菜心不同器官糖含量比較及代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

馮獻(xiàn)君，王麗，王彤，侯雷平，李梅蘭

菜心不同器官糖含量比較及代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

馮獻(xiàn)君1，王麗2，王彤1，侯雷平，李梅蘭

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801；2左權(quán)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山西左權(quán) 032600

【目的】菜心口感脆嫩，營養(yǎng)價值高，是華南地區(qū)人們最喜愛的蔬菜之一，其中糖的種類和含量是決定菜心甜度和風(fēng)味的主要因素。分析菜心不同器官糖含量及與糖代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)，以探明導(dǎo)致菜心不同器官糖含量差異的分子機(jī)制?！痉椒ā坎捎酶咝б合嗌V法測定菜心葉片、薹莖和花蕾中可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量；通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對菜心葉片、薹莖和花蕾基因的表達(dá)量進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，并利用DESeq2軟件鑒定3個不同器官間的差異表達(dá)基因，分析糖代謝通路及轉(zhuǎn)運過程涉及的酶編碼基因的表達(dá)，在基迪奧生信云平臺將篩選到的與糖代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)的差異表達(dá)基因和糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，同時利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對部分基因的表達(dá)量進(jìn)行驗證。【結(jié)果】糖含量測定結(jié)果表明，菜心不同器官之間糖含量差異明顯?？扇苄蕴?、蔗糖、葡萄糖和果糖含量均呈現(xiàn)花蕾＞薹莖＞葉片的趨勢?；ɡ僦衅咸烟呛糠謩e為薹莖和葉片的1.3倍和1.6倍，果糖含量分別為薹莖和葉片的1.42倍和1.78倍。通過分析糖代謝關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因與糖含量變化趨勢的一致性，共找出18個與糖含量變化趨勢一致的基因。通過分析糖代謝轉(zhuǎn)運中相關(guān)差異基因的表達(dá)與糖種類及含量的相關(guān)性和一致性，鑒定了14個與糖含量變化趨勢一致的DEG。合并7個共有基因（、、、、、和），共計25個基因與糖含量變化趨勢一致。qRT-PCR結(jié)果分析表明篩選到的8個差異基因的表達(dá)量FPKM值與相對表達(dá)水平高度一致，說明測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠?！窘Y(jié)論】菜心花蕾中的糖含量高于薹莖和葉片，是由合成相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)在薹莖和花蕾中高于葉片所致，研究結(jié)果為揭示菜心不同器官中糖代謝及轉(zhuǎn)運的分子機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。

