全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜解析五糧液原酒中揮發(fā)性組分的特征研究

劉志鵬，楊康卓，何張?zhí)m，趙 東，鄭 佳

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

五糧液是我國多糧濃香型白酒的典型代表，是中國地理標志白酒之一。五糧液具有香氣悠久、味醇厚、入口甘綿、入喉凈爽、各味協(xié)調(diào)、恰至好處的獨特酒體風格[1-3]。5 種糧食配方、包包曲、跑窖循環(huán)、雙輪底發(fā)酵、分層起糟、分層蒸酒、量質(zhì)摘酒、沸點量水等獨創(chuàng)優(yōu)秀的釀造工藝賦予了五糧液原酒優(yōu)良的品質(zhì)[4]。五糧液的酒體風格與原酒的品質(zhì)息息相關(guān)，解析五糧液原酒中的揮發(fā)性組分對五糧液酒體品質(zhì)穩(wěn)定具有重要意義。

五糧液中的揮發(fā)性成分十分復雜，研究報告稱在五糧液中已發(fā)現(xiàn)超過3000 種化合物[5]。但是關(guān)于五糧液原酒揮發(fā)性組分的研究較少。氣相色譜質(zhì)譜儀（gas chromatography mass spectrometry,GCMS）作為風味研究中常用的分析手段，由于其峰容量有限，分離度不足，單次分析往往只能檢測出近一百種組分。面對五糧液如此復雜的基質(zhì)，傳統(tǒng)一維GC-MS 無法滿足分析要求。全二維氣相色譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography,GC×GC）將兩根不同極性的色譜柱連接起來，分析物從一維色譜柱流出后進入二維色譜柱進行二次分離，大大提高了分離度和峰容量。目前該技術(shù)在白酒風味研究中得到更多應用[5-7]，能分析檢測出數(shù)百種甚至上千種組分。飛行時間質(zhì)譜儀(timeof-flight mass spectrometry,TOF-MS)具有掃描速度快和靈敏度高的優(yōu)點。全二維氣相色譜結(jié)合飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）將是實現(xiàn)復雜樣品揮發(fā)性組分分離鑒定的有力工具。

王露露等[7]在基于GC×GC-TOFMS 分析白酒微量組分的研究中，比較了不同前處理方法對白酒中揮發(fā)性組分的富集濃縮效果，發(fā)現(xiàn)通過頂空固相微萃?。╤ead space solid phase micro extraction,HSSPME）技術(shù)檢測到的揮發(fā)性組分數(shù)量最多。本研究采用HS-SPME技術(shù)富集濃縮五糧液原酒中的揮發(fā)性組分，隨后經(jīng)過GC×GC-TOFMS 分離鑒定，準確鑒定酒樣中的揮發(fā)性組分，進一步加強了對五糧液原酒揮發(fā)性組分的認識。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣采集：實驗原酒采集自五糧液股份有限公司釀酒車間，所選窖池窖齡在40 年以上，選取中層糟醅上甑蒸餾，酒頭收集1 個樣品，原酒收集3個樣品，酒尾收集1個樣品，每個酒樣取20 mL。

試劑及耗材：用于定性的標準品均為色譜純，Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，TCIAmerica(Port-land，OR，USA)；C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴和乙醇(色譜級)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；NaCl(化學純)，中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：超純水儀，Millipore 公司；50/30 μm的DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭（2 cm），美國Supelco 公司；全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀(GC×GC-TOFMS,Pegasus 4D)，美國LECO 公司；7890A 氣相色譜儀和一維色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；二維色譜柱Rxi-17SilMS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Restek公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)試驗方法

實驗方法按照本實驗室開發(fā)的方法進行。取適量酒樣用飽和氯化鈉水溶液稀釋到4%酒精度，取1 mL 稀釋后的酒樣在50 ℃下平衡15 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速設置為400 r/min。萃取富集后于GC進樣口在250 ℃下解吸附5 min，分流比為5∶1，隨后進行GC×GC-TOFMS 分析。每個樣品在相同條件下進樣3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS分析方法

