男性煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

彭琳 譚巧文 韓瑩 趙靜怡 郭宗君

［摘要］ 目的 探討男性煙依賴者CDH23基因位點(diǎn)甲基化改變及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)系。

方法

選取青島某三甲醫(yī)院健康查體男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。應(yīng)用問卷調(diào)查方式搜集兩組研究對象一般資料，包括年齡、受教育程度、既往疾病史、煙依賴史等；采用彩色多普勒超聲儀器檢測頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度；采集血樣標(biāo)本，檢測CDH23基因位點(diǎn)甲基化數(shù)值；分析男性煙依賴者CDH23基因位點(diǎn)甲基化改變及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。

結(jié)果 煙依賴組和對照組一般資料包括年齡、文化程度、既往疾病史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；煙依賴組CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=－2.454、－2.436，P<0.05）；CpG246、CpG48位點(diǎn)甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度相關(guān)（F=6.235、4.692，P<0.05），低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著大于高甲基化水平。

結(jié)論 煙依賴者CDH23基因CpG位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 煙草對健康的危害；CDH23基因；甲基化；動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞黏附

［中圖分類號(hào)］ R543.5;R163

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0159－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.008

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

調(diào)查顯示，中國吸煙人群數(shù)量仍較多。煙依賴是慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CDH23基因編碼的鈣黏附素23，是鈣黏附素超家族中的典型成員，介導(dǎo)鈣離子依賴的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)黏附。一項(xiàng)對中國煙依賴人群的全基因組檢測結(jié)果顯示，煙依賴人群細(xì)胞黏附分子（鈣黏附素23）與煙依賴相關(guān)。DNA甲基化是基因組的表觀遺傳修飾，參與調(diào)控基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性。尼古丁是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。煙依賴者是否存在CDH23基因位點(diǎn)硬化發(fā)生相關(guān)，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文從臨床角度驗(yàn)證煙依賴是否會(huì)導(dǎo)致CDH23基因位點(diǎn)甲基化狀態(tài)改變，并進(jìn)一步探究這種甲基化狀態(tài)改變是否與頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取青島某三甲醫(yī)院健康查體的男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。所有研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：①男性，居住地長期住戶且年齡≥45歲；②煙依賴者與對照者之間排除血緣關(guān)系；③過去1年間無除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史；④獲得知情同意。煙依賴組入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國精神障礙診斷統(tǒng)計(jì)手冊第四版（DSM－IV）關(guān)于物質(zhì)依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②在過去1年內(nèi)每天吸煙≥10支，吸煙≥2年或戒煙<3個(gè)月。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①無煙依賴史或者明顯被動(dòng)煙依賴史，在入組前總計(jì)吸煙量＜5支；②無定期使用任何尼古丁替代品（例如尼古丁貼片、尼古丁口香糖等）或其他煙草制品（如電子煙、雪茄等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史（如藥物、乙醇等）；②有某種精神疾?。ㄈ缫钟簟⒕穹至寻Y等）或病史；③嚴(yán)重心腦疾病等多臟器功能障礙或無法配合臨床量表調(diào)查者。本研究得到青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的老年醫(yī)學(xué)科醫(yī)師，采用問卷調(diào)查方式收集研究對象一般資料，包括年齡、受教育年限、煙依賴史（初始吸煙年齡、每日吸煙數(shù)量、吸煙持續(xù)時(shí)間、戒煙時(shí)間等）、既往疾病史；應(yīng)用尼古丁依賴量表（FTND）評估煙依賴者對煙草的依賴程度。既往疾病史包括高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病史，其診斷根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 頸部血管超聲檢查 應(yīng)用GE LOGIQ E9型彩色多普勒超聲檢查設(shè)備，由同一人進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查，記錄研究對象頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度。根據(jù)2009年《血管超聲檢查指南》標(biāo)準(zhǔn)，頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）<1.0 mm 為正常，IMT≥1.0 mm為內(nèi)－中膜增厚。

