市售11種煎煮類中藥飲片微生物污染情況考察

楊昊,周爽,楊戈,龐慶林,張蕾

(江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210019)

中藥飲片是指藥材經(jīng)過炮制后可直接用于中醫(yī)臨床或制劑生產(chǎn)使用的藥品[1]。中藥飲片絕大部分來源于動(dòng)物、植物或礦物,炮制方法有凈制、切制、蒸煮、發(fā)酵等,其自身的這些特點(diǎn)導(dǎo)致其微生物載量居高不下,所以中藥飲片的衛(wèi)生質(zhì)量一直是風(fēng)險(xiǎn)隱患之一。近年來,隨著中醫(yī)藥行業(yè)在世界臨床醫(yī)學(xué)地位和國(guó)際影響力進(jìn)一步提升[2],中藥飲片的質(zhì)量控制越發(fā)重要。但《中國(guó)藥典》2020年版僅對(duì)中藥提取物、直接口服及泡服飲片等做了微生物限度規(guī)定,而臨床應(yīng)用最廣的煎煮類飲片未規(guī)定限度標(biāo)準(zhǔn)[3]。煎煮類中藥飲片品種繁多、炮制方法多樣,短時(shí)間內(nèi)難以制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過分析11種煎煮類中藥飲片的微生物污染情況,研究多種類別飲片的微生物負(fù)載水平,為今后《中國(guó)藥典》中藥飲片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供數(shù)據(jù)支撐,為監(jiān)管工作的開展提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 生物安全柜(Thermo,AII級(jí));生化培養(yǎng)箱(Memmert IF450PLUS和HHP400);顯微鏡(Nikon Eclipse 55i);VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(Biomerieux,Vitek 2 compact15);水浴恒溫振蕩器(Memmert WNB45)。

1.2 試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20170108)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20170102)、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(批號(hào) ：20160112)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(含抗生素)(批號(hào)：20170120)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20160701)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20160728)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20151012)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20161222)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20151019)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20160327)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20161016),均為干粉培養(yǎng)基,按《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則[4]進(jìn)行配制、滅菌,培養(yǎng)基適用性檢查均合格。MUG培養(yǎng)基(批號(hào)：161225),沙門氏菌干制生化鑒定盒(批號(hào)：161124),大腸埃希氏菌干制生化鑒定盒(批號(hào)：161104),以上購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)樣品 中藥飲片購(gòu)自醫(yī)院、市各大藥房(南京大華中藥店、益豐大藥房、樂富來大藥房、先聲再康藥店等)、飲片廠、藥企等。來源于不同產(chǎn)地,均為植物類,有根類、莖類、花類、果實(shí)類、種子類等,共11個(gè)品種101批次,詳見表1。

表1 11種煎煮類中藥飲片樣品信息

1.4 菌種和菌液制備 大腸埃希菌[CMCC(44102)]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104],以上菌種購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌管理保藏中心,均為第3代,經(jīng)菌種驗(yàn)收合格。

2 方法

本試驗(yàn)的所有培養(yǎng)基和101批飲片樣品均按照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”進(jìn)行了培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)和中藥飲片的方法適用性試驗(yàn)。結(jié)果表明,培養(yǎng)基均符合要求,且飲片樣品的方法適用性良好。

2.1 供試液制備 取25 g供試品,加入225 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,制成1∶10供試液,45 ℃水浴振蕩不少于15 min。

2.2 需氧菌總數(shù)TAMC,霉菌和酵母菌總數(shù)TYMC和耐熱菌NAIRE的測(cè)定方法按照《中國(guó)藥典》 2020 年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”。取1∶10供試液1 mL及5～7個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)10倍遞增稀釋,每個(gè)稀釋級(jí)制備2個(gè)平皿,以TSA和含0.1‰氯霉素的SDA注皿,培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)長(zhǎng)得到TAMC和TYMC。另取1∶10供試液于冷水中,加熱煮沸30 min,迅速冷卻后,同TAMC測(cè)定法進(jìn)行耐熱菌數(shù)測(cè)定。結(jié)果以常用對(duì)數(shù)形式表示。

2.3 控制菌的檢查

2.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查 參照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”進(jìn)行耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。取相當(dāng)于0.1、0.01和0.001 g……(連續(xù)5～7個(gè)稀釋級(jí))的預(yù)培養(yǎng)供試液及其稀釋液。

2.3.2 大腸埃希菌檢查 取“2.1”項(xiàng)下1∶10的供試液10 mL,參照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”檢查大腸埃希菌。

