苦蕎黃酒發(fā)酵過程中功能性物質(zhì)含量與體外抗氧化活性分析

李丹青，徐園若，成超超，孫明璐，包智敏，胡新中

（1.商洛學(xué)院，陜西商洛 726000；2.煙臺南山學(xué)院，山東煙臺 265713；3.陜西師范大學(xué)，陜西西安 710011）

苦蕎麥，又名烏麥（Tartary Buckwheat），屬蓼科蕎麥屬被子植物門雙子葉植物，富含蛋白質(zhì)、微量元素、生物類黃酮、礦物質(zhì)、維生素等功能性物質(zhì)，具有降“三高”、抗腫瘤、抗衰老、改善記憶力以及預(yù)防肥胖等功效，尤其黃酮和多酚類物質(zhì)賦予了苦蕎獨(dú)特的保健功效和良好的抗氧化活性[1]?？嗍w被國際糧農(nóng)組織公認(rèn)為藥食同源特色雜糧作物，更是被《本草綱目》譽(yù)為“五谷之王”[2]。隨著人民生活水平的提高，對營養(yǎng)與健康保健意識逐漸加強(qiáng)，以苦蕎面為主要原材料的深加工食品進(jìn)入公眾視野，受到消費(fèi)者青睞。苦蕎中含有大量的支鏈淀粉，是用于發(fā)酵釀酒的理想原料[3]。黃酒是世界上最古老的傳統(tǒng)釀造酒之一（已有4000 多年的歷史），與葡萄酒、啤酒享有同樣重要的地位，被譽(yù)為“國酒”和“液體蛋糕”，深受公眾熱愛[4]。在糯米中加入苦蕎麥，經(jīng)純麥曲糖化發(fā)酵等系列工藝釀制而成的苦蕎黃酒，具有特殊的保健功能，其低度、保健的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代人的健康生活理念[5]。

近年來對苦蕎的深加工研究主要集中在苦蕎茶[6]、苦蕎掛面[7]、蕎麥酒等[8-9]，對苦蕎黃酒的研究也多集中在加工工藝與風(fēng)味成分等方面[10-12]，對發(fā)酵過程中的功能性物質(zhì)動態(tài)監(jiān)測研究較少。本試驗(yàn)以苦蕎和糯米為主要原料，研究苦蕎黃酒發(fā)酵過程中主要功能性物質(zhì)含量和體外抗氧化活性的變化規(guī)律，以期為苦蕎黃酒的功能挖掘和品質(zhì)改善奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米、苦蕎，陜西商洛華潤萬家超市；黃酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

試劑及耗材：糖化酶（食品級），河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；沒食子酸標(biāo)品、蘆丁標(biāo)品、DPPH 標(biāo)品、ABTS 標(biāo)品（純度均＞98%），北京索萊寶科技有限公司；福林酚，北京索萊寶科技有限公司；碳酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸（均為分析純），上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：電子天平（AY-120），日本島津公司；臺式離心機(jī)（FCL-16），上海梓桂儀器有限公司；型電子恒溫水浴鍋（DXY-6），鼎鑫宜儀器有限公司；糖化鍋（TL-B50），帥飛飲料機(jī)械有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（721G-100），上海精科儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎黃酒工藝流程及操作要點(diǎn)（圖1）

圖1 苦蕎黃酒工藝流程

原料前處理：準(zhǔn)確稱取苦蕎麥與糯米質(zhì)量比為3∶5.5（g∶g）。將糯米淘洗干凈，25 ℃左右的溫開水浸泡10 h 后用蒸鍋蒸30 min。將稱量好的苦蕎麥放于180 ℃的烘箱中進(jìn)行烘烤，至苦蕎麥出現(xiàn)焦香味后粉碎。

混合：將處理好的苦蕎與糯米攤涼至50 ℃左右，加入苦蕎與糯米質(zhì)量總和的0.25%糖化酶和適量水進(jìn)行混合，混合后將混合物放入糖化鍋中糖化13 h。

加曲發(fā)酵：將糖化完成后的混合物轉(zhuǎn)移至35 ℃恒溫發(fā)酵箱中，接入苦蕎與糯米質(zhì)量總和的0.2%黃酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為12 d。

