大曲酶系的研究現(xiàn)狀及展望

翁 鵬，張建敏，彭志云，鄭 佳，，3，趙 東，，3*

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 643002；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；3.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室，四川宜賓 644000)

大曲是以小麥為主，配以豌豆、大麥等原料制成的磚塊狀曲塊[1]，其制作過程分為三個階段，物料被粉碎、混合和壓制定型，在特定的溫濕度下進(jìn)行培曲管理，最后進(jìn)入曲庫進(jìn)行進(jìn)一步的干燥和陳化[2]。白酒香型眾多，用于釀造酒的曲同樣多種多樣，白酒大曲按香型可分為濃香型大曲、醬香型大曲、清香型大曲；按制曲溫度可分為高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲；按工藝可分為傳統(tǒng)大曲、純種大曲和強(qiáng)化大曲[3]。作為白酒發(fā)酵劑，大曲在白酒釀造中起到提供菌源、糖化發(fā)酵、投糧和生香四大作用。在培養(yǎng)過程中，環(huán)境微生物自然富集到大曲上，如五糧液包包曲獨(dú)特的包包造型，便是典型的微生物收集器，有利于有益微生物的生長，培養(yǎng)完成并通過一定時間的儲存后，可為白酒的發(fā)酵提供豐富的菌系、酶系，保證白酒的穩(wěn)定生產(chǎn)。現(xiàn)在對糖化和發(fā)酵作用了解太過籠統(tǒng)，還停留在糖化力、液化力等宏觀層次的研究，應(yīng)該進(jìn)一步從微觀即糖化酶、液化酶以及其他酶之間的協(xié)同作用入手分析，找出起主要作用的單個酶或組合酶。大曲所含酶系豐富，主要包括淀粉酶類、纖維素酶類、蛋白酶類、脂肪酶、單寧酶和果膠酶等[3]。曲中酶類主要是微生物代謝或次級代謝產(chǎn)生，發(fā)酵過程中的微生物群落對水分、溫度和酸度的變化非常敏感，因此發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)可影響微生物代謝從而影響酶類的產(chǎn)生，但理化性質(zhì)與大曲酶系并無直接關(guān)聯(lián)性。質(zhì)量不一致的大曲，會增加生產(chǎn)成本和降低發(fā)酵效率，影響白酒的生產(chǎn)過程。大曲質(zhì)量不一可能是由微生物群落分泌的酶系種類、數(shù)量差異較大引起的，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展[4]，對大曲酶系的有更多直觀的研究，本文將對白酒大曲酶系的研究做出概述。

1 大曲酶系組成

酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生，具有催化功能的蛋白質(zhì)[5]。一切微生物的生命活動都離不開酶，大曲及釀酒培養(yǎng)各種微生物的目的，就是利用微生物產(chǎn)生的酶系進(jìn)行龐大、復(fù)雜的生化反應(yīng)。大曲中的酶根據(jù)催化功能可分為糖化酶、液化酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、酯化酶、漆酶、脂肪酶、纖維素酶、木聚糖酶、單寧酶、植酸酶、果膠酶等[1]。

1.1 液化酶

液化酶又稱α-淀粉酶（EC3.2.1.1），主要作用是切斷淀粉分子內(nèi)部的α-1,4-葡萄糖苷鍵，將淀粉水解成糊精和小分子糖，使黏度下降，提高發(fā)酵過程中的糖化效率，在70 ℃左右活性較高[6]。液化酶主要來源于枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉[7]。為了提高實(shí)際釀造中的出酒率，篩選高產(chǎn)液化酶菌已經(jīng)成為一種趨勢。劉延波等[8]從賒店老酒大曲中篩選出了1 株耐高溫的根霉菌B8，在最適條件下，該菌產(chǎn)的液化酶和糖化酶活力分別為41.57 U/g 和162.38 U/g；陳闊[9]從邵陽地區(qū)大曲中篩選出WB4、WB9、WB13 3 株產(chǎn)淀粉酶菌株，其中WB4 在酸性環(huán)境中可產(chǎn)酶達(dá)2.877 U/mL，這一研究使得釀酒生產(chǎn)中可直接添加此菌，使液化力增高，有望提高白酒產(chǎn)量。