菜心；器官；糖類；轉(zhuǎn)錄組；基因

0 引言

【研究意義】菜心（L. ssp.var.Tsen et Lee）又名菜薹，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個變種。菜心以花薹為主要食用器官，生長周期短，可周年供應(yīng)，是華南地區(qū)人們餐桌上的必備佳肴。因其品質(zhì)柔嫩，具有十字花科植物特有的風(fēng)味和口感，有著“蔬品之冠”和“菜中之后”的美譽。它富含糖類、維生素C以及人體所需蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，因此深受消費者喜愛[1-2]。糖的含量影響蔬菜的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)[3]，分析植物體內(nèi)糖的含量是研究糖代謝的基礎(chǔ)[4]。因此，研究菜心器官中主要糖含量和糖代謝機(jī)制具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物各器官糖積累和轉(zhuǎn)運過程中需要糖代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)酶的共同參與，但是糖代謝和轉(zhuǎn)化酶的編碼基因在同一植物不同器官中的表達(dá)不一致。張曉艷等[5]研究了不同熟性菜心品種的糖代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)晚熟品種中可溶性糖、果糖和還原糖含量在花芽分化中期至現(xiàn)蕾期和采收期快速升高。張夢[6]發(fā)現(xiàn)在百合現(xiàn)蕾期光合作用增強(qiáng)，葉片中積累的果糖和葡萄糖等向花蕾中積累，最后在花瓣盛開過程中糖含量（葡萄糖、果糖和蔗糖）大量積累。馬春梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)不同大豆品種葉片在生長過程中可溶性糖含量呈現(xiàn)單峰曲線變化，峰值出現(xiàn)在開花期。甜瓜中在葉片、莖和果實中表達(dá)，在花和根中不表達(dá)，而甜瓜在未成熟時蔗糖含量較低，隨著果實發(fā)育，的表達(dá)量迅速提高，表明蔗糖積累可能與表達(dá)量關(guān)系密切[8]。在棉花過表達(dá)株系的幼葉中，果糖含量也明顯上升，能促進(jìn)纖維的伸長，在伸長纖維的植株中，高活性的能促進(jìn)果糖和葡萄糖含量的提高[9]，葉片中葡萄糖和果糖等己糖的滲透力小，高活性的可能通過糖信號來促進(jìn)葉片的發(fā)育。辣椒在花發(fā)育中表達(dá)量高，在葉片中表達(dá)較高，這些基因與糖代謝和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，促進(jìn)了辣椒葉片和花的發(fā)育[10]?！颈狙芯壳腥朦c】以果實為產(chǎn)品器官的植物中糖含量及代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)酶的研究較為深入，但關(guān)于菜心糖含量及代謝轉(zhuǎn)運酶的研究較少，糖代謝轉(zhuǎn)運分子機(jī)制仍未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗對菜心3個不同器官的糖（蔗糖、果糖和葡萄糖）含量進(jìn)行測定，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對菜心糖代謝轉(zhuǎn)運過程中的相關(guān)酶編碼基因的變化進(jìn)行分析，揭示菜心不同器官糖代謝轉(zhuǎn)運的分子機(jī)理，為利用分子育種改良菜心品種，提高菜心品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及栽培

試驗采用晚熟菜心品種‘油綠802’為研究材料（該品種是筆者課題組前期篩選出的生理指標(biāo)和營養(yǎng)指標(biāo)均表現(xiàn)較好的品種）[11]，種子購買于廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。種子于2019年9月15日條播于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站富含有機(jī)質(zhì)土壤的塑料大棚中，期間間苗，株距12 cm×行距12 cm，并進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 取樣

當(dāng)菜心長至“齊口花”時期（主薹長度與葉片先端高度持平，有初花，達(dá)到采收標(biāo)準(zhǔn)），隨機(jī)挑選10株長勢相同的植株，取新鮮葉片、薹莖和花蕾各4 g樣品在液氮中速凍，-80 ℃保存，2 g用于轉(zhuǎn)錄組測序，剩余2 g用于糖含量測定，3次重復(fù)。

1.3 糖含量測定

1.3.1 葡萄糖和果糖的含量測定 不同器官葡萄糖和果糖的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，由上海優(yōu)選生物科技有限公司完成。

檢測器選用RID，色譜柱為HILIC-NH2：250 mm×4.6 mm，0.5 μm；流動相由超純水和乙腈（Tedia，United States）組成，乙腈﹕水=80﹕20（V﹕V）；流速為1 mL?min-1，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃。

1.3.2 可溶性糖和蔗糖含量的測定 可溶性糖的含量測定采用蒽酮比色法[12]進(jìn)行；

蔗糖含量的測定參照張志良等[13]的鹽酸-間苯二酚法，并稍作修改。取新鮮菜心葉片、薹莖和花蕾各2 g，于-80 ℃液氮中速凍，稱取0.2 g樣品于2 mL蒸餾水中磨樣，倒入10 mL刻度離心管內(nèi)，95 ℃加熱10 min，10 000×離心10 min，吸取上清液100 μL，加入20 μL NaOH，沸水浴10 min，加入280 μL 30% HCl和0.1%的間苯二酚溶液80 μL，沸水浴30 min。冷卻后480 nm測定OD值，每個處理3次重復(fù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取0、20、40、60、80和100 μg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，方法同上。最后繪制蔗糖濃度-OD值曲線。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序委托武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行。提取的RNA通過質(zhì)量評估后，每個樣本約3 μg RNA構(gòu)建cDNA文庫?？俁NA的提取采用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒（QIAGEN，74903），參照說明進(jìn)行。使用帶有Oligo（dT）磁珠富集總RNA中的mRNA，加入fragmentation buffer將RNA打斷成短片段，用六堿基隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成雙鏈cDNA，利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA，然后進(jìn)行末端修復(fù)和測序接頭連接。使用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小的選擇，通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫。最后用Illumina Miseq平臺對測序文庫進(jìn)行測序。

