風(fēng)火邪毒侵?jǐn)_,痰火結(jié)于頸 、項(xiàng)、腋、胯之間而成[2-5]。瘰癘前期氣血兩虛,后期陰虛火旺,免疫力低下。前期治則疏肝養(yǎng)血、理氣化痰,后期滋陰降火、補(bǔ)氣健脾,調(diào)節(jié)免疫力。復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒為臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)方。該方由黃芪、太子參、山藥、白術(shù)、茯苓、貓爪草、皂角刺等十幾味藥材組成。方中君藥黃芪、太子參具有補(bǔ)氣健脾,增強(qiáng)免疫功效,貓爪草、皂角刺等疏肝清熱,解毒消腫、破瘀散結(jié)為臣藥,佐藥銀柴胡、青蒿以及牡蠣能清虛熱、除疳熱以及滋陰,建曲、山楂與麥芽等具有消食化積 、健脾開胃之功效,使藥甘草能清熱解毒并調(diào)和諸藥。該方臨床多用于治療瘰疬和小兒免疫功能調(diào)理。經(jīng)過30多年臨床實(shí)踐,在中醫(yī)院從組方至今,累計(jì)病例30 000余次。該方在逆轉(zhuǎn)小兒瘰疬病情發(fā)展、消除臨床癥狀體征、改善精神飲食狀況、增強(qiáng)免疫功能(包括濫用抗生素致免疫功能低下者)等方面療效確切[6-8]。本文對(duì)復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒制備工藝、薄層鑒別以及該復(fù)方顆粒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外增殖的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥、試劑 黃芪、太子參、白術(shù)、山藥、貓爪草、皂角刺、青蒿等藥材由畢節(jié)市碧水星苑健康阿鹿診所有限公司提供,由遵義醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室楊建文主任鑒定,均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020版一部規(guī)定;黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):Yz081320)、甘草對(duì)照藥材(批號(hào):121626-201803)、皂角刺對(duì)照藥材(批號(hào):121210-201504)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒(實(shí)驗(yàn)室自制);去黃芪顆粒樣品、去甘草顆粒樣品、去皂角刺顆粒樣品(實(shí)驗(yàn)室自制);磷酸鹽緩沖液(PBS,北京索萊寶科技有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(蘭杰柯科技有限公司);動(dòng)物脾淋巴細(xì)胞分離提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);脂多糖(LPS,Sigma公司);無水乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚(60～90℃)、乙醚、乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲酸等均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);薄層層析硅膠板(青島海洋化工)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性昆明小鼠,6～8周齡,體重16～20 g,購買于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):生產(chǎn)SCXK(渝)2017-0007。

1.1.3 主要儀器 SQP分析天平(賽多利斯);CM-RO-C2實(shí)驗(yàn)室超純水儀(寧波丹斯博頓);JET-6000冷凍干燥機(jī)(恒諾利興);DZF-250真空干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào));HYDJ20L煎藥機(jī)(天津華延園);KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器);FRESCO17冷凍高速離心機(jī)(Thermo);WCI-180二氧化碳培養(yǎng)箱(BIO-RAD);800TS酶標(biāo)儀(BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 采用水提工藝,以水為溶劑提取藥材有效成分,料液比使用20∶1(v/w)、10∶1(v/w)以及5∶1(v/w)煎煮提取3次,分別為3、2、1 h,合并提取濾液,濃縮并冷凍干燥成粉末狀。

1.2.2 濕法制粒工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 把上述提取的凍干粉與一定比例的可溶性淀粉混勻,加入0.5%阿斯巴甜矯味劑,將乙醇作為潤(rùn)濕劑制軟材,以“手握成團(tuán),輕壓即散”為標(biāo)準(zhǔn),2號(hào)藥篩擠壓過篩制粒,60 ℃烘干,即得。

采用正交實(shí)驗(yàn)法篩選制粒工藝,以成型率、吸濕率以及休止角三者作為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察可溶性淀粉與原料配比、乙醇濃度以及乙醇用量3個(gè)因素,每種因素選擇3個(gè)參考水平,設(shè)計(jì)L9(33)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),通過方差分析評(píng)價(jià)出最優(yōu)成型工藝。成型工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 成型工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 成型率 按2020年版《中國(guó)藥典》四部0104顆粒劑項(xiàng)下粒度檢查法[9]進(jìn)行測(cè)定,收集通過1號(hào)篩而不能通過5號(hào)篩的合格顆粒,稱重,過篩前顆粒質(zhì)量記為m1,合格顆粒質(zhì)量記為m2,并計(jì)算成型率。成型率計(jì)算公式:成型率(%)=m2/m1×100%。

