呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)特征

張頌安， 劉 軒， 趙珮杉， 高廣磊,2,3， 張 英,3，丁國棟,2,3， 柳 葉， 任 悅

（1.北京林業(yè)大學(xué)水土保持學(xué)院，林業(yè)生態(tài)工程教育部工程研究中心，北京 100083；2.寧夏鹽池毛烏素沙地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，寧夏 鹽池 751500；3.水土保持國家林業(yè)和草原局重點實驗室，北京 100083）

土壤細(xì)菌是土壤微生物組的重要類群，也是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組分［1］。土壤細(xì)菌驅(qū)動陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動，在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)和修復(fù)方面發(fā)揮著不可替代的重要作用［2］。一般認(rèn)為，氣候、植被、土壤等環(huán)境因素是影響土壤細(xì)菌群落組成和功能動態(tài)的關(guān)鍵因子［3-5］。此外，土壤細(xì)菌間的相互關(guān)系與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也密不可分。研究表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)龐大，相互關(guān)系復(fù)雜，土壤細(xì)菌之間既有積極的協(xié)同作用，又有消極的拮抗作用，這些復(fù)雜的相互關(guān)系在細(xì)菌群落的塑造上發(fā)揮著重要作用，同時對維持生態(tài)系統(tǒng)功能和服務(wù)的影響也十分重要［5-7］。但是，由于傳統(tǒng)土壤細(xì)菌相互關(guān)系識別和判定方法的局限性，使我們對于土壤細(xì)菌相互關(guān)系依然缺乏全面深入的了解。

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析是一種新興的探索性數(shù)據(jù)分析方法，該方法基于隨機矩陣?yán)碚?，結(jié)合基因測序技術(shù)，將微生物間的交互作用以及微生物系統(tǒng)穩(wěn)定性可視化。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)成為解析微生物間相互關(guān)系及其影響因素的重要手段［8-9］，該方法在閾值控制下可揭示微生物組中復(fù)雜的菌群關(guān)系以及鑒別關(guān)鍵菌種［10］。研究發(fā)現(xiàn)，中國北方森林較南方森林土壤微生物群落間關(guān)系更復(fù)雜［9］，南方紅壤區(qū)馬尾松林土壤微生物群落以負(fù)相關(guān)關(guān)系為主［10］，中國北方沙漠土壤細(xì)菌和真核生物相互作用，隨著年平均降水量的增加而增強［3］。細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)內(nèi)特定的相互作用可能增加或減少生物多樣性［9-10］，也正是因為具有這些相互作用，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)才可以更好的調(diào)度各種土壤細(xì)菌；當(dāng)群落受到擾動時，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)可以招募具有不同細(xì)菌組合的替代途徑來實現(xiàn)特定功能，具有緩沖作用［5］。因此，分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析是進一步解析土壤細(xì)菌之間相互作用及其影響因素的重要手段，也是揭示土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)動態(tài)與生態(tài)過程和作用協(xié)同變化的重要途徑。

樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）是我國北方風(fēng)沙區(qū)防風(fēng)固沙的重要樹種［11］，土壤細(xì)菌間相互關(guān)系對樟子松林木生長和健康狀態(tài)具有重要影響［6,12］，土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的“緩沖”作用，在樟子松林抵抗環(huán)境變化方面發(fā)揮著重要作用［5］。鑒于此，以呼倫貝爾沙地25 年生、34 年生和43 年生樟子松人工林為研究對象（簡稱25 a、34 a和43 a），以臨近地段沙質(zhì)草地為對照，利用分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，揭示樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征及其影響因素，以期深入理解呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌相互關(guān)系，并為區(qū)域樟子松人工林可持續(xù)經(jīng)營提供理論依據(jù)和科技支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古海拉爾樟子松國家森林公園（119°31′～119°43′E，49°05′～49°13′N），海拔606 m，屬北溫帶大陸性半干旱氣候。年均氣溫-0.3 ℃，年均降水量359.4 mm，年均蒸發(fā)量1148.5 mm，年均日照時數(shù)2559 h，無霜期121 d左右。研究區(qū)主要土壤類型為暗栗鈣土地帶風(fēng)沙土，主要喬木植被有樟子松、蒙古櫟（Quercus mongolica）、楊樹（Populus tomentosa）、白樺（Betula platyphylla）等，主要草本植物有委陵菜（Potentilla chinensis）、針茅（Stipa capilla-ta）、羊草（Leymus chinensis）、狗尾草（Setaria viridis）和地榆（Sanguisorba officinalis）等。