測序后對每個樣品進(jìn)行原始讀取，去除引物和帶接頭reads。過濾掉低質(zhì)量reads，clean reads包含超過80%的堿基對和Q值≥30。clean reads以Brassica Database v1.5（http://brassicadb.org/brad/）為參考基因組，與TopHat軟件進(jìn)行比對，并組裝成contigs。通過雙末端連接和間隙填充，contigs被組裝和聚類以獲得唯一的reads。通過比較已鑒定基因的數(shù)量與總reads來評估每個文庫的reads飽和度。

1.5 基因表達(dá)及差異基因的功能注釋分析

采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。利用DESeq2軟件鑒定不同器官間的差異表達(dá)基因（DEG）。使用FC≥2和FDR＜0.01作為DEG的顯著性閾值，3個不同部位進(jìn)行兩兩比較，將所有差異表達(dá)基因通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類富集分析。

1.6 實時熒光定量PCR

隨機(jī)選取8個基因進(jìn)行菜心不同器官的qRT-PCR驗證。利用在線工具Primer 3設(shè)計8個基因的特異性引物，序列見表1，用大白菜作參照，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增。RNA提取后，采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa, RR037A）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再采用TB Green? Premix Ex TaqTMII（TaKaRa, RR820A）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，20 μL反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR反應(yīng)在ABI 7500 real-time PCR儀上操作，每個反應(yīng)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，相對表達(dá)水平使用2-ΔΔCT方法計算[14]。

2 結(jié)果

2.1 菜心不同器官糖含量比較

葡萄糖和果糖含量均在花蕾中最高，且顯著高于薹莖和葉片；葡萄糖含量分別為薹莖和葉片的1.30倍和1.60倍，果糖含量分別為薹莖和葉片的1.42倍和1.78倍；可溶性糖和蔗糖含量同樣在花蕾中顯著高于薹莖和葉片。因此，這些糖類均在花蕾中含量最高，其次為薹莖，葉片中含量最少（圖1）。

表1 實時熒光定量引物

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05)

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 菜心不同器官測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及評估 從菜心3個不同器官（葉片、薹莖和花蕾）的3個生物重復(fù)樣品中提取總RNA，生成cDNA文庫，采用高通量測序技術(shù)對文庫進(jìn)行配對端部測序，各文庫高通量測序數(shù)據(jù)如表2所示。為保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量及后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，過濾掉低質(zhì)量及帶接頭的reads，共獲得30.3 Gb clean data。將各文庫獲得的高質(zhì)量reads與大白菜參考基因組v1.5版本數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.cn/）進(jìn)行比對，比對率均高于88%，唯一比對到參考基因組的reads數(shù)均在85%—87%，表明比對效率較高，測序結(jié)果和所選參考基因組較可靠，可用于后續(xù)分析。

2.2.2 樣本主成分分析 對菜心3個不同器官共9個樣品進(jìn)行主成分分析，如圖2所示。圖中可看出第一、第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為48.28%和24.70%。圖中相同顏色的每組樣本均聚集在一起，而不同顏色的各個組均處于分散狀態(tài)，3組樣本數(shù)據(jù)被明顯區(qū)分開，表明組內(nèi)差異較小，重復(fù)性較好，而組間差異顯著，葉片、薹莖和花蕾均呈現(xiàn)顯著差異，可進(jìn)行后續(xù)基因的挖掘。