壓榨、過濾、調(diào)配：發(fā)酵結(jié)束后壓榨過濾，濾液靜置2～4 d，使酒液澄清，加入適量焦糖色素調(diào)和酒體的顏色和口感[13]。

1.2.2 多酚含量測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取沒食子酸1 g 加蒸餾水溶解，用500 mL 容量瓶定容，制得2 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取潔凈燒杯6 個(gè)按表1 進(jìn)行操作，在725 nm 波長處測定吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

樣品的測定：接種后開始每間隔24 h 取苦蕎黃酒上清液3 mL，加入3 mL 福林酚試劑反應(yīng)，5 min后加入3 mL 0.15 g/mL Na2CO3溶液，加蒸餾水至10 mL，25 ℃水浴避光反應(yīng)15 min，使混合物在725 nm 處的吸光度不再發(fā)生改變，記錄吸光度數(shù)值。

1.2.3 總黃酮含量測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取蘆丁標(biāo)品0.20 g，加入42%乙醇加熱使之溶解，放置常溫后用1000 mL 容量瓶定容。制得濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取潔凈燒杯6 個(gè)，按表2進(jìn)行操作，在510 nm 波長處測定吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

表2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

樣品的測定：接種后開始每間隔24 h 取苦蕎黃酒上清液10 mL，按上述步驟依次加入試劑后，加入42 %的乙醇定容至100 mL，充分反應(yīng)使混合物在510 nm 處的吸光度值不再發(fā)生改變后記錄吸光度數(shù)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮類物質(zhì)含量[16]。

1.2.4 DPPH自由基清除效果測定

DPPH 測試液的制備：稱取50 mg DPPH，加無水乙醇超聲振蕩5 min 使其溶解，溶解后定容至1000 mL，制得0.05 mg/mL DPPH溶液。DPPH溶液應(yīng)避光保存，3 h內(nèi)用完[17]。

DPPH 自由基清除效果測定：接種后開始每間隔24 h 取5 mL 酒樣加入到10 mL 0.05 mg/mL 的DPPH 自由基乙醇溶液中，室溫放置35 min 使其充分反應(yīng)，在517 nm 波長處測定吸光度值，按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH 自由基清除率(%)=[(1-A1)/A0]×100

式中：A1——含酒樣樣品的吸光度；

A0——空白對照組的吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除效果測定

ABTS 測試液的制備：量取50 mL 7 mmol/L 的ABTS 溶液和50 mL 2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液于燒杯中混勻，避光反應(yīng)12 h，得到ABTS 自由基工作液。工作液應(yīng)在2 h內(nèi)用完。

ABTS 自由基清除效果測定：在80 μL 苦蕎黃酒中加蒸餾水至4 mL，即體積分?jǐn)?shù)為20 μL/mL。向其中加入4 mL ABTS溶液混合均勻，充分反應(yīng)后在734 nm 重復(fù)測定3 次取平均值。以4 mL 純凈水和4 mL ABTS 混合液為對照組，ABTS 自由基清除率表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從接種后開始每間隔24 h 取樣測定一次，計(jì)算公式如下[18-19]：

ABTS 自由基清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100

式中：Ax——樣品反應(yīng)10 min后測得的吸光度值；

A0——空白組的吸光度值。

1.2.6 ABTS還原能力測定

還原能力是評估酒體抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，該實(shí)驗(yàn)中苦蕎黃酒發(fā)酵液先將體系中的Fe3+（鐵氰化鉀）還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），再與Fe3+（氯化鐵）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成亞鐵氰化鐵，使該混合液在700 nm 波長下的吸光度值增大，吸光度與被測樣品的還原力呈正相關(guān)[20-22]。