1.2.3 CDH23基因甲基化檢測 采集受試對象空腹外周靜脈血5 mL，放入EDTA抗凝管中，再提取管中血樣1 mL放入EP管中，－80 ℃冰箱保存。CDH23基因甲基化檢測由上海天昊生物科技有限公司完成，檢測流程：①樣品質(zhì)控；②引物設(shè)計(jì)與單位點(diǎn)PCR條件優(yōu)化；③多重PCR引物panel優(yōu)化；④重亞硫酸鹽處理；⑤樣本目標(biāo)片段多重PCR反應(yīng)；⑥樣本添加特異性標(biāo)簽序列；⑦定量后上機(jī)測序，最終于Illumina Hiseq平臺(tái)上，以2×150 bp的雙端測序模式進(jìn)行高通量測序，獲得基因位點(diǎn)甲基化原始數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Shapiro－Wilks方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（頻率）表示，兩組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組間平均年齡、受教育年限比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；兩組間高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。煙依賴組初始吸煙年齡（24.06±7.48）歲，持續(xù)時(shí)間（31.45±9.36）年，每日吸煙量（20.73±9.92）支，F(xiàn)TND評分（6.38±1.30）分。

2.2 兩組CDH23基因甲基化位點(diǎn)差異比較

CDH23基因啟動(dòng)子存在4個(gè)完整的CpG島，分別為CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4，其中CDH23－1包含24個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－2包含17個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－3包含12個(gè)CpG位點(diǎn)，CDH23－4包含13個(gè)CpG位點(diǎn)。檢測兩組共計(jì)66個(gè)位點(diǎn)甲基化值，結(jié)果顯示煙依賴組CDH23－1片段中的CpG246位點(diǎn)、CDH23－2片段中的CpG48位點(diǎn)甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=－2.454、－2.436，P<0.05）。見表2。煙依賴組CDH23－1片段中的CpG110、CpG112、CpG127、CpG131、CpG135、CpG139、CpG147、CpG156、CpG162、CpG170、CpG191、CpG195、CpG200、CpG222、CpG224位點(diǎn)，CDH23－2片段的CpG36、CpG38、CpG43、CpG57、CpG60、CpG62、CpG64、CpG88、CpG101、CpG140、CpG152、CpG185位點(diǎn)，CDH23－3片段中的CpG50、CpG52、CpG62、CpG80、CpG91、CpG98位點(diǎn)，CDH23－4片段中的CpG33、CpG55、CpG89、CpG138、CpG166、CpG192、CpG208等40個(gè)位點(diǎn)甲基化程度均低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 兩組CDH23基因片段甲基化程度差異比較

以CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4所包含的位點(diǎn)的平均甲基化程度作為該片段的平均甲基化程度，煙依賴組各片段的平均甲基化程度均低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

根據(jù)CpG246、CpG48位點(diǎn)甲基化中位數(shù)（分別為0.010 556、0.056 351），將研究對象分為高甲基化組和低甲基化組，根據(jù)研究對象是否煙依賴分為煙依賴組和非煙依賴組，利用析因設(shè)計(jì)方差分析兩種因素（煙依賴和基因位點(diǎn)甲基化）與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系，結(jié)果顯示，CpG246位點(diǎn)、CpG48位點(diǎn)甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度相關(guān)，低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著大于高甲基化水平（F=6.235、4.692，P<0.05）。見表3、4。

3 討 論

CDH23基因位于染色體10q22.1上，其編碼的鈣黏附素23是鈣黏附素超家族中的一員，鈣黏附素是一種跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)黏附及細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。既往研究認(rèn)為，CDH23基因甲基化及多態(tài)性改變在聽力異常、癌癥和阿爾茨海默病中發(fā)揮作用，近年也有研究發(fā)現(xiàn)鈣黏附素23與煙依賴也密切相關(guān)。蛋白表達(dá)受基因調(diào)控，CDH23基因甲基化改變是否與煙依賴相關(guān)目前尚不清楚，CDH23基因甲基化水平是否與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。