1.2 樣品采集與處理

2018 年7 月，在內(nèi)蒙古海拉爾樟子松國家森林公園選取無經(jīng)營管理措施、林下植被相似的25 a、34 a 和43 a 樟子松人工林為研究對象，同時選取附近沙質(zhì)草地作為對照。在不同林齡的樟子松人工林及沙質(zhì)草地內(nèi)分別隨機布設(shè)50 m×50 m 的樣地（表1）。樣地內(nèi)進行每木檢尺后每塊樟子松人工林樣地隨機選取3 株標(biāo)準(zhǔn)木，在樹冠投影處采集土壤樣品，采集深度為0～10 cm和10～20 cm；沙質(zhì)草地樣地隨機選取3 個取樣點采集土壤樣品，樣品采集深度為0～10 cm和10～20 cm。每個取樣點的同一土層隨機采集3 個樣品后充分混合為1 個樣品，每份土壤樣品約為500 g，共24 份土壤樣品。采樣期間為防止土壤樣品污染，取土鉆和鐵鏟用75%酒精滅菌消毒。同時，分別用環(huán)刀和鋁盒采集土壤樣品，用于土壤含水量的測定。所有土壤樣品置于4 ℃便攜式保溫箱保存，運回實驗室后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

表1 呼倫貝爾沙地樟子松人工林樣地概況Tab.1 Basic information of P.sylvestris plantations sample plots in the Hulunbuir Desert

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

采用烘干法測定土壤含水量（Soil Water Content，SWC）。其余土壤樣品風(fēng)干后過2 mm 篩，用于土壤樣品化學(xué)性質(zhì)分析：采用靛酚藍(lán)比色法測定全氮（Total Nitrogen，TN）和氨氮（Ammonia Nitrogen，AN），采用重鉻酸鉀稀釋熱法測定土壤有機質(zhì)（Soil Organic Matter，SOM），采用鉬銻抗比色法測定速效磷（Available Phosphorus，AP），采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶含量（Catalase Activity，CA），采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性（Soil Urease，SU），采用Na2S2O3滴定法測定轉(zhuǎn)化酶活性（Invertase Activity，IA），采用氯仿熏蒸法測定微生物碳（Microbial Carbon，MC）［13］。

1.4 土壤細(xì)菌的分子鑒定

使用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒（MoBioLaboratories，Carlsbad，CA）對土壤細(xì)菌樣品進行DNA抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。隨后進行PCR擴增，擴增區(qū)域為16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)；擴增引物 序 列 為338F（5'CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）、806R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）；擴增條件為95 ℃預(yù)變性300 s，95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 個循環(huán)，土壤細(xì)菌樣品分兩層取樣，每層土壤細(xì)菌樣品做3 次重復(fù)，將同一樣品的DNA混合，作為每份土壤細(xì)菌樣品的總DNA。將土壤細(xì)菌樣品的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，再用Tris-HCl緩沖液洗脫，最后使用2%瓊脂糖電泳檢測［4］。

Illumina Miseq 文庫構(gòu)建之后進行Illumina Miseq 上機測序，測序完成后使用Trimmomatic、FLASH、Pear、usearch 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，基于Silva（Release128/132 http://www.arb-silva.de）、RDP（V16 http://rdp.cme.msu.edu/）和 Greengene（Release13.5 http://greengenes.secondgenome.com/）數(shù) 據(jù)庫，采用RDP Classifier 算法或blast、uclust consensus taxonomy assigner 等方法對OTU 代表序列進行比對分析，并對OTU 聚類統(tǒng)計的相似水平控制在97%，得到分類群的生物信息［14］。測序數(shù)據(jù)NCBI登錄號為PRJNA875585。

