廣西南寧火龍果潰瘍病病原菌鑒定與室內(nèi)藥劑毒力測定

葉維雁 潘如軍 黃秋偉 黃運鵬 鄭文武 單彬

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所 廣西南寧 530001）

火龍果（Hylocereus undulatesBritt.）又名紅龍果、青龍果和仙蜜果等，是仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）多年生植物[1-2]，原產(chǎn)于南美、北美及中美洲熱帶地區(qū)，目前在我國的廣西、海南、廣東、云南和福建等?。ㄗ灾螀^(qū)）均有大規(guī)模種植，是一種新興的熱帶亞熱帶果樹[3-5]，果實外形亮麗、口感清甜[6]。隨著火龍果種植面積的擴大，潰瘍病的危害日益突出，該病嚴(yán)重影響果實品質(zhì)和產(chǎn)量。2012 年在臺灣首次發(fā)現(xiàn)了火龍果潰瘍病由新暗色柱節(jié)孢引起[7]，之后在廣東、海南和貴州陸續(xù)的鑒定結(jié)果表明，火龍果潰瘍病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢[8-10]。目前，廣西南寧市火龍果年產(chǎn)量達32 萬t，占全國火龍果總產(chǎn)量的20%[11]，但當(dāng)?shù)鼗瘕埞麧儾〉牟≡形疵鞔_。本研究擬采用形態(tài)學(xué)觀察和分子序列分析法對南寧火龍果潰瘍病病原菌進行鑒定，并測定不同藥劑對該病原菌室內(nèi)毒力大小，以期為該病害的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品2021 年6 月在廣西南寧市桂熱1 號火龍果種植區(qū)采集具有典型潰瘍病癥狀的火龍果枝條裝入自封袋，拍照記錄癥狀特點，編號，帶回實驗室用于分離潰瘍病病原菌。采集健康無病蟲害的桂熱1 號火龍果枝條用于測定病原菌的致病性。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，杭州百思生物技術(shù)有限公司；Biospin 真菌基因組DNA 提取試劑盒，杭州博日科技有限公司；無水乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司；2×Es Taq Master Mix，康為世紀(jì)；瓊脂糖，Invitrogen；殺菌劑見表1。

表1 供試藥劑

1.1.3 儀器Easy Cycler 梯度PCR 儀，德國AnalytikJena；5200Multi 全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)，上海天能；DYY-8C 電泳儀電源和DYCP-31DN 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；徠卡DM2500 顯微鏡，Leica Microsystems。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化采用組織分離法[12]分離火龍果潰瘍病病原菌，培養(yǎng)基為PDA。用自來水將帶病枝條表面沖洗干凈，晾干。在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡枝條10 s，用無菌蒸餾水沖洗5 次，從病健交界處切取大小約5 mm×5 mm 的組織塊，將組織塊置于消毒濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)移到PDA 平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊周圍長出菌落后挑取邊緣菌絲進行純化，將純化后的菌株進行編號，并轉(zhuǎn)移到PDA斜面，于4℃保存待用。

1.2.2 病原菌的致病性測定利用柯赫氏法則測定病原菌的致病性。采用離體枝條接種法，將4℃保存的病原菌菌株接種到PDA 平板上活化，至菌落長滿培養(yǎng)皿，待用；用自來水洗凈火龍果枝條，經(jīng)75%酒精表面消毒、無菌蒸餾水沖洗5次后，晾干備用；用牙簽輕輕地刺破枝條表皮，用直徑為5 mm 的打孔器在菌落邊緣取菌餅緊貼于被刺傷的枝條表面，將略大于菌餅的無菌濾紙片覆蓋于菌餅，滴加無菌蒸餾水保濕，以接種無菌PDA 培養(yǎng)基的枝條為對照（牙簽和打孔器均經(jīng)過無菌處理)，處理5 根枝條，重復(fù)3 次；將接種后的枝條置于無菌保鮮盒中，盒底鋪浸透無菌蒸餾水的濾紙，置于室溫下，自然光照；每日觀察記錄枝條發(fā)病情況，若發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同且對照不發(fā)病，則對發(fā)病枝條病變部位進行病原菌再分離，并鑒定分離到的病原菌是否與原始病菌相同。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定將病原菌接種在PDA 培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)及顏色，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子形態(tài)特征，參照相關(guān)資料[13]，進行分類學(xué)鑒定。