2.3.3 沙門菌檢查 參照《中國(guó)藥典》2020年版通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”檢查沙門菌。

2.4 微生物限度判定參考標(biāo)準(zhǔn) 《美國(guó)藥典》(USP43)、《歐洲藥典》(EP10.0)、《日本藥典》(JP17)中對(duì)與煎煮類中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼?天然藥物)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)做了規(guī)定,結(jié)果見表2。

表2 USP43、EP10.0和JP17中植物藥(天然藥物)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

3 結(jié)果

3.1 中藥飲片中需氧菌總數(shù)(TAMC)的檢查結(jié)果 101批飲片樣品的lgTAMC(需氧菌總數(shù)的lg值)均值為3.6,小于6.0,表明中藥飲片樣品的需氧菌總數(shù)總體水平符合美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn);lgTAMC的最大值在7.2,說明有部分樣品超出美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn),為不合格飲片樣品。lgTAMC的最大值與最小值差為5.9,表明飲片受微生物污染程度差距相當(dāng)大。以101批中藥飲片的需氧菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、lgTAMC頻率為縱坐標(biāo),畫出直方圖和分布曲線(見圖1),由圖可知101批中藥飲片中,90%lgTAMC值小于6.0,符合美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn)。以中藥飲片品種為橫坐標(biāo)、需氧菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作箱式圖(結(jié)果見圖2),由圖2可知,姜半夏(S2)lgTAMC值為1.3～2.3、法半夏(S3)lgTAMC值為2～2.4、梔子(S4)lgTAMC值為2.1～2.8、生天南星(S9)lgTAMC值為2.3～2.8,表明這4個(gè)品種微生物污染水平低,且批間差異小,質(zhì)量穩(wěn)定;制天南星(S8)lgTAMC值為2.1～6,該品種污染微生物的批間差異最大,質(zhì)量最不穩(wěn)定;鹽車前子(S6)的lgTAMC值相較車前子(S5)的lgTAMC值明顯降低,對(duì)S6和S5兩種中藥飲片進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),P<0.05存在顯著性差異,表明飲片樣品的炮制工藝如鹽炒等加熱炮制工藝可降低TAMC生物負(fù)載;地膚子(S10)lgTAMC值為4.1～7.2,在本次檢測(cè)的所有飲片樣品中最高,均值與中位數(shù)也高出其他所有飲片樣品,表明其TAMC生物負(fù)載相當(dāng)高,部分樣品超出了美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn),即不符合三國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 101批中藥飲片樣品lgTAMC分析

圖2 中藥飲片不同品種lgTAMC分析

3.2 中藥飲片霉菌和酵母菌總數(shù)(TYMC)檢查結(jié)果 101批飲片樣品的lgTYMC(霉菌和酵母菌總數(shù)的lg值)均值為2.3,中位數(shù)為1.9,低于4.0,表明中藥飲片樣品的TYMC總體水平符合美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn);lgTYMC的最大值在5.7,說明也有部分樣品超出美國(guó)、歐洲和日本藥典標(biāo)準(zhǔn),為不合格飲片樣品。lgTYMC的最大值與最小值差為5.2,表明飲片受微生物污染水平差距相當(dāng)大。以101批中藥飲片的霉菌和酵母菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、lgTYMC頻率為縱坐標(biāo),畫出直方圖和分布曲線(見圖3);可知101批中藥飲片中,80%lgTYMC值小于5.0,符合《歐洲藥典》和《日本藥典》標(biāo)準(zhǔn),65%lgTYMC值小于4.0,符合《美國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。以中藥飲片的品種為橫坐標(biāo)、lgTAMC值為縱坐標(biāo),作箱式圖(見圖4)。由圖4可知,在11種中藥飲片的lgTYMC均值中僅有1批(地膚子S10)超過4.0,表明這11種中藥飲片的TYMC生物負(fù)載相對(duì)較低。生天南星(S9)和太子參(S11)的lgTYMC值在1.0～1.9之間,表明這兩個(gè)品種TYMC污染水平較低,批間差異小,質(zhì)量穩(wěn)定;天花粉(S7)的lgTYMC值在1.3～3.9之間,表明其TYMC污染水平批間差異大,質(zhì)量最不穩(wěn)定;鹽車前子(S6)的lgTYMC值相較車前子(S5)的lgTYMC值明顯降低,對(duì)S6和S5兩種中藥飲片進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),結(jié)果與TAMC生物負(fù)載情況一樣,P值<0.05,存在顯著性差異,表明飲片樣品的炮制工藝如鹽炒等加熱炮制工藝可降低中藥飲片TYMC生物負(fù)載;地膚子(S10)lgTYMC值為3.0～5.7,在本次檢測(cè)中遠(yuǎn)高出其他飲片樣品,表明其TYMC生物負(fù)載相當(dāng)高, lgTYMC的中位數(shù)為4.2,即一半以上的地膚子飲片不符合《美國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 101批中藥飲片樣品lgTYMC分析