1.2.3.2 吸濕率 按照文獻(xiàn)操作[10],在干燥器內(nèi)放入適量的過飽和氯化鈉溶液,密封48 h,將復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒置于稱量瓶中,厚約2 mm,精密稱定顆粒重為m1′,置于60 ℃烘箱中干燥至恒重,然后將稱量瓶瓶蓋打開后置于干燥器內(nèi)于48 h后精密稱定吸濕后的顆粒重記為m2′,根據(jù)以下公式計(jì)算吸濕率:吸濕率(%)=( m2′-m1′)/ m1′×100%。

1.2.3.3 休止角 將3只漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上方3 cm高處,將顆粒從最上方漏斗靠壁處小心倒入,坐標(biāo)紙上的顆粒圓錐體頂部接觸到下端漏斗口為止,測(cè)出坐標(biāo)紙上圓錐體底部的直徑(2 r),設(shè)顆粒圓錐體高度為H,計(jì)算休止角(tan α),平行測(cè)定3次,取平均值。計(jì)算公式為:tan α=H/r。

1.2.4 成型工藝驗(yàn)證方法 按照上述正交實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)制粒工藝平行制備3批顆粒劑,分別測(cè)定成型率、吸濕率與休止角。

1.2.5 薄層色譜研究

1.2.5.1 甘草 ①稱取復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒細(xì)粉10 g,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃),超聲30 min(超聲功率20 000 Hz),將溶液4 000 r/min離心10 min,揮干石油醚。加入50 mL甲醇,超聲提取60 min(超聲功率20 000 Hz),分液漏斗過濾,濾液減壓蒸干,加入10 mL氨試液溶解殘?jiān)?轉(zhuǎn)移至分液漏斗,加入20 mL水飽和正丁醇溶液進(jìn)行萃取,收集正丁醇層,重復(fù)萃取3次,合并醇層,減壓濃縮蒸干,加入2 mL甲醇溶解制樣備用;②稱取去甘草顆粒樣品細(xì)粉10 g,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃),超聲30 min(超聲功率20 000 Hz),后續(xù)同法處理;③稱取甘草對(duì)照藥材2 g,加入20 mL石油醚(60～90 ℃),超聲30 min(超聲功率20 000 Hz),后續(xù)同法處理;④用毛細(xì)管各取上述3種溶液5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以三氯甲烷-甲醇-水(12.5∶6.5∶2)的下層溶液為展開劑進(jìn)行展開,晾干后噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃烘箱內(nèi)加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在日光和365 nm紫外光下觀察。

1.2.5.2 皂角刺 ①稱取復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒細(xì)粉10 g,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL二氯甲烷,超聲60 min(超聲功率20 000 Hz),分液漏斗過濾,濾液減壓蒸干,加入1 mL甲醇溶解制樣備用。②稱取去皂角刺顆粒樣品顆粒細(xì)粉10 g,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL二氯甲烷,超聲60 min(超聲功率20 000 Hz),分液漏斗過濾,濾液減壓蒸干,加入1 mL甲醇溶解制樣備用。③稱取皂角刺對(duì)照藥材2 g,加入20 mL二氯甲烷,超聲60 min(超聲功率20 000 Hz),分液漏斗過濾,濾液減壓蒸干,加入1 mL甲醇溶解制樣備用。④用毛細(xì)管各取上述3種溶液5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(7∶3)為展開劑進(jìn)行展開,晾干后噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃烘箱內(nèi)加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在日光和365 nm紫外光下觀察。

1.2.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) ①現(xiàn)殺取小鼠脾臟組織,稱重,磨碎并用150目尼龍紗布過濾,離心獲得小鼠脾淋巴細(xì)胞;②將分離好的小鼠脾淋巴細(xì)胞用1640培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×106個(gè)/ mL,于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔100 μL細(xì)胞懸液,除空白組外,每孔加入終濃度為20 μg/mL的LPS,培養(yǎng)條件為37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中;③用不含血清的1640培養(yǎng)基將復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒細(xì)粉濃度配制成5、10、20、40、80、160 、320、640、1 280 μg/mL,分別將不同濃度的復(fù)方顆粒加入到小鼠脾淋巴細(xì)胞中,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔,另設(shè)置1組空白對(duì)照組和LPS對(duì)照組,同樣條件培養(yǎng)72 h;④向培養(yǎng)48 h的細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入20 μL CCK-8,放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)3 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 成型工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析 按照以下公式計(jì)算綜合評(píng)分:

綜合評(píng)分=[(成型率/最大成型率)/3+(最小吸濕率/樣品吸濕率)/3+(最小休止角/休止角)/3]×100。

對(duì)顆粒成型工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行極差與方差分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果的綜合評(píng)分進(jìn)行極差分析,優(yōu)化出最佳成型工藝為A2B2C2,即可溶性淀粉與提取凍干粉用量1∶1, 使用70%的乙醇,乙醇占凍干粉的重比為50%,正交實(shí)驗(yàn)方案分析與方差分析結(jié)果分別見表2、表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案分析