1.5 數(shù)據(jù)分析

篩選相對豐度大于5.00%的菌屬，保留其中在每個樣本中都出現(xiàn)的OTU，使用SPSS 24.0計算樣品OTU的Pearson相關(guān)性與顯著性值（r＞0.6和P＜0.05），之后使用RStudio計算Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣［15］。使用RStudio“igraph”包將相關(guān)系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)化為網(wǎng)絡(luò)文件并計算其總邊數(shù)、總點數(shù)、平均聚類系數(shù)、平均路徑長度、模塊化、平均連通度、中介中心性等拓?fù)涮卣鳎瑫r計算模塊內(nèi)連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）并進行網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的模塊角色判別［16］，包括模塊中心點（module hubs）、網(wǎng)絡(luò)中心點（network hubs）、連接節(jié)點（connectors）和外圍節(jié)點（peripherals）。通常，Zi≥2.5或Pi≥0.62的節(jié)點被認(rèn)為是關(guān)鍵物種（表2），其在模塊間和各自的模塊內(nèi)起重要作用。使用Gephi 0.9.2將網(wǎng)絡(luò)文件可視化并導(dǎo)出土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)圖中的每一個節(jié)點（node）代表一個OTU，連接節(jié)點之間的每條邊（edge）代表各OTU 之間的相關(guān)性，基于各OTU 之間的相關(guān)性，形成相互聯(lián)系的模塊，并計算模塊化（modularity）數(shù)值（模塊化大于0.44 時網(wǎng)絡(luò)圖有意義）。最后利用RStudio“igraph”包生成1000個節(jié)點和邊數(shù)與共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)相同的隨機網(wǎng)絡(luò)，計算拓?fù)鋮?shù)，比較其與細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的平均聚類系數(shù)，判別土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)凝聚性是否有意義。

表2 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的判別Tab.2 Discrimination of network nodes

為了分析細(xì)菌生態(tài)網(wǎng)絡(luò)與土壤因子的關(guān)系，選擇樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)最具代表性的OTU（中介中心性＞9000的OTU）與土壤因子建立網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。以中介中心性值與土壤因子進行Person相關(guān)性分析（r＞0.6 和P＜0.05）并使用Gephi 0.9.2 將土壤細(xì)菌與土壤因子互作圖可視化，最后導(dǎo)出土壤細(xì)菌與土壤因子相互作用圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)高連通性的拓?fù)湫再|(zhì)

呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌群落經(jīng)驗網(wǎng)絡(luò)模塊化、平均路徑長度和平均聚類系數(shù)明顯高于隨機網(wǎng)絡(luò)，符合網(wǎng)絡(luò)特征，可用于土壤細(xì)菌互作的研究（表3）。

樟子松人工林土壤細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞔嬖诿黠@林齡差異（表3，圖1）。從25 a 到43 a，土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)、平均連通度增加，總結(jié)點數(shù)和平均路徑長度降低；相比之下，草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)總結(jié)點數(shù)和總邊數(shù)多于人工林，但平均路徑長度比人工林要短?？傔厰?shù)越多，網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜［17］；平均路徑長度越低，網(wǎng)絡(luò)愈加緊密。從25 a到43 a，樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜和緊密；與人工林相比，草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜和緊密。

圖1 呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Co-occurrence network of soil bacterial communities of P.sylvestris plantations in the Hulunbuir Desert

樟子松人工林土壤細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞔嬖诿黠@土層差異（表3，圖1），表層土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)較下層總邊數(shù)、平均連通度、正相關(guān)關(guān)系占比更高，平均路徑長度更低。與之相反，草地表層土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)較下層總邊數(shù)、平均連通度、正相關(guān)關(guān)系占比更低，平均路徑長度更高。土壤深度由0～10 cm到10～20 cm，人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和緊密度降低；草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和緊密度增加。

2.2 樟子松土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的模塊特性和關(guān)鍵菌種

樟子松人工林和草地土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)外圍節(jié)點占總節(jié)點的99%以上，未檢測到模塊中心點和網(wǎng)絡(luò)中心點，共識別到11 個連接節(jié)點。其中，人工林連接節(jié)點10 個，分別隸屬于MB-A2-108、Subgroup_6、嗜 酸 菌 目（Acidimicrobiales）、Gaiellales、Subgroup_7、DA101_soil_group 和RB41；草地連接節(jié)點1個，隸屬于匿桿菌門（表4，圖2）。

圖2 呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌拓?fù)浣巧獸ig.2 Soil bacterial topological roles of P.sylvestris plantations in the Hulunbuir Desert