本研究對CDH23基因位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示煙依賴組CpG246位點(diǎn)、CpG48位點(diǎn)甲基化水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明煙依賴可能導(dǎo)致CDH23基因位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變。有研究表明，70%的GpG島位于啟動(dòng)子區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)甲基化程度與基因表達(dá)程度相反，因此推測基因甲基化水平的降低可導(dǎo)致CDH23基因表達(dá)的增加，其編碼的鈣黏附素23表達(dá)增加，細(xì)胞間的黏附功能增強(qiáng)。HUAN等研究發(fā)現(xiàn)，許多與吸煙相關(guān)的頂級(jí)差異表達(dá)基因（包括LRRN3和GPR15）在啟動(dòng)子區(qū)域都有發(fā)生DNA甲基化改變的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在吸煙者中呈現(xiàn)低甲基化改變；隨后他們將這些差異表達(dá)基因位點(diǎn)與吸煙相關(guān)的疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示這些基因位點(diǎn)與腦血管疾病及肺部慢性疾?。宰枞苑渭膊　⒅夤苎椎龋┑陌l(fā)生顯著相關(guān)。

本文研究進(jìn)一步結(jié)合研究對象煙依賴情況分析CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)低甲基化水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系，結(jié)果顯示CpG246、CpG48兩個(gè)位點(diǎn)低甲基化水平時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度顯著高于高甲基化水平，推測煙依賴人群中CpG246、CpG48位點(diǎn)的低甲基化水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。鈣黏附素23介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的黏附，相關(guān)研究表明，其主要在神經(jīng)視網(wǎng)膜、耳蝸和前庭毛細(xì)胞的立體纖毛等部位表達(dá)，同時(shí)也在腦、心、血管、肺、腎、鼻、眼等細(xì)胞內(nèi)皮上廣泛表達(dá)。目前研究認(rèn)為，頸動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，細(xì)胞黏附分子作

為關(guān)鍵的成員參與了單核巨噬細(xì)胞的聚集、泡沫細(xì)胞的形成等環(huán)節(jié)。尼古丁被認(rèn)為是煙依賴的主要物質(zhì)及香煙致病的主要物質(zhì)，既往研究表明尼古丁可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促使內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子異常表達(dá)。細(xì)胞黏附異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。CDH23基因位點(diǎn)低甲基化改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)皮上鈣黏附素23表達(dá)增加，加強(qiáng)了細(xì)胞間的黏附，從而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

此前有大量的研究結(jié)果表明，異常的DNA甲基化改變包括異常的低甲基化和高甲基化，在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、巨噬細(xì)胞炎癥、血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、斑塊破裂和血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ISTAS等通過綜合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1和CRISP2 DMRs為大多數(shù)中心疾病相關(guān)的DNA甲基化生物標(biāo)志物，這種差異甲基化BRCA1和CRISP2區(qū)域通過焦磷酸測序檢測得到驗(yàn)證，并可在動(dòng)脈粥樣硬化病人的血液、主動(dòng)脈組織和頸動(dòng)脈斑塊材料中進(jìn)一步復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，煙依賴者CDH23基因CpG位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)。但本文僅對研究對象外周血樣本進(jìn)行甲基化檢測，結(jié)果不能完全代表研究對象動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮上發(fā)生的事件，因此需要進(jìn)一步取得病人的病理組織標(biāo)本進(jìn)行研究以驗(yàn)證本文結(jié)論。同時(shí)本文樣本量相對較少，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

［參考文獻(xiàn)］

王寧，馮雅靖，包鶴齡，等. 2014年中國40歲及以上人群吸煙現(xiàn)狀調(diào)查. 中華流行病學(xué)雜志， 2018，39（5）：551－556.

WADHWA R， PAUDEL K R， MEHTA M， et al. Beyond the obvious： smoking and respiratory infection implications on Alzheimers disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets， 2020，19（9）：698－708.

