包包曲風(fēng)味萃取方式的對(duì)比及GC×GC-TOFMS在其風(fēng)味化合物鑒定中的應(yīng)用

陳 荻，楊康卓，劉志鵬，趙 東，2，3，鄭 佳，2，3

（1.宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000；3.中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

“曲乃酒之骨”，曲不僅是白酒釀造所需的糖化劑，同時(shí)也是生香劑，對(duì)酒的品質(zhì)和風(fēng)味形成尤為重要[1]。研究表明，曲的風(fēng)味影響酒的風(fēng)味，作為釀造原料的一部分，其所含的大量風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)在釀造過程中直接或間接地進(jìn)入酒體，對(duì)中國(guó)白酒的香型、風(fēng)格和流派有著深遠(yuǎn)的影響[2，3]。同時(shí)，酒曲風(fēng)味反映其品質(zhì)，是白酒生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵控制指標(biāo)。由此可見，酒曲風(fēng)味的研究對(duì)白酒風(fēng)味形成機(jī)理的探究及實(shí)際生產(chǎn)中酒曲質(zhì)量的控制都具有重要意義。五糧液所用大曲俗稱包包曲，屬于中高溫曲，包包曲的曲香濃郁，發(fā)酵力及糖化力強(qiáng)，是五糧液優(yōu)越香氣的奧秘之一[4]。

全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（GC×GCTOFMS）將兩根不同極性的色譜柱連接起來(lái)，分析物從一維色譜柱流出后進(jìn)入二維色譜柱進(jìn)行二次分離，因此具有靈敏度高、分辨率高、峰容量大等特點(diǎn)，是復(fù)雜樣品中風(fēng)味分析的有效手段[5-7]。GC×GC-TOFMS 在白酒、葡萄酒、啤酒、奶酪、咖啡等食品風(fēng)味分析領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[6，8-10]。鄭佳等[2]應(yīng)用GC×GC-TOFMS 研究了包包曲的蒸餾香氣成分，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)對(duì)大曲中含量較低的吡嗪、硫化物等物質(zhì)具有優(yōu)越的檢出和鑒定能力，且鑒定化合物的總數(shù)遠(yuǎn)高于一維GC[11-15]，但相關(guān)樣品前處理方法仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。樣品前處理的目的是提取并濃縮其中的風(fēng)味成分，大曲的風(fēng)味萃取方法包括液液萃?。↙LE）、頂空固相微萃?。℉S-SPME）、溶劑輔助蒸發(fā)萃取（SAFE）、攪拌棒吸附萃取、索氏提取等，其中HS-SPME 的應(yīng)用最為普遍[16]，目前尚未有針對(duì)這些方法的對(duì)比研究。

因此，本研究的目的是對(duì)比LLE、HS-SPME、SAFE 等方法在包包曲風(fēng)味成分萃取中的效果，并利用GC×GC-TOFMS 建立針對(duì)包包曲風(fēng)味的有效分析方法，對(duì)科學(xué)認(rèn)識(shí)包包曲中曲香的組成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

生產(chǎn)用曲粉，采自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車間。

1.1.2 試劑及耗材

二氯甲烷、乙醚均為HPLC 級(jí)，購(gòu)自百靈威公司；正戊烷，分析純，購(gòu)自成都科龍化工廠；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水氯化鈣均為ACS 級(jí)，購(gòu)自阿拉丁公司；氯化鈉，GR 級(jí)，購(gòu)自阿拉丁公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，購(gòu)自美國(guó)Supelco公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀由Agilent 7890B 氣相色譜（Agilent Technologist，美國(guó)）、Pegasus 4D 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LECO，gouzi 美國(guó)）和多功能自動(dòng)進(jìn)樣器（Gerstel，ML2，德國(guó)）組成；調(diào)制器（LECO，美國(guó)）為液氮型調(diào)制器；全二維氣相色譜由一維氣相色譜柱箱和安裝在其內(nèi)的獨(dú)立控溫的二維色譜柱箱構(gòu)成。一維色譜柱為極性柱DB-WAXext（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W，美國(guó)），二維色譜柱為中等極性柱Rxi-17Sil MS（2.0 m×0.1 mm×0.1 μm，Restek，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香氣成分提取

1.2.1.1 HS-SPME方法

HS-SPME 分為濕法[12]和干法[17]，濕法HSSPME 向15 mL 頂空瓶添加5 mL 飽和食鹽水和2 g曲粉，干法HS-SPME 只添加2 g 曲粉，水浴50 ℃平衡10 min，采用經(jīng)過老化的萃取頭吸附30 min，最后在進(jìn)樣口230 ℃下解吸附5 min。

1.2.1.2 LLE方法

稱取20 g 曲粉于燒杯中，加入0.2 g 氯化鈣及50 mL 去離子水，用封口膜封口，冰浴超聲過夜，冷凍離心取上清液，加入等體積乙醚戊烷混合液（1∶1）萃取3 次，冷凍離心破乳，合并上層萃取相，加入0.5 g 無(wú)水硫酸鈉除去多余水分，氮吹濃縮至500 μL[18]。