1.2.4 病原菌的分子鑒定將分離到的病原菌于PDA 平板上活化5 d 后，用接種針刮下培養(yǎng)基表面的菌絲并收集至2 mL 平底離心管中，采用Biospin 真菌基因組 DNA 提取試劑盒提取病原菌DNA，于－20℃保存?zhèn)溆?。以病原菌DNA 為模版，用通用引物ITS1（5′—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3′）和ITS4（5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′）[14]進行PCR 擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。40 μL PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L 上下游引物各1 μL、2×Es Taq Master Mix 20 μL、DNA 模版1 μL，加ddH2O至40 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳驗證正確后，將擴增產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序所得序列于NCBI 網(wǎng)站上與已知序列進行BLAST 序列比對，用MEGA 6.06 軟件以鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 藥劑室內(nèi)毒力測定選用市面上常見的5種殺菌劑（表1）進行試驗，以菌絲生長速率法測定殺菌劑對火龍果潰瘍病病原菌的室內(nèi)抑菌活性。在無菌操作條件下，用無菌蒸餾水將供試殺菌劑配成5 個濃度梯度的藥液，用10 mL 量杯量取9 mL PDA 培養(yǎng)基（約55℃）倒于培養(yǎng)皿中；再用移液槍吸取1 mL 藥液滴加到PDA 培養(yǎng)基中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使藥液和培養(yǎng)基混合均勻，每種殺菌劑均制備成5 個濃度的梯度平板（表1），另以1 mL 無菌蒸餾水和9 mL PDA 培養(yǎng)基混合形成的平板作為對照；用直徑為5 mm 的無菌打孔器在活化適齡的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接于含藥平板和空白對照平板中央，每個平板接種1個菌餅，共25 個處理，每個處理3 次重復(fù)；將接種后的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑并計算抑菌率，用DPS 軟件進行數(shù)據(jù)分析，求出各殺菌劑對病原菌的毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)EC50值大小評價不同藥劑的抑菌效果。

抑菌率=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/(對照菌落直徑－菌餅直徑)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果潰瘍病田間癥狀

該病危害火龍果莖稈和果實，從嫩芽抽生到開花結(jié)果期間均可發(fā)生。莖稈發(fā)病癥狀（圖1-a）為：初期表面出現(xiàn)近圓形凹陷的褪綠病斑，病斑逐漸轉(zhuǎn)為橘黃色，嚴(yán)重時病斑成片發(fā)生，甚至布滿病枝；后期形成較大的灰白色潰瘍斑，病斑中央略微凹陷，四周稍微隆起，病斑上常產(chǎn)生小黑點，部分病斑邊緣形成水漬狀，嚴(yán)重時整根枝條腐爛。

圖1 火龍果潰瘍病發(fā)病癥狀

2.2 病原菌分離與形態(tài)特征

通過分離和純化，共獲得15 個病原菌菌株，這些菌株在PDA 平板上的性狀表現(xiàn)一致。選取其中代表性菌株P(guān)KY01 進行形態(tài)特征觀察，該菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長較快，28℃培養(yǎng)2 d 即可形成白色圓形菌落，呈絨毛狀，菌絲白色稀疏，邊緣整齊，呈輻射狀向外擴展（圖2-a、2-b）；3 d后菌落長滿培養(yǎng)皿（90 mm）；5 d 后，菌落逐漸轉(zhuǎn)為灰綠色，氣生菌絲長而稀疏（圖2-c、2-d）；7 d 后菌落逐漸轉(zhuǎn)為黑色；10 d 后培養(yǎng)基除中圈外完全變黑（圖2-e、2-f）。病原菌菌絲斷裂形成節(jié)孢子鏈，節(jié)孢子形態(tài)多樣，為橢圓形、卵圓形、圓形或桿狀（圖3-a）；節(jié)孢子細(xì)胞壁加厚，形成厚垣孢子，呈橢圓形或卵圓形（圖3-b）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步判定病原菌為新暗色柱節(jié)孢。

圖2 病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 病原菌顯微形態(tài)(400×)

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

病原菌菌株 PKY01(OP522024)、PKY02(OP522025)和PKY03(OP522026)的ITS 序列測序長度均為 553 bp。將其序列在 NCBI 上進行BLAST 比對，結(jié)果顯示，3 個ITS 序列與4 株新暗色柱節(jié)孢（JX473739、JX524168、OP271888和OP271889）的ITS 核苷酸序列同源性均達到100%。選取Genebank 登錄的同源性高低不同的菌株ITS 序列，利用MEGA 軟件的鄰接法對病原菌菌株的ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，病原菌菌株P(guān)KY01、PKY02、PKY03 與4株新暗色柱節(jié)孢（JX473739、JX524168、OP271888和OP271889）位于同一分支。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及rDNA-ITS 序列分析結(jié)果，將火龍果潰瘍病病原菌鑒定為新暗色柱節(jié)孢。