1.2 糖化酶

糖化酶又稱γ-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要作用于淀粉非還原性末端的α-1,4-葡萄糖苷鍵，可將淀粉以及液化酶生成的糊精水解成葡萄糖[10]。主要來源于黑曲霉、根霉、擬內(nèi)孢霉、紅曲霉[11]。值得注意的是，真菌α-淀粉酶也可生成少量葡萄糖[12]。范斌強(qiáng)[13]在包包曲中添加黑茶菌，促進(jìn)了霉菌生長，抑制了細(xì)菌和酵母菌生長，顯著提高了糖化酶活力，添加20%黑茶菌時，糖化酶活力提高了12%左右。往酒曲中添加適當(dāng)?shù)拿咕芴岣呔魄奶腔?，同時風(fēng)味物質(zhì)的量也會受到影響[14]，控制好酒曲中霉菌的量，使產(chǎn)酒量與風(fēng)味物質(zhì)達(dá)到平衡，將會是下一個目標(biāo)。

1.3 蛋白酶

蛋白酶[15]是水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，根據(jù)作用pH 值的不同可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶。在釀酒過程中，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下，生成游離氨基酸，繼而生成白酒眾多風(fēng)味物質(zhì)的一部分。酸性蛋白酶主要由酶菌產(chǎn)生，如青霉、根霉和曲霉，少部分細(xì)菌也能產(chǎn)酸性蛋白酶[11]。李學(xué)思[16]以產(chǎn)蛋白酶活達(dá)114.8 U/mL 的菌株MSPN-11 進(jìn)行紫外誘變得到高產(chǎn)蛋白酶菌株MSPR8，酶活相比前者提高了26.38 %；馮利芳[17]從清香型低溫大曲中分離出一株產(chǎn)中性蛋白酶的短小芽孢桿菌GF-6，所產(chǎn)中性蛋白酶最適溫度為50 ℃，最適pH7，在此條件下酶活達(dá)到202.7 U；王芙蓉[18]從醬香大曲中篩選出1 株高產(chǎn)蛋白酶的高溫放線菌GW2，在45 ℃、pH6.5、培養(yǎng)5 d 的優(yōu)化條件下，該菌產(chǎn)酶提高了0.2 倍，可達(dá)214.99 U/g。經(jīng)證實(shí)，在液態(tài)大曲酒發(fā)酵過程中加入適量酸性蛋白酶可有效降低高級醇含量[19]，有助于液態(tài)發(fā)酵的實(shí)現(xiàn)，在微觀層面上，黃蓉[20]將酸性蛋白酶基因定點(diǎn)整合到釀酒酵母的基因位點(diǎn)，獲得的重組菌株可實(shí)現(xiàn)酸性蛋白酶利用與酒精發(fā)酵的同步進(jìn)行，使酒精發(fā)酵效率得到極大提升。

1.4 纖維素酶

纖維素酶（EC3.2.1.4）不是單一的一種酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，包含C1酶（外切β-葡聚糖酶）、Cx 酶（內(nèi)切β-葡聚糖酶）和β 葡糖苷酶（β-葡萄糖苷酶）。在分解纖維素的過程中C1 酶首先破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，接著Cx 酶作用于β-1，4-糖苷鍵，最后經(jīng)β葡糖苷酶作用生成葡萄糖。纖維素酶在釀造過程中起著重要作用，一方面它將釀造原料高粱、玉米中的纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，另一方面，破壞原料中的細(xì)胞壁，使胞內(nèi)淀粉釋放，更易于淀粉酶作用[21]。釀造過程中的纖維素酶主要來源于木霉、曲霉、根霉和青霉[22]。羅明有[23]從濃香型白酒糟醅中篩選出了產(chǎn)纖維素酶的酵母菌株S533Y-36，在pH5.8、32 ℃的條件下培養(yǎng)36 h，酶活為1.84 U/mL。比起酵母菌株，大曲中芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的能力明顯更強(qiáng)，龔麗瓊[24]從高溫大曲中篩選出了產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，經(jīng)優(yōu)化后酶活達(dá)1643.27 U/mL；劉延波等[25]從大曲中分離出了高產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌，在其最佳產(chǎn)酶條件（接種量4 %、培養(yǎng)3 d、pH4）下，產(chǎn)纖維素酶活力高達(dá)1014 U/mL；陽剛[26]發(fā)現(xiàn)提升纖維素酶活力使白酒糟的降解率提高了70 %，有助于對白酒糟進(jìn)行更高效的利用。纖維素酶還能降低雜醇油以及醛類物質(zhì)含量[27]，使所產(chǎn)酒的風(fēng)味、口感更佳。