進樣口溫度250 ℃，一維柱箱起始溫度45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min；第2 個柱箱全程保持比一維柱箱高5 ℃；調(diào)制補償溫度20 ℃；調(diào)制周期為4 s（熱脈沖時間0.8 s)。色譜柱采用恒流模式，載氣為高純氦氣(純度＞99.999%)，流速為1 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源電壓為-70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，檢測器電壓為1500 V，采集質(zhì)量數(shù)范圍為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗采集的TOFMS 數(shù)據(jù)由LECO 公司軟件ChromaTOF 進行解圖處理。自動識別信噪比大于100的色譜峰，進行自動解卷積和質(zhì)譜庫比對，質(zhì)譜庫為NIST 2014 和Wiley 9。篩選相似度大于800的化合物，并剔除沒有風味貢獻的胺類、腈類和烷烴類等化合物，作為初步鑒定結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，相同色譜條件下分析一系列正構(gòu)烷烴(C7-C30)，確定每個化合物的一維色譜柱保留指數(shù)，并與文獻報道的保留指數(shù)進行比對確認，偏差在30 以內(nèi)的化合物作為可信度較高的結(jié)果[7-9]。通過在模擬酒溶液中添加真實標準品，對比樣品與模擬酒溶液中色譜峰的一維時間和二維時間，篩選一維時間偏差在4 s 內(nèi)(1 個調(diào)制周期)，二維時間偏差在0.1 s 內(nèi)的組分作為最終的鑒定結(jié)果。將5 個酒樣中鑒定出的揮發(fā)性組分合并為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 原酒中的風味物質(zhì)分析

2.1.1 全二維氣相色譜在白酒風味分析中的優(yōu)勢

白酒復雜的香氣是由上千種香氣組分共同決定的[10]。白酒中香氣組分主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、縮醛類、呋喃類、酚類、萜烯類、內(nèi)酯類、芳香類化合物以及含氮、含硫化合物等，這些組分的揮發(fā)性和極性等性質(zhì)存在著顯著差異，因此可以通過氣相色譜進行分離鑒定[6，11-12]。傳統(tǒng)一維氣相色譜作為目前白酒風味分析的常用技術(shù)，存在著峰容量和分離能力較低的缺點，分析研究中往往只能檢測出幾十種揮發(fā)性化合物[13-14]，無法滿足復雜基質(zhì)的風味分析。GC×GC-TOFMS 采用兩根不同極性的色譜柱對復雜組分進行正交分離，該技術(shù)具有峰容量高，分離能力強和靈敏度高的優(yōu)點，單次分析可以檢測到上千種組分[5，7，15]，因此，GC×GCTOFMS 是復雜基質(zhì)中揮發(fā)性物質(zhì)分離鑒定的有效手段。

如圖1（A）所示，五糧液原酒酒樣中的揮發(fā)性組分經(jīng)過頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合GC×GC-TOFMS 技術(shù)，解析出1512 個色譜峰。圖1（B）中可以清晰的看出多個組分在一維色譜柱上共流出（黑色虛線框），在第二根色譜柱上成功分離。此外，異戊醇是濃香型白酒中重要的香氣組分，在五糧液中的含量為362.4 mg/L[2]，如圖1（B）所示，異戊醇的色譜峰強度較高。硫代丁酸甲酯在一維和二維色譜柱的析出時間均與異戊醇接近，其含量極低，很可能被異戊醇色譜峰掩蓋。如圖1（C）和（D）所示，二者的質(zhì)譜具有顯著差異，因此基于質(zhì)譜差異的解卷積功能可以在這種情況下區(qū)分兩個化合物。因此，相比傳統(tǒng)一維GC-MS，該技術(shù)通過二維分離和解卷積技術(shù)，可以在復雜的基質(zhì)中解析出更多香氣組分，有助于進一步全面解析復雜的白酒香氣組分。

圖1 五糧液蒸餾56 min時流出酒樣的GC×GC-TOFMS總離子流色譜圖

2.1.2 原酒中香氣組分的鑒定

原酒中的揮發(fā)性化合物由HS-SPME技術(shù)富集濃縮后，進入GC×GC-TOFMS 分離解析，基于軟件積分解卷積功能識別出上千個色譜峰。本研究采用多重策略對揮發(fā)性化合物進行了定性分析。首先，色譜峰質(zhì)譜與多個質(zhì)譜庫比對的相似度可作為物質(zhì)定性的重要參數(shù)，一般認為相似度大于800 的組分具有較高的準確度。保留指數(shù)作為揮發(fā)性化合物鑒定的進一步依據(jù)，本研究將計算的每個色譜峰的保留指數(shù)與多個數(shù)據(jù)庫中的保留指數(shù)進行比對，差值在30 以內(nèi)的可以視為初步鑒定組分。經(jīng)過二重鑒定，其中186 種組分的一維保留時間和二維保留時間與標準品進行了對比，最終在原酒中共準確鑒定出513 種揮發(fā)性化合物。其中酯類最多（145 種），其次是羰基化合物（123 種），醇類（71種），芳香類（39 種），呋喃類（33 種），酸類（25 種），含硫化合物（19 種），含氮化合物（18 種），萜烯類（15 種），揮發(fā)性酚類（15 種）和內(nèi)酯類（10 種），如圖2所示。