表4 呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)連接節(jié)點Tab.4 Connectors of soil bacterial network of P.sylvestris plantations in the Hulunbuir Desert

2.3 樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的影響因素

呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤理化性質(zhì)和酶活性波動性較強（表5）。從25 a到43 a，表層土壤全氮和有機質(zhì)含量顯著下降（P＜0.05），微生物碳含量先升高后降低（P＜0.05），過氧化氫酶和脲酶活性先降低后升高（P＜0.05）。沙質(zhì)草地土壤全氮含量顯著高于人工林（P＜0.05），脲酶活性顯著低于人工林（P＜0.05）。從25 a 到43 a，下層土壤全氮和微生物碳含量先上升后下降（P＜0.05），氨氮含量顯著下降（P＜0.05）。沙質(zhì)草地土壤轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于人工林（P＜0.05）（表5）。

表5 呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤理化性質(zhì)與酶活性Tab.5 Soil physical and chemical properties and soil enzyme activities of P.sylvestris plantations in the Hulunbuir Desert

呼倫貝爾沙地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中具有高中介中心性的部分菌種與土壤含水量、有機質(zhì)、速效磷、氨氮、全氮、微生物碳、氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶和脲酶顯著相關(guān)（P＜0.05），其中土壤有機質(zhì)影響最大（圖3）。土壤有機質(zhì)與微枝形桿菌屬（Microvirga）的OTU235和Burkholderia-Paraburkholderia的OTU451 呈 顯 著正相關(guān)（P＜0.05），與Gaiella的OTU29 和Acidobacteriaceae_Subgroup_1 的OTU544 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；土壤含水量和轉(zhuǎn)化酶與芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）的OTU145呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；全氮與RB41的OTU256 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；氨氮與Subgroup_6 的OTU194 和DA101_soil_group 的OTU2222 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；速效磷與Acidobacteriaceae_Subgroup_1 的OTU155 和MB-A2-108的OTU432 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；過氧化氫酶與Subgroup_6 的OTU12 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；脲酶與Burkholderia-Paraburkholderia的OTU451 呈 顯 著正相關(guān)（P＜0.05）；微生物碳與Roseiflexus的OTU773呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌與土壤因子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.3 Network of soil bacterial and soil factors of P.sylvestris plantations in the Hulunbuir Desert

3 討論

3.1 樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特征

呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)隨林齡呈現(xiàn)動態(tài)變化。從25 a 到43 a，土壤細(xì)菌雖然種類減少，但其網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜和緊密。研究發(fā)現(xiàn)，平均路徑長度越短，土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)物種間物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞的效率越高［10］，說明當(dāng)環(huán)境受到較大擾動時，人工林土壤細(xì)菌的響應(yīng)速度從25 a到43 a變快，抗干擾能力變?nèi)酰?xì)菌群落穩(wěn)定性變?nèi)酰?8］。這可能與樟子松人工林的衰老有關(guān)［19］。土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜，細(xì)菌間聯(lián)系頻繁可能就是為了抵抗人工林衰老帶來的負(fù)面影響。

與樟子松人工林相比，草地土壤細(xì)菌種類更為豐富、相互聯(lián)系增多，使得其網(wǎng)絡(luò)規(guī)模較大且更加復(fù)雜，這與前人研究結(jié)果一致［20］。這是因為樟子松根系可以通過分泌代謝物質(zhì)招募對其生長有利的土壤細(xì)菌，排斥對其生長有害的土壤細(xì)菌，宿主效應(yīng)種對土壤細(xì)菌進行篩選和過濾，使得人工林下土壤細(xì)菌多樣性和復(fù)雜性降低［21］。另外，草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)比人工林更加緊密，意味著草地細(xì)菌群落穩(wěn)定性比人工林差，這與前人研究結(jié)果一致［22］。

呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)在不同土壤深度中的拓?fù)涮卣鞑煌?。隨著土壤深度的增加人工林土壤細(xì)菌相互聯(lián)系減少、平均路徑長度增加，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和緊密性降低，這與前人研究結(jié)果一致［23］。這是因為研究樣地0～10 cm土層土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)要高于10～20 cm 土層［4］，土壤細(xì)菌群落具有明顯表聚性［24］。因此，相較于0～10 cm 土層，10～20 cm 土層土壤細(xì)菌數(shù)量少、遷移速率低，它們接觸產(chǎn)生聯(lián)系的機會變少，所形成的網(wǎng)絡(luò)較疏松。同時，0～10 cm土層營養(yǎng)物質(zhì)豐富、土壤孔隙較大、含氧量較高，這些環(huán)境因素適合土壤細(xì)菌的生長與交流［4］。另外，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中正負(fù)相關(guān)性分別可表示菌群之間的協(xié)同作用和拮抗作用［18］。土壤細(xì)菌間協(xié)同作用有助于土壤細(xì)菌生存繁衍和合作分解枯落物［18］，雖然土壤深度由0～10 cm 到10～20 cm，樟子松人工林土壤細(xì)菌間協(xié)同作用逐漸減弱，拮抗作用增強，但總體上還是協(xié)同作用占主導(dǎo)，這有助于土壤細(xì)菌群落更有效地分解枯落物并為樟子松的生長提供養(yǎng)分［25］。

3.2 樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種生態(tài)功能

不同林齡土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種不同，存在物種角色轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。不同林齡階段的土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種存在差異原因可能是土壤生境改變以及宿主根系分泌物招募策略變化導(dǎo)致群落網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的動態(tài)變化。25 a和34 a人工林關(guān)鍵菌種類型較少且多隸屬于放線菌門，隸屬于RB41、MB-A2-108、Gaiellales 和嗜酸菌目的部分細(xì)菌在樟子松與土壤碳氮磷交流中發(fā)揮重要作用［26-30］。其中隸屬于嗜酸菌目的細(xì)菌能夠?qū)⒅参锾烊划a(chǎn)生的腈分解為羧酸鹽和銨最后以碳源和氮源的形式被微生物和植物利用［28］。這可能是因為25 a和34 a人工林分別處于中林齡和近熟林階段，人工林與土壤細(xì)菌間養(yǎng)分交流密切，有利于促進植物生長［31］。43 a 人工林關(guān)鍵菌種類型最多，主要隸屬于酸桿菌門，除隸屬于Gaiellales 和RB41的OTU外，43 a人工林關(guān)鍵菌種還檢測 出 隸 屬 于Subgroup_6、Subgroup_7、和DA101_soil_group 的OTU。43 a人工林處于成熟林階段，養(yǎng)分歸還成為重要生態(tài)過程，隸屬于酸桿菌門的關(guān)鍵菌種在植物纖維素的分解上扮演著重要角色［32］。另外，有研究表明DA101_soil_group 是干旱草地的優(yōu)勢菌種并且干旱脅迫會導(dǎo)致Subgroup_7 菌的富集［33-34］。

不同植被土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種類型存在差異。人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種在類型上優(yōu)于草地。關(guān)鍵菌種類型越多，網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性越高［35］。從關(guān)鍵菌種角度出發(fā)，人工林網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性高于草地，這與本文研究結(jié)論一致。草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種隸屬于匿桿菌門，匿桿菌門細(xì)菌普遍存在腐生的生活方式，且偏好厭氧和富營養(yǎng)化的棲息地［36］。這說明草地土壤含氧量和孔隙度可能要低于人工林。