表3 綜合評(píng)分的方差分析

2.2 成型工藝驗(yàn)證 利用篩選出的最優(yōu)制粒工藝平行制備的3批顆粒劑,檢測(cè)得到成型率(%)、吸濕率(%)、休止角(°)。 結(jié)果顯示篩選優(yōu)化得到的制劑成型工藝穩(wěn)定可行(表4)。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3 薄層色譜鑒定結(jié)果

2.3.1 甘草 在可見光與365 nm紫外光下觀察可以看到,供試品薄層色譜在對(duì)應(yīng)位置上,與甘草對(duì)照藥材顯示相同的黃色斑點(diǎn)與黃色熒光斑點(diǎn),且去甘草陰性對(duì)照無此斑點(diǎn)。結(jié)果如圖1所示。

A:日光燈下觀察;B:365波長(zhǎng)紫外光下觀察;1:復(fù)方顆粒;2:去甘草陰性復(fù)方顆粒;3:甘草對(duì)照藥材。圖1 復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒甘草薄層鑒別

2.3.2 皂角刺 在可見光與365 nm紫外光下觀察可以看到,供試品薄層色譜在對(duì)應(yīng)位置上,與皂角刺對(duì)照藥材顯示相同的紫色斑點(diǎn)與黃色熒光斑點(diǎn),且去甘草陰性對(duì)照無此斑點(diǎn)。結(jié)果如圖2所示。

A:日光燈下觀察;B:365波長(zhǎng)紫外光下觀察;1:復(fù)方顆粒;2:去皂角刺陰性復(fù)方顆粒;3:皂角刺對(duì)照藥材。圖2 復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒皂角刺薄層鑒別

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,與空白組比較,復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h增殖影響是隨著濃度增大OD值逐漸增加,但當(dāng)濃度到達(dá)一定程度時(shí)(40 μg/mL),OD值不再增加,當(dāng)高于640 μg/mL時(shí)OD值反而下降,這可能是復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用(P<0.01,n=5),但當(dāng)濃度增大到一定值時(shí),因?yàn)槟承┙M分的存在反而抑制了小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。

A:復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響的OD值變化;B:復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞活力影響;**:與CON組相比,P<0.01;n=5。圖3 復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞48 h增殖影響

3 討論

淋巴細(xì)胞是機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞,多聚集于脾臟,其活化、增殖、分化對(duì)免疫應(yīng)答過程十分重要,可以通過增加脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)來提高機(jī)體的免疫功能。LPS是B淋巴細(xì)胞的有絲分裂原,本項(xiàng)目使用LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分化B淋巴細(xì)胞,檢測(cè)幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,從而反映其對(duì)免疫調(diào)節(jié)水平的影響[11]。瘰癘(淋巴結(jié)核)的發(fā)病與免疫互為因果,當(dāng)機(jī)體免疫功能減弱時(shí),可導(dǎo)致內(nèi)源性感染復(fù)發(fā)而發(fā)病,進(jìn)一步抑制免疫功能。兒童時(shí)期,尤其是嬰兒時(shí)期臟腑嬌嫩,衛(wèi)外不固,易于發(fā)生脾胃疾病、肺系疾病和時(shí)行疾病,對(duì)各種傳染病都有較高的易感性。本實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的CCK-8結(jié)果顯示,復(fù)方顆粒在10～320 μg/mL的濃度下均能夠顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,與空白組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),表明復(fù)方顆粒能促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖,從而提高機(jī)體免疫功能。

本研究開發(fā)了一種治療中醫(yī)瘰疬和調(diào)節(jié)免疫力的復(fù)方顆粒,采用正交實(shí)驗(yàn)法以成型率、吸濕率和休止角為考察指標(biāo),優(yōu)化了可溶性淀粉配比、乙醇濃度以及乙醇用量制備工藝,最終確定輔料可溶性淀粉比與提取粉末用量比為1∶1,使用70%的乙醇作為潤(rùn)濕劑,乙醇占凍干粉的重比為50%,加入0.5%阿斯巴甜矯味劑進(jìn)行制軟材, 過2號(hào)篩擠壓過篩制粒,60 ℃烘干,得到復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒;對(duì)成型工藝驗(yàn)證,結(jié)果顯示優(yōu)化得到的成型工藝穩(wěn)定可行;經(jīng)薄層色譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究,可以確定復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒中甘草與皂角刺的薄層專屬性鑒別條件與方法,建立了斑點(diǎn)分離效果好、斑點(diǎn)清晰且無其他成分干擾,顯色效果佳的薄層色譜方法。通過小鼠脾淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖,說明其能夠通過影響淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該復(fù)方制劑的開發(fā)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及初步的免疫活性進(jìn)行了初探, 為進(jìn)一步開發(fā)復(fù)方幺川調(diào)免消瘰顆粒奠定了良好的基礎(chǔ),也為老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方建立完整的質(zhì)量體系以及藥效學(xué)研究提供依據(jù)。