1.5 木聚糖酶

木聚糖酶（EC3.2.1.8）也稱半纖維素酶，是可將木聚糖降解為低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙?；揪厶敲负头铀狨ッ福山到庾匀唤缰写罅看嬖诘哪揪厶穷惏肜w維素[28]。由于釀酒原料淀粉外層含有半纖維素，木聚糖酶協(xié)同纖維素酶破壞釀酒糧食細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放淀粉、蛋白質(zhì)等，從一定程度上提高了淀粉酶活力[29]。酸性木聚糖酶的最適pH 值為3.5～6.0,適宜溫度為40～60 ℃。徐曼等[28]進(jìn)行白酒釀造實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)添加木聚糖酶組的酒度是對照組的130.47%，且實(shí)驗組的殘?zhí)呛績H為對照組的7.4%。

1.6 單寧酶

單寧酶又稱鞣酸酶或單寧酯酰水解酶，可破壞單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖[30]。在發(fā)酵中，單寧酶將單寧降解成白酒風(fēng)味物質(zhì)，且不同單寧酶可使單寧降解為不同的風(fēng)味物質(zhì)[31]，主要來源于黑曲霉、米曲霉和黃曲霉[32]。薛江林等[33]以酶制劑澄清法解決紅茅燒酒的沉淀問題，以控制變量法分別探究了支鏈淀粉酶、中心蛋白酶、糖化酶以及單寧酶的最佳添加量，發(fā)現(xiàn)添加0.006%單寧酶的澄清效果最好。

1.7 果膠酶

果膠酯是能夠分解果膠物質(zhì)的酶的總稱[34]，包括原果膠酶（PG，EC3.2.1.15）、果膠酯酶（PE，EC3.1.1.11）、果膠水解酶（PH）和果膠裂解酶（PL，EC4.2.2.10），主要作用就是將果膠質(zhì)中的糖苷鍵分解，使果膠轉(zhuǎn)化成半乳糖醛酸[35]。果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，所以果膠酶能破壞釀造原料細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)淀粉分子的釋放，同時具有一定澄清液體的作用，有實(shí)驗表明，超過50 ℃后，果膠酶活性會逐步降低[36]。周姝穎等[37]從酒曲中篩選出了一株低產(chǎn)果膠酯酶的解淀粉芽孢桿菌，接種此菌株制作強(qiáng)化酒曲，實(shí)驗組所得白酒中的甲醇含量顯著低于對照組，且接種量為3%時，甲醇含量最低，與對照組相比降低了66.03%。

1.8 脂肪酶

脂肪酶（EC3.1.1.3）屬于三?；视王Ｋ饷割悾軐⒏视腿ニ獬筛视秃椭舅?，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用。大曲中的脂肪酶能將原料中的脂肪分解為脂肪酸、甘油、甘油單酯或者甘油二酯，同時分解脂肪所得的能量用于微生物的生長代謝，以上產(chǎn)物能合成豐富白酒風(fēng)味的類脂[38]。脂肪酶逐漸被運(yùn)用于白酒釀造副產(chǎn)物。顏晨鱗等[39]在黃水中添加食用酒精和脂肪酶，發(fā)現(xiàn)白酒風(fēng)味酯的濃度增加了近32 倍。研究證明，此酶可重復(fù)使用，使得酯類轉(zhuǎn)化率保持不變。李站勝等[40]向白酒丟糟中加入脂肪酶，發(fā)現(xiàn)在20 %食用酒精（95 %vol）、1.5 %脂肪酶、20 ℃反應(yīng)3 d 的條件下，實(shí)驗組的乙酸乙酯和己酸乙酯比對照組提高16.38 倍和16.67 倍；劉小敏[41]發(fā)現(xiàn)脂肪酶tabI 具有合成乳酸乙酯的能力，這為提高白酒中乳酸乙酯提供了可行方向。