250 μL酒樣中加入1.5 mL蒸餾水，加入磷酸緩沖溶液4 mL，充分振蕩使之混合均勻，加入3 mL 1%K3[Fe(CN)6]溶液加熱到50 ℃反應(yīng)25 min，加入3 mL 15 %的C2HCl3O2，3000 r/min 離心20 min，離心結(jié)束后進(jìn)行抽濾，取抽濾液3 mL 于試管中，用移液槍向試管中加入3 mL 蒸餾水和1.5 mL 0.1 %的FeCl3溶液，充分反應(yīng)后混合物在700 nm 處的吸光度不發(fā)生改變后記錄吸光度數(shù)值。測定3 次取平均值，吸光度值越高表明被測物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)。從接種后開始每間隔24 h 取樣1 次，進(jìn)行測定[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中功能性物質(zhì)含量的變化

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸回歸線方程為y=0.1851x-0.5238，R2=0.9994。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中多酚含量的變化

本實(shí)驗(yàn)分析了苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中多酚含量的變化規(guī)律，由圖3 可知，苦蕎黃酒發(fā)酵過程中多酚含量整體呈現(xiàn)先下降后升高并趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵第1 天，多酚含量明顯下降，苦蕎黃酒剛開始發(fā)酵，發(fā)酵罐中存在大量的氧氣，多酚發(fā)生了氧化反應(yīng)或降解反應(yīng)。當(dāng)發(fā)酵罐中有足量的氧氣時(shí)黃酒酵母進(jìn)行有氧呼吸，使有機(jī)物完全分解，釋放大量能量用于生長繁殖，當(dāng)體系中的氧氣被黃酒酵母消耗到一定量時(shí)，黃酒酵母在無氧條件下進(jìn)行糖酵解生成酒精產(chǎn)生少量能量，苦蕎和糯米中的多酚在醇類物質(zhì)的作用下被不斷地萃取出來；1～2 d，多酚含量變化不明顯，被氧化的多酚和浸出的多酚達(dá)到動態(tài)平衡。2～8 d 多酚含量明顯上升，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，苦蕎和糯米的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞且體系中醇類物質(zhì)不斷積累，致使苦蕎和糯米中的多酚被快速浸出，第8 天多酚含量達(dá)到最大含量195.57 mg/L；8～12 d 多酚含量差異不明顯，呈現(xiàn)波動變化。

圖3 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中多酚化合物含量的變化曲線

圖4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁回歸線方程為y=11.393x+0.0014，R2=0.9993。

2.1.4 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中黃酮含量的變化

黃酮是自然界中廣泛存在的天然有機(jī)化合物，相關(guān)研究表明黃酮具有抗氧化、清除自由基、改善血液循環(huán)、抗病毒和抗衰老、調(diào)節(jié)身體機(jī)能等作用[25]。黃酮的含量高低體現(xiàn)了苦蕎黃酒的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。

本實(shí)驗(yàn)分析了苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中黃酮含量的變化規(guī)律，由圖5 可知，0～8 d 苦蕎黃酒發(fā)酵液中黃酮含量持續(xù)增加，在此過程中隨著醇類物質(zhì)的不斷積累，苦蕎和糯米中不溶于水或難溶于水的黃酮類物質(zhì)溶解在醇類溶劑中，使體系中的總黃酮含量迅速增加，總黃酮含量在第9 天達(dá)到最大值，最大值為179.65 mg/L；9～12 d 總黃酮含量變化不明顯，呈現(xiàn)波動變化，可能是由于發(fā)酵液中的多酚類物質(zhì)和黃酮類化合物具有抑菌效果，抑制了黃酒酵母正常的生長代謝，致使體系中的酒精含量變化不明顯，主發(fā)酵期間總黃酮和多酚含量隨時(shí)間的延長而增加。從時(shí)間上看，多酚含量達(dá)到最大值的時(shí)間早于黃酮含量達(dá)到最大值的時(shí)間。

圖5 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中黃酮含量的變化曲線

2.2 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中體外抗氧化活性的變化

2.2.1 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除率的變化

在苦蕎黃酒發(fā)酵液中加入DPPH 醇溶液，苦蕎黃酒發(fā)酵液與DPPH 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使得體系中DPPH 自由基被還原，DPPH 醇溶液黛紫色褪去，在517 nm處的吸光度減小。