表2 各樣品測序數(shù)據(jù)評估及結(jié)果統(tǒng)計

A1/2/3：葉片1/2/3；B1/2/3：薹莖1/2/3；C1/2/3：花蕾1/2/3 A1/2/3: Leaf 1/2/3; B1/2/3: Stalk 1/2/3; C1/2/3: Bud 1/2/3

2.2.3 RT-qPCR驗證 隨機(jī)選取菜心3個不同器官的8個差異表達(dá)基因（、、、、、、和）進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證，以為內(nèi)參基因?qū)Σ诵?個不同器官的差異表達(dá)基因進(jìn)行定量分析，驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性。從圖3可以看出這些基因的表達(dá)量FPKM值與相對表達(dá)水平高度一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量好，數(shù)據(jù)可靠。

圖3 基因表達(dá)量RT-qPCR驗證分析

2.3 糖代謝關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)分析

糖代謝和轉(zhuǎn)運過程中涉及到的關(guān)鍵調(diào)控酶包括蔗糖代謝相關(guān)酶-蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）以及轉(zhuǎn)運蛋白-蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SWEET10/11/15）、果糖轉(zhuǎn)運蛋白（SWEET16/17）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（SWEET1/2）（圖4）。

紅色字體代表糖代謝過程的相關(guān)酶 The red font represents the enzymes involved in the process of sugar metabolism

根據(jù)擬南芥糖代謝酶及轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，在大白菜網(wǎng)站中找到26個糖代謝和16個糖轉(zhuǎn)運蛋白的同源基因（表3）。這些基因在菜心3個不同器官中的表達(dá)表明，大部分糖代謝酶基因的表達(dá)量在葉片vs薹莖和葉片vs花蕾中上調(diào)，轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)量在葉片vs薹莖和葉片vs花蕾中下調(diào)，與測得的葡萄糖和果糖的含量變化趨勢一致（圖1）。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，編碼SPS的基因、和在花蕾中表達(dá)量最高，其次是薹莖，葉片中的表達(dá)量最低，說明在葉片中合成的蔗糖向莖端和花蕾中輸送，導(dǎo)致薹莖和花蕾中蔗糖含量得到積累。編碼SS1的和在薹莖和花蕾中的表達(dá)量都高于葉片，編碼液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶（VINV）的、、和在葉片vs薹莖和葉片vs花蕾均上調(diào)，但在葉片、薹莖和花蕾中表達(dá)量較低。編碼細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶（CWINV）的、、和在葉片vs薹莖、葉片vs花蕾和薹莖vs花蕾中都表達(dá)上調(diào)，、在葉片和薹莖中均未表達(dá)，在花蕾中表達(dá)量上調(diào)。這些結(jié)果與菜心3個器官中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量變化一致（圖1）。

一些調(diào)控糖代謝的酶編碼基因在3個器官中表達(dá)變化無規(guī)律。、、和編碼SPS，在薹莖和花蕾中的表達(dá)量均高于葉片，且在花蕾中表達(dá)量最高，與蔗糖含量變化趨勢相反。編碼SS的和均在薹莖中表達(dá)量最低，而、和在薹莖中表達(dá)量最高，在花蕾中表達(dá)量最低，與前兩個基因表達(dá)趨勢相反。、和在葉片vs薹莖中表達(dá)下調(diào)，在薹莖中表達(dá)量最低，在花蕾中表達(dá)量顯著升高。

編碼SWEET11的在葉片vs薹莖vs花蕾中表達(dá)下調(diào)，表明蔗糖在葉片中轉(zhuǎn)運速度較快，逐漸向莖和花蕾中運輸，使花蕾和薹莖中蔗糖含量高于葉片。編碼SWEET2的、和表達(dá)量在葉片vs薹莖和葉片vs花蕾中下調(diào)。

此外，綜合分析基因的表達(dá)趨勢，發(fā)現(xiàn)18個編碼糖代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的基因與糖含量變化趨勢一致（、、、、、、、、、、、、、、、、和）（表3、圖1），可進(jìn)一步深入研究。