2 大曲酶系的研究現(xiàn)狀

大曲一般采用開放環(huán)境自然發(fā)酵制得，品質(zhì)受環(huán)境因素影響較大。在制作發(fā)酵劑時，大曲類似于培養(yǎng)基，接種的微生物來自環(huán)境，也來自于制作大曲的原料，發(fā)酵過程由經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員操作。因此，生產(chǎn)過程中存在部分不可預(yù)測和不可控的因素，造成了大曲乃至于白酒質(zhì)量的不一致性，差異很大程度是大曲中菌系結(jié)構(gòu)不同造成。細(xì)菌群落演替的關(guān)鍵因素是纖維素酶活性、酸度和水分含量等[42]，為更好地控制細(xì)菌群落組成提供了可能，從而有可能改善白酒的品質(zhì)。

2.1 大曲酶系與菌系的研究

大曲酶系是由菌系分泌，有研究表明，在大曲發(fā)酵期，微生物數(shù)量在升溫期最高，高溫期下降，降溫期有所回升，大曲生物酶量也隨著這個規(guī)律變化[43]，大曲酶系與菌系息息相關(guān)，研究大曲酶系可從大曲菌系入手。大曲中菌類豐富，主要含有細(xì)菌、霉菌、酵母菌、放線菌等[1]，張崇軍等[44]從濃香包包曲中篩選出產(chǎn)蛋白酶活力高達(dá)86.5 U/g 的地衣芽孢桿菌（WLYQ-1.4）；唐賢華等[45]優(yōu)化了濃香包包曲中耐性益生芽孢桿菌（WLYQ-1），使其高產(chǎn)蛋白酶，在最優(yōu)條件下產(chǎn)蛋白酶活為87.56 U/mL；馬文瑞等[46]從藏曲中分離出的微生物，根霉M12 糖化能力最高，為（1382±77.38）μg/g·min，芽孢桿菌Q4蛋白酶活性最高，為（1035.56±40.09）μg/g·min。將高產(chǎn)蛋白酶菌應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中能更好地豐富白酒的風(fēng)味物質(zhì)。

黃曉寧等[47]在大曲中篩選乳酸菌時，發(fā)現(xiàn)90%所篩乳酸菌株產(chǎn)α-淀粉酶，超過60 %的乳酸菌株產(chǎn)酯酶，且比起單一乳酸菌，在復(fù)雜發(fā)酵中，經(jīng)過微生物之間復(fù)雜相互作用后的乳酸菌（E48）產(chǎn)酯酶能力最強(qiáng)，酯酶活性高達(dá)（63.4±0.4）U/mL。作為白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，乳酸菌通過產(chǎn)生酯酶和代謝產(chǎn)物影響白酒的風(fēng)味[48]。雷學(xué)俊等[49]從包包曲制曲過程中分離出9 個霉菌屬，曲中霉菌屬豐富。據(jù)研究，曲中糖化力主要來自于霉菌如根霉、黑曲霉、紅曲酶等。劉延波等[50]從賒店老酒大曲篩選出的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）高產(chǎn)淀粉酶，經(jīng)過優(yōu)化后，產(chǎn)酶活力高達(dá)（164.37±3.25）U/mL?？蓪⒏弋a(chǎn)酶微生物用于制造強(qiáng)化大曲，提高發(fā)酵效率。

2.2 大曲酶系與理化性質(zhì)的研究

大曲菌系雖能分泌酶系影響物系的理化性質(zhì)，物系的理化性質(zhì)也能反過來影響菌系、酶系。將制曲過程中濃香型包包曲曲心、曲皮的總酸、水分等理化性質(zhì)與曲皮、曲心微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)理化性質(zhì)是影響包包曲微生物的重要因素，造成了曲中微生物數(shù)量和分布差異[51]，酶系分布與數(shù)量也會因為菌系變化發(fā)生改變。水分作為大曲理化性質(zhì)之一，向來是研究大曲時不可忽視的，大曲中微生物生命活動與諸多酶反應(yīng)都需要水，張宗舟[52]發(fā)現(xiàn)黑曲霉ZM-8 大曲的含水量會對酶系酶活產(chǎn)生影響，且控制含水量為49%～50%，室溫為25℃，培養(yǎng)40 h，酶系酶活顯著增大，這表示曲中水分變化會影響酶系的變化，具體機(jī)理有待研究。大曲總酸變化會引起pH 值變化，微生物及其數(shù)量種類受pH 值變化影響，其分泌的酶系也隨之改變。