本實(shí)驗(yàn)分析了苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化規(guī)律，由圖6 可知，第1 d 苦蕎黃酒發(fā)酵液對DPPH 自由基的清除率有所下降，對比圖3 可知造成對DPPH 自由基清除率下降的原因可能和此階段多酚類物質(zhì)的減少有關(guān)。1～8 d 時(shí)DPPH 自由基清除率明顯上升，在第8 天時(shí)達(dá)到最大清除率93.59%，直到發(fā)酵后期，苦蕎黃酒發(fā)酵液對DPPH 自由基的清除能力依然穩(wěn)定在一個(gè)較高值，這可能與總酚和總黃酮在發(fā)酵后期含量保持相對穩(wěn)定有關(guān)。

圖6 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化曲線

2.2.2 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中ABTS 自由基清除率的變化

ABTS 試劑與DPPH 相比，不僅可以溶于乙醇還溶于水，當(dāng)其和氧化劑發(fā)生反應(yīng)時(shí)，會被氧化成藍(lán)綠色，在734 nm處有最大吸收峰[26]。把苦蕎黃酒發(fā)酵液加入到被氧化的ABTS 自由基溶液，被氧化的ABTS 自由基溶液將會褪色且在734 nm 下的吸光度降低，吸光度值越小，苦蕎黃酒發(fā)酵液的抗氧化能力越強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)分析了苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率的變化規(guī)律，由圖7 可知，0～3 d 時(shí)ABTS 自由基清除率不斷緩慢增強(qiáng)，3～8 d 時(shí)ABTS 自由基清除率增長速度最快，第8 天時(shí)達(dá)到最大清除率65.31%，第9 天時(shí)ABTS 自由基清除率出現(xiàn)明顯下降，可能與發(fā)酵時(shí)的氣候、溫度和發(fā)酵工藝等有關(guān)。

圖7 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率的變化曲線

2.2.3 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中ABTS 還原能力的變化

本實(shí)驗(yàn)分析了苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中還原能力的變化規(guī)律，由圖8 可知，隨著發(fā)酵過程的不斷進(jìn)行，苦蕎黃酒發(fā)酵液的還原能力不斷增強(qiáng)，在0～8 d 期間增長速度最快，第8 天后慢慢趨于平穩(wěn)，可能是前期功能性成分含量不斷增加，使苦蕎黃酒發(fā)酵液的還原能力增加，后期功能性物質(zhì)含量趨于穩(wěn)定，苦蕎黃酒發(fā)酵液的還原能力也趨于穩(wěn)定。在第8 天時(shí)，苦蕎黃酒發(fā)酵液的還原能力是剛開始發(fā)酵時(shí)的5.5倍，還原能力較好。

圖8 苦蕎黃酒發(fā)酵過程中還原能力的變化曲線

3 結(jié)論

通過苦蕎黃酒發(fā)酵過程中主要功能性物質(zhì)含量和體外抗氧化活性規(guī)律來看，在發(fā)酵溫度35 ℃、糖化時(shí)間13 h、黃酒酵母接種量為苦蕎與糯米總質(zhì)量的0.2 %、苦蕎麥與糯米質(zhì)量比為3∶5.5（g∶g）的工藝下，發(fā)酵過程能極大促進(jìn)苦蕎和糯米中的功能性物質(zhì)溶出到苦蕎黃酒中，到發(fā)酵第8 天左右，功能性物質(zhì)含量和體外抗氧化能力趨于穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)波動變化趨勢，多酚含量最大為195.57 mg/L，黃酮含量最大為179.65 mg/L，還原糖含量在后期一直處于緩慢下降狀態(tài)，苦蕎黃酒發(fā)酵液對DPPH 自由基清除效率最大為93.59 %，清除能力較強(qiáng)，苦蕎黃酒對ABTS 自由基最大清除效率為65.31%，清除能力較弱，所以在苦蕎黃酒主發(fā)酵進(jìn)行到第8 天左右可以考慮停止其發(fā)酵過程。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)苦蕎黃酒在發(fā)酵前苦蕎與糯米的預(yù)處理，對苦蕎黃酒的品質(zhì)也有重要影響。苦蕎黃酒在發(fā)酵過程中，感官品質(zhì)受多重因素影響，因此對苦蕎黃酒的發(fā)酵工藝需進(jìn)一步深入研究。