圖2 五糧液原酒中分析鑒定的香氣組分

酯類、醇類和羰基化合物是濃香型白酒中主要的香氣組分，這和以往的研究結(jié)果一致[16]。酯類化合物在中國白酒的香氣貢獻中占主導地位，也是五糧液原酒中數(shù)量最多的香氣組分。直鏈脂肪酸乙酯類化合物是一類重要的酯類化合物，本研究檢測到的乙酸乙酯，丙酸乙酯，丁酸乙酯，戊酸乙酯，己酸乙酯，庚酸乙酯，辛酸乙酯，壬酸乙酯和癸酸乙酯，在濃香型白酒中主要呈現(xiàn)水果的香氣[5，16]。其中，己酸乙酯是濃香型白酒的關(guān)鍵香氣成分，也是濃香型白酒中含量最高的化合物，呈現(xiàn)典型的水果香氣。在46%vol 酒精溶液中，己酸乙酯的香氣閾值僅有55 μg/L，濃香型白酒中己酸乙酯含量達到2000 mg/L 左右[2]。除此之外，一些含量較低、數(shù)量較少的組分也可能對香氣有重要貢獻，比如含硫化合物，含氮化合物，萜烯，酚類，呋喃類和內(nèi)酯類化合物等。

揮發(fā)性含硫化合物主要呈現(xiàn)煮洋蔥、爛白菜、煮土豆、煮白菜和煮肉的香氣特征[17-18]，由于其極低的香氣閾值對白酒香氣有重要貢獻。含硫化合物在白酒中的含量較低，白酒中含硫化合物的檢測一直是具有挑戰(zhàn)性的工作。本研究在五糧液原酒中分析檢測出19 種含硫化合物（表1），表明該技術(shù)適合用于分析檢測白酒中的痕量組分。

表1 五糧液原酒中經(jīng)過HS-SPME-GC×GC-TOFMS 鑒定的揮發(fā)性含硫化合物

沙莎等[17]通過感官導向的GC-O 技術(shù)結(jié)合香氣定量方法揭示了芝麻香白酒的特征香氣組分，表明糠硫醇、二甲基三硫和3-甲硫基丙醛等含硫化合物對其獨特的芝麻香氣具有重要貢獻。本研究在五糧液原酒中鑒定出的19 種揮發(fā)性含硫化合物，其化學結(jié)構(gòu)式如圖3 所示。二甲基三硫和3-甲硫基丙醛在五糧液原酒中均檢測到，二甲基三硫在很多白酒中都是重要的香氣物質(zhì)[16，19]。有9 種含硫化合物在五糧液中首次鑒定出，包括噻吩、3-甲基噻吩、硫代丙酸甲酯、2-丙基噻吩、硫代己酸甲酯、3-甲硫基丙醛、2-戊基噻吩、糠基甲基硫醚和2-噻吩甲醛。噻吩呈大蒜氣味；2-戊基噻吩呈甜香和水果香；2-噻吩甲醛呈硫化物的香氣。上述9 個含硫化合物尚未在五糧液成品酒中發(fā)現(xiàn)，可能是因為在白酒的貯存過程中，一些揮發(fā)性含硫化合物由于揮發(fā)性較強和化學反應，濃度逐漸降低，經(jīng)過貯存后白酒的香氣會更加和諧醇厚。含硫化合物在濃香型白酒中的分析目前還比較少，本研究檢測出的含硫化合物對濃香型白酒的香氣貢獻還有待進一步解析。

圖3 五糧液原酒中鑒定出的揮發(fā)性含硫化合物結(jié)構(gòu)圖

3 結(jié)論

本研究首次采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析五糧液原酒蒸餾過程中5 個酒樣的揮發(fā)性組分特征。研究發(fā)現(xiàn)采用極性不同的二維色譜柱系統(tǒng)結(jié)合高通量飛行時間質(zhì)譜能夠有效的實現(xiàn)五糧液原酒復雜揮發(fā)性組分的分離鑒定。本研究將色譜峰的質(zhì)譜、保留時間和保留指數(shù)與標準品和多個數(shù)據(jù)庫對比，準確鑒定出了513 種揮發(fā)性組分,其中酯類最多（145 種），其次是羰基化合物（123 種），醇類（71 種）；在五糧液原酒中鑒定出19 種揮發(fā)性含

硫化合物，其中9 種首次在五糧液中發(fā)現(xiàn)，其香氣貢獻有待進一步分析。