3.3 土壤因子對土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用

土壤理化性質(zhì)是呼倫貝爾沙地土壤細(xì)菌群落的驅(qū)動因素之一。其主要受土壤有機質(zhì)調(diào)控。研究表明，植被很大程度上影響土壤性質(zhì)，尤其是土壤碳含量［11］。有機質(zhì)作為土壤養(yǎng)分庫的重要組成部分，與不同土壤細(xì)菌呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系［37］，是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素［12］，這與本研究結(jié)果一致。土壤有機質(zhì)的增加和減少都可刺激土壤細(xì)菌的生命活動，土壤細(xì)菌通過一系列的生理反應(yīng)影響著植物對氮和磷的吸收和利用，土壤有機質(zhì)的供應(yīng)對森林的生長發(fā)育至關(guān)重要［38］。隨林齡增長，樟子松吸收和固定碳的能力、枯落物養(yǎng)分歸還碳的能力有著顯著差異［11］，土壤細(xì)菌群落主要從土壤有機質(zhì)分解中獲得碳源和能量，其活性主要受土壤碳含量和分解過程中微生物碳含量的影響，土壤細(xì)菌群落在樟子松林生長的每個階段都在通過調(diào)整群落內(nèi)部細(xì)菌活性來適應(yīng)變化的環(huán)境［39］。在此過程中，部分土壤細(xì)菌會斷開或是重新建立與其他細(xì)菌的聯(lián)系，這是一種更好的生存策略［40］。速效磷含量的變化顯著影響在土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要功能的某些菌種的同時［25］，氨氮和全氮對土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)也具有正向調(diào)控作用，這是因為氮、磷元素既是陸地生態(tài)系統(tǒng)最主要的限制性營養(yǎng)元素又是能夠影響土壤細(xì)菌群落代謝活性的重要元素［11,41］。土壤碳氮磷元素的循環(huán)是樟子松林生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分，土壤碳氮磷元素含量的變化可使土壤細(xì)菌互作種類發(fā)生變化（如拮抗和協(xié)同作用的轉(zhuǎn)變），從而改變土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性［25,37,42］。另外，氨氮和有機質(zhì)含量變化對微生物碳含量有重要影響［43］，微生物碳可反映土壤生物活性，也是土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的支撐基礎(chǔ)。全氮、氨氮和速效磷分別與隸屬于RB41、Subgroup_6 和MB-A2-108 的細(xì)菌有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而這些細(xì)菌的分類水平與關(guān)鍵菌種的分類水平有重疊，他們可能有著相同或類似的生態(tài)作用。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生擾動時，土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)可以招募這些細(xì)菌代替關(guān)鍵菌種發(fā)揮特定生態(tài)功能，以此來達(dá)到緩沖作用［5］。

酶也是呼倫貝爾沙地土壤細(xì)菌群落的驅(qū)動因素之一。土壤細(xì)菌群落調(diào)控因子的多樣性預(yù)示著呼倫貝爾沙地生態(tài)平衡不易被打破［37］。隨著沙地土壤養(yǎng)分的變化，細(xì)菌代謝途徑也變得多樣。細(xì)菌可分泌多種酶來降解這些復(fù)雜多樣的營養(yǎng)物質(zhì)［43］。本研究指出脲酶、過氧化氫酶和轉(zhuǎn)化酶是呼倫貝爾沙地物質(zhì)循環(huán)中不可或缺的重要酶種，扮演著重要角色。呼倫貝爾沙地降雨集中在夏秋季，降雨量的增加使得脲酶活性增加［44］，這使得土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中與脲酶聯(lián)系密切的部分細(xì)菌更加活躍，土壤細(xì)菌在脲酶催化作用下能夠更高效的分解枯落物［44］，而枯落物的分解能夠顯著提高土壤過氧化氫酶活性，這又使得土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中與過氧化氫酶聯(lián)系密切的部分細(xì)菌更加活躍，過氧化氫酶能酶促過氧化氫分解為水和氧，從而解除過氧化氫對植物的毒害作用［44-45］，另外，枯落物分解過程中轉(zhuǎn)化酶在葡萄糖轉(zhuǎn)化上有著突出貢獻［46］。土壤酶活性的提高有利于使更多土壤細(xì)菌通過網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生聯(lián)系，共同參與樟子松林物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程。

4 結(jié)論

（1）從25 a 到43 a，呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜和緊密，但土壤細(xì)菌群落對環(huán)境擾動的敏感性增加，43 a 人工林最易受到影響。土壤深度從0～10 cm 到10～20 cm，人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和緊密度降低，土壤細(xì)菌群落對環(huán)境擾動的敏感性下降；草地土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜和緊密，土壤細(xì)菌群落對環(huán)境擾動的敏感性增加。與草地相比，人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性較低。

（2）呼倫貝爾沙地不同林齡樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵菌種類型存在差異。25 a、34 a和43 a分別識別出3種、1種、6種不同類型的關(guān)鍵菌種，其中隸屬于酸桿菌門的關(guān)鍵菌種數(shù)量最多。草地關(guān)鍵菌種識別出1種，隸屬于匿桿菌門。

（3）呼倫貝爾沙地樟子松人工林土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)受土壤含水量、速效磷、有機質(zhì)、全氮、氨氮、微生物碳、脲酶、轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶等土壤理化性質(zhì)和酶活性驅(qū)動，且土壤有機質(zhì)對土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中具有高中介中心性的細(xì)菌影響最大。