表3 糖代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)

—：無差異。下同 —: No difference. The same as below

熱圖中的藍(lán)色、白色和紅色分別代表相關(guān)系數(shù)r從低到高

2.4 糖代謝和轉(zhuǎn)運關(guān)鍵基因的挖掘

通過分析菜心3個器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)置FDR≤0.01和Fold change≥2，對3個器官進(jìn)行兩兩比較,找出77個與糖代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)的差異表達(dá)基因。為了篩選出與葡萄糖和果糖代謝轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，以≤0.05作為顯著閾值，將這些基因的FPKM值與糖種類及含量在基迪奧生物信息云工具平臺進(jìn)行相關(guān)性分析，得到32個與葡萄糖和果糖均顯著相關(guān)的基因（圖5、表4），葉片vs薹莖、葉片vs花蕾和薹莖vs花蕾中的差異表達(dá)基因分別有16個、29個和24個，3個組合兩兩比較共有差異基因分別為14個、22個和8個，其中有7個差異基因在3個組合中共有（圖6）。32個相關(guān)基因中有14個基因與糖含量變化趨勢一致。

按照各基因編碼酶參與糖代謝途徑的先后次序，編碼SPS，和編碼SPP，在蔗糖合成過程中起關(guān)鍵作用，這些基因在花蕾和薹莖中的表達(dá)量高于葉片。、、、、和編碼CWINV，是蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖的關(guān)鍵酶。這些基因除在葉片vs花蕾、薹莖vs花蕾上調(diào)不顯著外，其余均顯著上調(diào)。

L vs S：葉vs薹；L vs B：葉vs花；S vs B：薹vs花

表4 與糖代謝密切相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因分析

、和編碼GLK，催化葡萄糖磷酸化，在葉片vs薹莖vs花蕾中表達(dá)下調(diào)；編碼SWEET11，主要參與蔗糖的轉(zhuǎn)運過程。在葉片中的表達(dá)量高于薹莖和花蕾；編碼轉(zhuǎn)運蛋白STP4，在葡萄糖運輸中起作用，在葉片vs薹莖vs花蕾中顯著下調(diào)表達(dá)，葉片到花蕾轉(zhuǎn)運速度逐漸變慢。

綜合18個糖代謝關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因及14個與糖含量密切相關(guān)的DEG，合并7個共有基因，總計25個基因與糖含量變化趨勢一致（圖7）。

綠色、黑色和紅色表示基因表達(dá)由低到高。藍(lán)色背景中的基因與糖含量密切相關(guān)

3 討論

3.1 糖含量與蔬菜的品質(zhì)

優(yōu)良的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)是菜心深受消費者喜愛的關(guān)鍵。近年來，人們尤其關(guān)注菜心的甜度和口感。蔬菜中甜度由其可溶性糖組分的種類和含量決定，而菜心同一品種不同器官的可溶性糖組分和含量有一定的差異。蔗糖在源庫之間的代謝轉(zhuǎn)運影響菜心產(chǎn)品器官的形成，薹莖和花蕾品質(zhì)形成的關(guān)鍵在于糖在源庫間的代謝和轉(zhuǎn)運過程[15]。菜薹生長發(fā)育過程中，晚熟品種薹莖中的可溶性糖、蔗糖和果糖含量均高于葉片[16]。對遲花芥藍(lán)不同器官的營養(yǎng)成分研究發(fā)現(xiàn)薹莖中的可溶性糖、果糖和蔗糖含量最高，其次為葉柄和葉片[17]。以上研究表明，隨著十字花科植物花薹的發(fā)育，其各種糖組分的含量逐漸增多。本研究中菜心3個器官的可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖均表現(xiàn)為在花蕾中的含量依次高于薹莖和葉片，與前人的研究結(jié)果一致。