VANNIYA S P， SRISAILAPATHY C R S， KUNKA MOHANRAM R. The tip link protein Cadherin－23： from Hearing Loss to Cancer. Pharmacological Research， 2018，130：25－35.

VINK J M， SMIT A B， DE GEUS E J， et al. Genome－wide association study of smoking initiation and current smoking. American Journal of Human Genetics， 2009，84（3）：367－379.

ZHU X Y， LI J， DENG S Y， et al. Genome－wide analysis of DNA methylation and cigarette smoking in a Chinese population. Environmental Health Perspectives， 2016，124（7）：966－973.

吳慶園. 動(dòng)脈硬化評價(jià)方法及其風(fēng)險(xiǎn)因素干預(yù)研究. 合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 2019.

譚巧文，王曉林，劉彤云，等. 煙草依賴程度與大腦獎(jiǎng)賞網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性研究. 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志， 2021，36（2）：156－160.

魯玉潔.兒茶酚胺－o－甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性及甲基化與吸煙及頸動(dòng)脈硬化的關(guān)聯(lián)研究. 青島：青島大學(xué)， 2020.

HEATHERTON T F， KOZLOWSKI L T， FRECKER R C， et al. The fagerstrm test for nicotine dependence： a revision of the fagerstrom tolerance questionnaire. British Journal of Addiction， 1991，86（9）：1119－1127.

中國高血壓防治指南修訂委員會(huì)，高血壓聯(lián)盟（中國），中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)，等. 中國高血壓防治指南（2018年修訂版）. 中國心血管雜志， 2019，24（1）：24－56.

中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì). 中國2型糖尿病防治指南（2017年版）. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志， 2018，38（4）：292－344.

諸駿仁，高潤霖，趙水平，等. 中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）. 中國循環(huán)雜志， 2016，31（10）：937－953.

中國醫(yī)師協(xié)會(huì)超聲醫(yī)師分會(huì). 血管超聲檢查指南. 中華超聲影像學(xué)雜志， 2009，18（10）：911－920.

SHEN A J J， KING J， SCOTT H， et al. Insights into pituitary tumorigenesis： from Sanger sequencing to next－generation sequencing and beyond. Expert Review of Endocrinology & Metabolism， 2019，14（6）：399－418.

BOUZID A， SMETI I， CHAKROUN A， et al. CDH23 me－

thylation status and presbycusis risk in elderly women. Frontiers in Aging Neuroscience， 2018，10：241.

DE JAGER P L， SRIVASTAVA G， LUNNON K， et al. Alzheimers disease： early alterations in brain DNA methylation at ANK1， BIN1， RHBDF2 and other loci. Nature Neuroscience， 2014，17（9）：1156－1163.

HUAN T X， JOEHANES R， SCHURMANN C， et al. A whole－blood transcriptome meta－analysis identifies gene expression signatures of cigarette smoking. Human Molecular Genetics， 2016，25（21）：4611－4623.

BODA B， EL－AMRAOUI A， BAHLOUL A， et al. Myosin VIIa， harmonin and cadherin 23， three Usher I gene products that cooperate to shape the sensory hair cell bundle. The EMBO Journal， 2002，21（24）：6689－6699.

DI PALMA F， HOLME R H， BRYDA E C， et al. Mutations in Cdh23， encoding a new type of cadherin， cause stereocilia disorganization in waltzer， the mouse model for Usher syndrome type 1D. Nature Genetics， 2001，27（1）：103－107.

CALIGIURI G. CD31 as a therapeutic target in atherosclerosis. Circulation Research， 2020，126（9）：1178－1189.

ZHANG Y， MEI J， LI J， et al. DNA methylation in atherosclerosis： a new perspective. Evidence－Based Complementary and Alternative Medicine： ECAM， 2021，2021：6623657.

ISTAS G， DECLERCK K， PUDENZ M， et al. Identification of differentially methylated BRCA1 and CRISP2 DNA regions as blood surrogate markers for cardiovascular disease. Scientific Reports， 2017，7（1）： 5120.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）