2.3 大曲酶系在曲塊中的分布

大曲中的酶系來源于微生物群落代謝，微生物群落生長繁殖取決于曲塊通氣情況、溫度、水分等理化因素，所以研究大曲酶系的分布情況要從理化性質(zhì)入手。研究大曲不同部位酶系的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中曲外層菌系數(shù)量高于曲心[53]，比起曲心，曲皮接觸了更多的氧氣，更有利于微生物群落生長，所以曲心酶活力一般都低于曲皮酶活力。大曲發(fā)酵初期，溫度從20 ℃逐漸上升到40 ℃，這一溫度范圍有利于微生物群落生長繁殖，酶系隨著微生物大量生長而被分泌，曲塊中總酶活達(dá)到最大。進(jìn)入高溫期，微生物大量死亡，曲塊中的酶活力急劇下降。研究表明，十月制作大曲的酶活普遍高于六月制作的大曲[54]，造成這一差異的原因是六月環(huán)境溫度高，使得發(fā)酵大曲升溫過快，曲塊內(nèi)微生物生長不充分，產(chǎn)酶也不充分。

2.4 大曲酶系的提取與測定

大曲酶活測定前處理步驟——大曲酶蛋白提取的成功與否決定后續(xù)酶活力檢測的最終結(jié)果，對大曲中胞外酶蛋白提取條件[55]進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)料液比對酶蛋白提取更加重要，提取時間達(dá)到1 h 后再增加對酶蛋白提取影響甚微，還發(fā)現(xiàn)曲中纖維素酶主要來自孢子休眠體的微生物，除了纖維素酶在提取時需要對水浸液進(jìn)行超聲波粉碎，糖化酶等胞外酶[56]大多不需要進(jìn)行特別處理，在適宜pH 值水溶液浸提即可。范偉業(yè)等[57]用tris-HCL 提取包包曲中的酶蛋白，發(fā)現(xiàn)在pH7、浸提2 h、料液比為1∶5 的條件下，提取酶蛋白效果最好，蛋白濃度為285.68 μg/mL，經(jīng)過兩次離心得到粗酶液，能檢測出大曲中多種酶活。王玉霞等[58]用pH4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液在4 ℃條件下過夜浸提大曲粉，料液比為1∶2，最后將浸提液過濾、離心得到粗酶液，所得粗酶液能檢測出α-淀粉酶、丹寧酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活力。

在對大曲酶系的研究中，最直接的就是測定酶系酶活，找出最優(yōu)酶活檢測方法測定各類酶活至關(guān)重要。劉璐[59]使用傳統(tǒng)比色法和分光光度法測定大曲液化酶活力，結(jié)果表明，不管是時間還是測定準(zhǔn)確度，分光光度法都優(yōu)于傳統(tǒng)比色法。除了分光光度法，有條件也可采取非常規(guī)檢測分析大曲酶系酶活力，張強(qiáng)等[60]利用HPLC 分析大曲中液化酶和糖化酶活力，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)方法所測酶活力一致，酶聯(lián)免疫法也被用于大曲酯化酶活測定[61]，其準(zhǔn)確性也可得到保障。為了使酶活測定更快捷，各類酶活測試盒被廣泛推廣，極大地提高了酶活測定效率。

3 展望

白酒大曲微生物群落演替的一般規(guī)律是目前白酒研究的熱點(diǎn)，大曲酶系與微生物群落、理化性質(zhì)的關(guān)系密不可分，從酶系角度分析大曲發(fā)酵過程中影響其質(zhì)量的因素，通過大曲菌系分泌的各種酶對各種類型大曲糖化發(fā)酵機(jī)理進(jìn)行探究，有利于將大曲酶系進(jìn)行利用，篩選出相關(guān)功能菌，為大曲發(fā)酵以及功能菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。期望未來能對大曲中如漆酶、植酸酶等少見酶類進(jìn)行探究，進(jìn)一步豐富酶系研究，找出白酒發(fā)酵中的關(guān)鍵酶，解析固態(tài)釀造原理。