3.2 糖代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)與糖含量的相關(guān)性

在蔗糖合成代謝過程中，蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）起著至關(guān)重要的作用[18]。SPS是蔗糖合成的關(guān)鍵限速酶，而SS和INV是蔗糖分解代謝的主要酶[19]，SS將蔗糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖和果糖，INV能催化蔗糖降解為葡萄糖和果糖[20]。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)18個糖代謝轉(zhuǎn)運酶編碼基因的表達(dá)變化與糖含量變化一致。、和編碼SPS，SPS參與源組織的長途運輸及庫組織中蔗糖的代謝。甜高粱莖中表達(dá)量明顯高于普通高粱[21]。賈榮榮等[22]發(fā)現(xiàn)棉花在花中表達(dá)量較高，可能主要參與花發(fā)育。山溪等[23]發(fā)現(xiàn)在芽中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量較低。本試驗中，這些基因在花蕾中表達(dá)量顯著高于薹莖和葉片，與以上研究結(jié)果相似。SS和INV在蔗糖代謝中主要起分解作用[24]。柴靜等[25]通過抑制擬南芥中的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的葡萄糖含量顯著低于野生型株系。蘇寧[26]以超表達(dá)植株為材料，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中葡萄糖和果糖含量高于野生型株系。本研究中，編碼SS的和、編碼VINV的、和以及編碼CWINV的、、在薹莖和花蕾中的表達(dá)量高于葉片，導(dǎo)致蔗糖在花蕾中迅速分解轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖，使葡萄糖和果糖含量在花蕾中積累，這就解釋了薹莖和花蕾中的葡萄糖和果糖含量高的原因。

SWEET轉(zhuǎn)運蛋白參與糖轉(zhuǎn)運的過程。SWEET10/ 11/15主要參與蔗糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)運，SWEET16/17在果糖轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用，而SWEET1/2/3參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運過程[27]。黃成等[28]發(fā)現(xiàn)甘蔗在根、莖、葉中均有表達(dá)，且莖、葉中表達(dá)量最高。李明[29]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯在葉中特異性高表達(dá)，在花中特異性高表達(dá)。本試驗中編碼SWEET16，在花蕾中特異性高表達(dá)，與前人結(jié)果一致。和、、分別編碼SWEET11和SWEET2，這些基因在葉片和薹莖中有高表達(dá)，在花蕾中表達(dá)量較低，表明葉片中蔗糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)運速度較快，花蕾中轉(zhuǎn)運速度較慢，使糖類在花蕾中得到積累，這就解釋了蔗糖和葡萄糖在花蕾中含量高于葉片的原因。

3.3 差異表達(dá)基因與糖含量的關(guān)系

通過分析不同器官中差異表達(dá)基因與糖種類和含量的相關(guān)性，篩選到14個與糖代謝轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的DEG。其中和編碼SPP1，可將蔗糖-6-磷酸分解成蔗糖[30]。徐志華[31]克隆了菜用大豆的，轉(zhuǎn)的擬南芥種子蔗糖含量顯著高于野生型植株，表明SPP主要參與蔗糖合成過程。本試驗中編碼SPP1的基因在花蕾中有高表達(dá)，這可能造成花蕾中蔗糖含量的積累。、、和編碼葡萄糖激酶（GLK），該酶主要在葡萄糖代謝過程中發(fā)揮作用。洪泂等[32]在耐熱酵母中過表達(dá)可以恢復(fù)敲除后葡萄糖代謝受到的影響，HXK可以磷酸化葡萄糖[33]，F(xiàn)RK催化果糖磷酸化[34]，證明GLK和HXK發(fā)揮作用一致。本研究中，這些基因的表達(dá)量均在葉片vs薹莖vs花蕾中下調(diào)，己糖在花蕾中分解較少，使葡萄糖和果糖含量在薹莖和花蕾中積累。編碼轉(zhuǎn)運蛋白STP4，定位于細(xì)胞膜上，主要轉(zhuǎn)運葡萄糖和果糖等單糖[35]，這個基因在葉片中有高表達(dá)，在花蕾中表達(dá)量較低，這種趨勢解釋了花蕾中葡萄糖和果糖含量較高的原因，至于基因的轉(zhuǎn)運機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