圖4 基于ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌的致病性測定

將分離得到的新暗色柱節(jié)孢菌株接種到火龍果健康枝條上，接種第10 天出現(xiàn)與田間自然發(fā)病形態(tài)相似的潰瘍病斑（圖1-a、1-b），而對照未發(fā)?。▓D1-c）。在接種枝條上取發(fā)病組織分離，重新獲得了新暗色柱節(jié)孢菌，完成柯赫氏法則驗證，證明火龍果潰瘍病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢。

2.5 藥劑室內(nèi)毒力測定

室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果（表2）表明，5 種殺菌劑對火龍果潰瘍病病原菌菌絲生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中春雷·王銅·噻鋅的抑菌效果最好，EC50為0.195 0 mg/L；吡醚·代森聯(lián)和春雷·喹啉銅也有較好的抑菌效果，EC50分別為1.157 0 和1.193 2 mg/L；苯甲·嘧菌酯的抑制效果較差，EC50為2.468 8 mg/L，大于2 mg/L；多菌靈對病原菌的毒力最弱，EC50高達4.016 3 mg/L。

表2 五種藥劑對火龍果潰瘍病病原菌的室內(nèi)毒力

3 討論與結(jié)論

目前，在傳統(tǒng)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)鑒定的基礎(chǔ)上，ITS 片段被推薦作為真菌的DNA 條形碼[15]，已被廣泛應(yīng)用于果樹真菌病原菌的種類鑒定[16-19]，極大地提高了果樹病原種類鑒定的準(zhǔn)確度。本研究從廣西南寧市火龍果潰瘍病病樣中分離獲得病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、致病性驗證和基于rDNA-ITS 序列分析的分子生物學(xué)鑒定，明確火龍果潰瘍病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum），與國內(nèi)相關(guān)報道的研究結(jié)果[8-10,20-21]一致。

火龍果潰瘍病近年來對火龍果產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，是火龍果最嚴(yán)重的病害之一，殺菌劑是有效防控火龍果潰瘍病的重要手段。對于該病害的防治研究已有相關(guān)報道，賢小勇等[22]認(rèn)為，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和戊唑醇對火龍果潰瘍病均具有良好的防效，可作為防治火龍果潰瘍病的藥劑在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用；魏雅麗等[23]通過抑菌實驗，從抑菌圈的大小初步鑒定多菌靈為火龍果潰瘍病的有效殺菌劑。本研究采用菌絲生長速率法測定5 種常用殺菌劑對火龍果潰瘍病病原菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果顯示，5 種殺菌劑對火龍果潰瘍病病原菌菌絲生長均具有一定的抑制作用，其中70%春雷·王銅·噻鋅水劑對病原菌的抑制作用最強，EC50為0.195 0 mg/L，其次為60%吡醚·代森聯(lián)水分散粒劑和 42%春雷·喹啉銅懸浮劑，EC50分別為1.157 0 和1.193 2 mg/L。本研究測得多菌靈的EC50為4.016 3 mg/L，高于王會會等[9]測得的0.183 2 mg/L，可能是因為不同的病原菌菌株對多菌靈的敏感性存在較大差異。

藥劑室內(nèi)毒力是通過殺菌劑與病原菌菌絲直接接觸時產(chǎn)生的效果來測定，是衡量殺菌劑對病原菌毒力作用大小的指標(biāo)之一，但其結(jié)果僅代表藥劑對病菌的室內(nèi)抑制效果，具有局限性，田間防治效果不僅與藥劑室內(nèi)毒力有關(guān)，還與病原菌的孢子[24]、殺菌劑的特性[25-27]、寄主植物的生長環(huán)境[28]和生長狀況等因素有關(guān)。因此，基于本研究的試驗結(jié)果，后期擬選用70%春雷·王銅·噻鋅水劑、60%吡醚·代森聯(lián)水分散粒劑和42%春雷·喹啉銅懸浮劑進行更接近生產(chǎn)實際的田間藥效試驗，明確適合田間防治火龍果潰瘍病的殺菌劑，為火龍果潰瘍病防治提供理論依據(jù)。