1.2.1.3 SAFE方法

稱取20 g 曲粉于50 mL 藍(lán)蓋瓶中，加入20 mL二氯甲烷萃取3 次，離心后合并萃取液，在50 ℃，1×10-3pa 條件下進(jìn)行SAFE 處理以除去多余油脂和色素，收集萃取液，氮吹濃縮至500 μL[19]。

1.2.2 GC×GC-TOFMS條件

GC 條件：進(jìn)樣口溫度230 ℃，一維柱箱起始溫度45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min。GC 二維柱箱全程保持比一維柱箱高5 ℃。調(diào)制補(bǔ)償溫度20 ℃。調(diào)制周期為4 s（熱脈沖時(shí)間0.8 s）。色譜柱采用恒流模式，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min。進(jìn)樣口為不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量為1 μL。

TOFMS 條件：GC 連接線溫度240 ℃，電離電壓-70 eV，離子源溫度230 ℃，檢測(cè)器電壓1500 V，質(zhì)量數(shù)范圍35～400 amu，數(shù)據(jù)采集頻率100 spectra/s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考文獻(xiàn)所述方法[20]，采用ChromaTOF軟件進(jìn)行自動(dòng)解卷積和譜庫(kù)（mainlib,standards,NIST 和replib）比對(duì)，選擇相似度大于800、信噪比大于50的組分，比較實(shí)驗(yàn)分析中和文獻(xiàn)中的保留指數(shù)，結(jié)合香氣成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行物質(zhì)的綜合鑒定。根據(jù)各化合物峰面積占比計(jì)算其相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二維總離子流圖

包包曲的風(fēng)味萃取除了注重風(fēng)味成分的萃取效率之外，還需要考慮色素及油脂的去除，因此，研究采用了LLE、HS-SPME、SAFE 等多種萃取方法對(duì)包包曲中的風(fēng)味成分進(jìn)行萃取。HS-SPME 由于沒有溶劑萃取的過程，因此不存在油脂和色素的干擾，LLE 和SAFE 的萃取結(jié)果顯示，SAFE 能完全去除樣品中的油脂和色素，LLE 的濃縮樣品則呈極輕微的透明的黃色，樣品中殘留了一定色素。

圖1 為包包曲的風(fēng)味成分二維總離子流圖。由圖1 可知，經(jīng)過多種前處理方法提取結(jié)合GC×GC-TOFMS 分析后，檢出大量揮發(fā)性組分，證明包包曲的風(fēng)味組成十分復(fù)雜。圖中LLE 萃取所得的風(fēng)味物質(zhì)種類及含量明顯高于其他方法。對(duì)二維總離子流圖采用Pegasus 4D 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀自帶工作站軟件ChromaTOF 對(duì)照NIST 質(zhì)譜庫(kù)檢索解析，再結(jié)合標(biāo)品質(zhì)譜和保留時(shí)間、文獻(xiàn)保留指數(shù)等綜合對(duì)比，得到所有化合物的鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HS-SPME-DRY 樣品中鑒定出的物質(zhì)分別為316 種、172 種、176 種、217 種，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大曲樣品一維GC-MS 的鑒定數(shù)量[11-15]。LLE 和SAFE 的萃取效果都受萃取劑影響，兩者萃取劑并不相同，除此之外，SAFE 蒸餾過程中容易損失難揮發(fā)物質(zhì)；兩種HS-SPME 方法則受到樣品量及萃取頭吸附性的限制。

圖1 包包曲風(fēng)味物質(zhì)的二維總離子流圖

2.2 風(fēng)味化合物數(shù)量

不同萃取方法對(duì)不同種類化合物的萃取效率不同，因此，為了分析不同萃取方式的特點(diǎn)，對(duì)四組樣品中的化合物進(jìn)行了歸類，圖2 為不同樣品中化合物的分布。結(jié)果顯示，醇類是所有樣品中數(shù)量最多的化合物（“其他”包含化合物種類較多），醇類在數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)在以往關(guān)于包包曲[2，11]乃至酒曲[13]的研究中均有報(bào)道。就萃取方法而言，LLE 萃取樣品中，除了酯類，其他種類化合物都比其他方法豐富，體現(xiàn)了其在整體萃取效率上的優(yōu)勢(shì)，推測(cè)原因?yàn)橄噍^于SAFE，LLE 萃取過程簡(jiǎn)單，損失更少，相較于HS-SPME，LLE 會(huì)檢測(cè)到更多難揮發(fā)的物質(zhì)。SAFE 除色素和油脂的效果最佳，但在萃取化合物的豐富程度上不具優(yōu)勢(shì)。HS-SPME-DRY 的萃取效果優(yōu)于HS-SPME-WET，具體體現(xiàn)在酯類、醛類和芳香族化合物的數(shù)量上，郭兆陽(yáng)等[21]研究指出，氯化鈉會(huì)抑制大曲中組分溶出，這可能是HSSPME-WET 鑒定化合物少于HS-SPME-DRY 的原因。