圖4 中藥飲片不同品種lgTYMC分析

3.3 中藥飲片耐熱菌數(shù)(NAIRE)檢查結(jié)果 101批飲片樣品的lgNAIRE(耐熱菌總數(shù)的lg值)均值為1.5,中位數(shù)為1.3,整體水平較之lgTAMC值均有大幅下降,平均下降2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。以101批中藥飲片的耐熱菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、lgNAIRE頻率為縱坐標(biāo),畫出直方圖和分布曲線(見圖5);以中藥飲片品種為橫坐標(biāo)、耐熱菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作箱式圖(見圖6)。由圖5及圖6可知,中藥飲片樣品按《中國(guó)藥典》方法在經(jīng)過100 ℃ 30 min處理后所有樣品仍有耐熱菌檢出,但與未熱處理的需氧菌數(shù)相比有明顯下降,熱處理后35%左右的lgNAIRE值在1.0以下,65%以上的lgNAIRE值降到2.0以下,僅有不足5%飲片樣品的lgNAIRE值大于5.0?？梢姛崽幚韺?duì)該11個(gè)品種的中藥飲片lgNAIRE均有一定的降低作用。對(duì)部分污染較為嚴(yán)重的中藥飲片進(jìn)行了耐熱菌的分離鑒定,鑒定結(jié)果顯示,耐熱菌大部分為芽孢桿菌,車前子中檢出嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌等;地膚子中檢出嗜熱芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌;天花粉中檢出枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。這些芽孢桿菌本身耐熱性強(qiáng),不易被殺滅,因此熱處理對(duì)該類菌滅活效果不理想,仍有細(xì)菌毒素等潛在安全風(fēng)險(xiǎn)存在的可能性?，F(xiàn)行各國(guó)藥典對(duì)耐熱菌的控制均未有相關(guān)規(guī)范和檢查標(biāo)準(zhǔn),這也是中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)久以來難以確定的難點(diǎn)之一,煎煮類中藥飲片日常服用時(shí)也僅通過簡(jiǎn)單的煎煮,還是存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn),因此中藥飲片中的耐熱菌污染需引起足夠重視,健全相關(guān)法規(guī)。

圖5 101批中藥飲片樣品lgNAIRE分析

圖6 中藥飲片不同品種lgNAIRE分析

3.4 中藥飲片控制菌檢查結(jié)果 《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1107“微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”中對(duì)直接口服及泡服飲片的控制菌作出相關(guān)規(guī)定：不得檢出大腸埃希菌(1 g或1 mL);不得檢出沙門菌(10 g或10 mL);耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于104cfu(1 g或1 mL)。對(duì)中藥提取物和煎煮類中藥飲片未作規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為參考判定依據(jù)。

3.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌(G-) 對(duì)耐膽鹽革蘭陰性菌計(jì)數(shù)結(jié)果(G-)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),G-計(jì)數(shù)結(jié)果<10 cfu·g-1以lg值0.5計(jì),10 cfu·g-1< G-<102cfu·g-1以lg值1.5計(jì),102cfu·g-1< G-<103cfu·g-1以lg值2.5計(jì),以此類推,做箱式圖(見圖7)。由圖7可知,姜半夏(S2)、法半夏(S3)、生天南星(S9)的lgG-值較低,大部分的G-<10,鹽車前子(S6)、制天南星(S8)的lgG-值相對(duì)較低,大部分的G-<102;夏枯草(S1)、梔子(S4)、太子參(S11)的lgG-值較高(G-<104),符合《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1107中同類標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(直接口服及泡服飲片);車前子(S5)、天花粉(S7)、地膚子(S10)的lgG-值很高(G-<105),其中車前子有2批、天花粉有2批、地膚子有9批結(jié)果G->104,不符合《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1107中同類標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(直接口服及泡服飲片)。此外,lgG-值與lgTAMC值存在一定的正相關(guān)性,即lgTAMC值較高的中藥飲片,一般lgG-值也較高。對(duì)紫紅膽鹽平皿上分離出的耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行鑒定,其中車前子中檢出陰溝腸桿菌、傷口埃希菌、泛菌屬以及肺炎克雷伯菌等;地膚子中檢出陰溝腸桿菌、泛菌屬和阪崎腸桿菌;天花粉中檢出陰溝腸桿菌、泛菌屬和肺炎克雷伯菌,均為致病菌或條件致病菌[4-7]。