菜心不同部位中可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量均呈現(xiàn)花蕾＞薹莖＞葉片的變化趨勢，且差異顯著。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析與糖代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)大部分編碼糖代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達(dá)與糖含量變化趨勢一致，其中18個基因完全符合。分析3個器官間的差異表達(dá)基因，鑒定到14個與糖種類相關(guān)且與3個部位糖含量變化趨勢一致的基因，推測這些基因在菜心的糖代謝和轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，研究結(jié)果有助于進(jìn)一步解釋菜心不同器官糖代謝轉(zhuǎn)運的分子機(jī)制。

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Comparison of Sugar Content and Expression Analysis of Genes Related to Sugar Metabolism in Different Parts of Chinese Flowering Cabbage

FENG XianJun1, WANG Li2, WANG Tong1, HOU LeiPing, LI MeiLan

1College of Horticulture，Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Modern Agricultural Industry Development Service Center, Agricultural and Rural Bureau, Zuoquan County, Zuoquan 032600, Shanxi

【Objective】Chinese flowering cabbage has become one of the most popular vegetables in southern China due to its crunchy taste and high nutritional value. The type and content of sugars are the main factors for determining the sweetness and flavour of Chinese flowering cabbage. Therefore, this paper analyzed the sugar content and the expression of genes related to sugar metabolism and transport in different organs, so as to investigate the molecular mechanisms responsible for the differences in sugar content in different organs of Chinese flowering cabbage. 【Method】In this experiment, the content of soluble sugars, sucrose, glucose and fructose in leaves, stalks and flower buds were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The expression of genes in leaves, stalks and buds was analyzed comprehensively and systematically by transcriptome sequencing (RNA-seq), and the differentially expressed genes (DEGs) between three different organs were identified using DESeq2 software. In addition, the expression of genes encoding enzymes involved in the sugar metabolic pathway and transport process was analyzed, and the correlation with sugar content were analyzed on OmicShare. Moreover, the expression of some genes was verified using quantitative real-time fluorescence PCR (qRT-PCR).【Result】The sugar content varied significantly among the different organs of Chinese flowering cabbage. Soluble sugars, sucrose, glucose and fructose all showed a trend of buds＞stalks＞leaves. The glucose content in flower buds was 1.3 and 1.6 times of that in stalks and leaves; the fructose content was 1.42 and 1.78 times of that in stalks and leaves, respectively. By analyzing the relation and consistency between the expression of genes coding enzymes involving in sugar metabolism and transport and content of the sugar, a total of 18 genes were screened. By analyzing the correlation and consistency of the expression of DEGs among different organs with sugar species and content, 14 DEGs were identified. By merging 7 common genes (,,,,,and), expression of 25 genes in total were consistent with the sugar content. qRT-PCR results showed that the relative expression of the eight DEGs were highly consistent with their FPKM values from RNA-seq, indicating that the sequencing results were accurate and reliable.【Conclusion】 The sugar content in the flower buds of Chinese flowering cabbage was higher than that in stalks and leaves, because the expression of genes encoding sugar synthesis-related enzymes was higher in buds than in stalks and leaves. These results laid a certain foundation for revealing the molecular mechanism of sugar metabolism and transport in different organs of Chinese flowering cabbage.

Chinese flowering cabbage; organs; sugar; RNA-seq; gene

2022-07-26；

2022-11-15

山西省重點研發(fā)計劃重點項目（201703D211001-04-01）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)曲沃果蔬研究院項目（2021QWGS-3）

馮獻(xiàn)君，E-mail：643046085@qq.com。通信作者侯雷平，E-mail：sxndhlp@126.com。通信作者李梅蘭，E-mail：15935485975@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.010

（責(zé)任編輯 趙伶俐）