圖2 包包曲中各類型化合物數(shù)量

2.3 風(fēng)味化合物含量

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 萃取樣品在二維上的總峰面積分別為44806322、31958804、11364129、24827363，總體萃取效率 LLE＞SAFE＞HS-SPME-DRY＞HSSPME-WET。實(shí)驗(yàn)采用峰面積歸一法定量，圖3 為不同樣品中化合物峰面積占比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。峰面積的比較，進(jìn)一步凸顯了醇類在包包曲風(fēng)味成分中的優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明包包曲中的醇類不僅種類多，含量也高。相反，硫化物在各方法中的峰面積占比都較低。除此之外，各個(gè)方法呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，LLE萃取得到的酸類、呋喃和其他類化合物占比明顯高于其他方法。分析認(rèn)為，酸類普遍沸點(diǎn)較高，因此在損失最少的LLE中得以保留最多，呋喃和其他類化合物則可能因?yàn)樵摲椒ㄕw萃取效率高，使數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確鑒定到了更多相關(guān)化合物；兩種HS-SPME方法萃取得到的醛類占比都高于其他方法，說(shuō)明該方法對(duì)醛類的吸附性強(qiáng)，其物質(zhì)分布與已有報(bào)道相符[22]。

圖3 包包曲中各類型化合物峰面積占比

2.4 典型風(fēng)味成分的檢出

由圖2、圖3 可知，各萃取方法對(duì)包包曲主要香氣成分醇、酸、酯、醛、酮、芳香族等都有較好的提取能力，因此，吡嗪、硫化物等低含量物質(zhì)的檢出效果成為判斷方法好壞的關(guān)鍵。

吡嗪主要由大曲發(fā)酵過程氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生或褐變反應(yīng)產(chǎn)生，除此之外，也可以由微生物在曲藥中迅速繁殖并代謝產(chǎn)生[23]。吡嗪類化合物是一類對(duì)白酒風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)的微量化合物，也是白酒中重要的功能性成分[24]，這類物質(zhì)主要呈現(xiàn)巧克力、堅(jiān)果、花生味等香氣，被認(rèn)為是大曲中焦香味、烘焙味的主要來(lái)源[1]，各方法檢出吡嗪的數(shù)量分別為L(zhǎng)LE 13 種，SAFE 5 種，HSSPME-WET 11 種，HS-SPME-DRY 11 種，可見LLE 具有優(yōu)勢(shì)。LLE 檢出的典型吡嗪物質(zhì)包括吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，均為大曲中典型的吡嗪類化合物[2，11，19，25]。

表1 包包曲中的吡嗪化合物

表2 包包曲中的硫化物

硫化物在白酒或大曲中的含量都比較低，硫化物的閾值極低，具有強(qiáng)烈的洋蔥、大蒜、臭雞蛋或者爛白菜味道，硫化物在濃度較低的情況下，對(duì)白酒的風(fēng)味起著有利作用[26]。各方法檢出的硫化物數(shù)量 分別為L(zhǎng)LE 4 種，HS-SPME-WET 2 種，HSSPME-DRY、SAFE 均為1 種，可見，LLE 在硫化物檢測(cè)方面也具有優(yōu)勢(shì)。

就單個(gè)化合物討論，2,3-丁二醇在所有方法中峰面積占比都大于1%，尤其在LLE 和SAFE 中，占比分別達(dá)到了15.80%和36.86%，楊理章等[15]在采用LLE 萃取高溫大曲中的風(fēng)味物質(zhì)研究中也指出了這一現(xiàn)象。同時(shí)，苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁內(nèi)酯的占比也在不止一種方法中超過了1%，這與前人關(guān)于包包曲風(fēng)味的研究結(jié)論相符[2，11]。此外，正己醇和2-戊醇只在兩種HS-SPME 方法中含量超過1%，這可能與方法的選擇性有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用GC×GC-TOFMS 技術(shù)檢測(cè)包包曲中的香氣成分，多方面對(duì)比了LLE、SAFE、HSSPME 等多種方法在包包曲風(fēng)味萃取中的效果。結(jié)果顯示，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 樣品中鑒定出的物質(zhì)分別為316 種、172 種、176 種、217 種。LLE 在化合物總峰面積、化合物數(shù)量、低含量物質(zhì)的檢出方面都具有優(yōu)勢(shì)，但樣品中殘留一定色素。SAFE能完全去除油脂和色素，但在蒸餾過程中可能存在風(fēng)味成分的損失。干法HS-SPME對(duì)包包曲風(fēng)味成分的萃取效果優(yōu)于濕法HS-SPME，兩者對(duì)比其他方法對(duì)醛類表現(xiàn)出更好的吸附性。此外，醇類在包包曲中數(shù)量最多，含量最高；就單個(gè)化合物而言，2,3-丁二醇、苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁內(nèi)酯等在包包曲中相對(duì)含量較高。本研究可為包包曲乃至酒曲的風(fēng)味研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及方法參考。