圖7 中藥飲片不同品種lgG-分析

3.4.2 大腸埃希菌、沙門菌 101批中藥飲片中有13批檢出大腸埃希菌,包含夏枯草、車前子和地膚子;檢出沙門菌的為地膚子3批,且其中2批同時(shí)檢出大腸埃希菌。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出,地膚子中藥飲片這一品種生物負(fù)載較高,TAMC、TYMC、NAIRE及G-也均高于其余品種的中藥飲片,這也與該品種的自身特點(diǎn)及炮制工藝有關(guān)。

4 討論

本研究通過對(duì)11個(gè)品種共計(jì)101批煎煮類中藥飲片進(jìn)行微生物污染程度的考察,初步建立了相關(guān)品種的微生物負(fù)載數(shù)據(jù)庫。這11個(gè)品種的中藥飲片均為煎煮類,《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則僅對(duì)中藥提取物和直接口服及泡服飲片做了微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,煎煮類中藥飲片還未出臺(tái)相關(guān)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。在現(xiàn)行各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)中,USP、EP、JP對(duì)與煎煮類中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼?天然藥物)的微生物限度均有規(guī)定,其中美國(guó)對(duì)使用前用沸水處理的植物產(chǎn)品工藝要求不同[4],故USP43制訂的標(biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)格,微生物限度比JP17和EP10.0低了1個(gè)數(shù)量級(jí)。上述101批中藥飲片符合USP標(biāo)準(zhǔn)的為52批,合格率僅為51.5%;符合EP10.0和JP17標(biāo)準(zhǔn)的為99批,合格率98.0%。這些飲片問題項(xiàng)目主要體現(xiàn)在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及耐膽鹽革蘭陰性菌的微生物負(fù)載較高。

從藥材類別來看,礦物藥的微生物負(fù)載較低,植物藥和動(dòng)物藥微生物負(fù)載較高,植物藥和動(dòng)物藥的微生物負(fù)載無顯著性差異,這與微生物的生長(zhǎng)過程中受藥材成分影響相關(guān),不同種類微生物對(duì)藥材種類有選擇特異性[8];對(duì)植物藥,通常全草類、花粉類、種子類、塊根類中藥飲片微生物負(fù)載較高,皮類、莖類、果實(shí)類中藥飲片微生物負(fù)載相對(duì)較低;中藥飲片中有抑菌成分的品種微生物負(fù)載較低[9];不同產(chǎn)地加工及炮制方法對(duì)微生物的污染情況也有影響,直接切制、曬干的中藥飲片微生物負(fù)載較高,煮制、炒制和蒸制等涉及熱炮制工藝的中藥飲片微生物負(fù)載較低,如本研究中的車前子和鹽車前子(熱炮制工藝)的微生物負(fù)載就存在顯著性差異(P<0.05)。

中藥作為我國(guó)古代文化傳承的瑰寶,我國(guó)藥典中收載的藥材品種要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于國(guó)外藥典,目前已有直接口服及泡服中藥飲片標(biāo)準(zhǔn),但煎煮類中藥飲片還缺少相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限度進(jìn)行監(jiān)管,微生物風(fēng)險(xiǎn)長(zhǎng)期存在。煎煮類中藥飲片涉及面廣,日常需求量大,因此煎煮類中藥飲片微生物污染數(shù)據(jù)的積累和微生物危害的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作更加迫在眉睫。作為中藥大國(guó),我們目前應(yīng)多積累國(guó)內(nèi)各中藥飲片相關(guān)的微生物污染數(shù)據(jù),分析各個(gè)品種的微生物負(fù)載水平和影響因素[10],才能在中藥飲片各個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行把控,指導(dǎo)完善飲片的合理加工炮制、企業(yè)的規(guī)范生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)的科學(xué)儲(chǔ)運(yùn)等,為完善中藥材監(jiān)管打下基礎(chǔ)。這是中國(guó)藥典的中藥標(biāo)準(zhǔn)引領(lǐng)國(guó)際中藥發(fā)展的必經(jīng)之路[11],也是中藥走向世界的關(guān)鍵。