冬小麥籽粒主要品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

董一帆，任毅，程宇坤，王睿，張志輝，時(shí)曉磊，耿洪偉

冬小麥籽粒主要品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

董一帆1，任毅1，程宇坤1，王睿1，張志輝1，時(shí)曉磊2，耿洪偉

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)專用麥類作物工程技術(shù)研究中心/新疆小麥產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091

【目的】小麥籽粒品質(zhì)是影響小麥加工品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要因素。挖掘與小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)及候選基因，為拓寬對(duì)小麥品質(zhì)性狀遺傳機(jī)理的理解和分子標(biāo)記輔助優(yōu)質(zhì)小麥育種提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外259份冬小麥品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、淀粉含量、沉降值和籽粒硬度等5個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合90K SNP芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，將定位到的顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。【結(jié)果】5個(gè)性狀均符合正態(tài)分布且在不同環(huán)境間均表現(xiàn)出豐富的變異，沉降值的變異系數(shù)最大（20.11%—24.42%）。各性狀在基因型、環(huán)境、基因型×環(huán)境間均呈現(xiàn)出極顯著差異（＜0.001），廣義遺傳力為0.77—0.84。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到44個(gè)與5個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001）的位點(diǎn)，分布在除1D和3D染色體外的其他19個(gè)連鎖群。在2個(gè)及以上的環(huán)境中均穩(wěn)定存在的位點(diǎn)18個(gè)，涉及蛋白質(zhì)含量（12個(gè)）、濕面筋含量（9個(gè)）、淀粉含量（11個(gè)）、沉降值（12個(gè)）和籽粒硬度（7個(gè)）等5個(gè)性狀，能解釋遺傳變異的4.27%—10.98%。其中13個(gè)為多效應(yīng)位點(diǎn)，與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和淀粉含量等性狀相關(guān)聯(lián)的多效應(yīng)位點(diǎn)最多（7個(gè)）。位于2B、2D和3A染色體的、和位點(diǎn)同時(shí)在2個(gè)環(huán)境和BLUP值下被檢測(cè)到，表型貢獻(xiàn)率的范圍為4.32%—7.07%。通過(guò)對(duì)多環(huán)境下存在且表型貢獻(xiàn)率高的多效應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，在5D染色體的位點(diǎn)發(fā)掘到與蛋白質(zhì)含量、沉降值和淀粉含量等性狀顯著相關(guān)的Hap1、Hap2、Hap3和Hap4等4個(gè)不同單倍型，其中，Hap1是高淀粉含量單倍型（＜0.001），而Hap2和Hap3均為高蛋白質(zhì)含量和沉降值的單倍型（＜0.05），4個(gè)單倍型分別占74.22%、16.21%、6.92%和2.65%。對(duì)不同來(lái)源冬小麥的單倍型分布頻率進(jìn)行分析，其中，高蛋白質(zhì)含量和沉降值單倍型Hap2的分布頻率由高到低為黃淮冬麥區(qū)＞北部冬麥區(qū)＞國(guó)外品種＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)＞西南冬麥區(qū)。對(duì)穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)進(jìn)行候選基因的挖掘，篩選到10個(gè)可能與小麥籽粒品質(zhì)相關(guān)的候選基因。【結(jié)論】檢測(cè)到18個(gè)與籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)，鑒定到4個(gè)不同單倍型，篩選出10個(gè)與籽粒品質(zhì)相關(guān)的候選基因。

冬小麥；品質(zhì)；SNP標(biāo)記；GWAS；單倍型；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥因其特殊的面筋蛋白，可用于面包、饅頭、面條和餃子等多種面食的制作，在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占據(jù)舉足輕重的地位[1-2]。隨著人們生活水平的提高和消費(fèi)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，人們更趨向于營(yíng)養(yǎng)、豐富和科學(xué)的飲食消費(fèi)。培育優(yōu)質(zhì)專用小麥和提高小麥品質(zhì)已成為現(xiàn)階段小麥育種的重要目標(biāo)[3]。蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量和籽粒硬度是小麥籽粒的主要品質(zhì)性狀，也是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)含量是小麥籽粒的重要營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)也能影響面團(tuán)的形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間，與營(yíng)養(yǎng)和加工品質(zhì)密切相關(guān)[4]。濕面筋含量可以間接反映面粉中的蛋白質(zhì)含量，并主要影響面粉的彈性和黏性等加工品質(zhì)。淀粉含量對(duì)于后期的面粉加工具有重要影響，是重要的加工品質(zhì)之一[5]。沉降值可以反映面筋蛋白的含量及質(zhì)量，是衡量面筋強(qiáng)度的重要參數(shù)[6]。籽粒硬度可以通過(guò)影響小麥出粉率、面粉顆粒大小和破損淀粉含量，從而影響加工品質(zhì)[7-8]，這些品質(zhì)指標(biāo)對(duì)于小麥品質(zhì)育種具有重要的指導(dǎo)作用。因此，研究小麥籽粒品質(zhì)性狀的遺傳機(jī)理對(duì)小麥品質(zhì)的遺傳改良具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】小麥籽粒品質(zhì)性狀是多基因控制的數(shù)量性狀[9]，是基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果[10-12]。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）利用遍布于基因組的高密度分子標(biāo)記，能找到與性狀相關(guān)的標(biāo)記或基因，具有檢測(cè)范圍廣、精度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，全基因組關(guān)聯(lián)分析已成為植物數(shù)量性狀基因挖掘最重要的方法之一。PU等[13]利用55K SNP芯片對(duì)236份小麥品種進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在1B、1D、2A、2B、2D、3B、3D、5D和7D染色體上定位到15個(gè)與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和淀粉含量顯著相關(guān)的標(biāo)記，表型貢獻(xiàn)率為4.2%—10.75%。前人研究表明籽粒硬度是由1對(duì)主效基因和一些微效修飾基因所控制，其中，主效基因是位于5DS染色體的和（和），這兩個(gè)基因構(gòu)成了小麥籽粒硬度的分子基礎(chǔ)，微效基因主要位于1A、2A、2D、3A、5A、5B和6D染色體[14-16]。胡文靜等[17]利用171份小麥品種在4個(gè)環(huán)境條件下對(duì)籽粒硬度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在1A、1B、2A和7A染色體定位到4個(gè)位點(diǎn)可以在所有環(huán)境下均被檢測(cè)到，貢獻(xiàn)率為7.15%—10.86%。LOU等[18]利用19 552個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)486份自然群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定位到35個(gè)與蛋白質(zhì)含量、淀粉含量、濕面筋含量和籽粒硬度等相關(guān)的穩(wěn)定QTL，貢獻(xiàn)率為2.60%—12.68%，其中，位于5D和6A染色體的和含有硬度基因和蛋白質(zhì)含量基因。嚴(yán)勇亮等[10]利用23 632個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)298份春小麥品種（系）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定位到85個(gè)與籽粒品質(zhì)顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率為3.70%—10.90%，并在1B、3A、6A和7A染色體發(fā)現(xiàn)了與品質(zhì)相關(guān)的新位點(diǎn)。【本研究切入點(diǎn)】雖然前人已對(duì)小麥品質(zhì)性狀定位取得了一定的進(jìn)展，但由于小麥品質(zhì)性狀的遺傳機(jī)理較為復(fù)雜，且關(guān)聯(lián)分析受限于研究材料和研究方法的不同，定位到的結(jié)果也不盡相同，因此，需深入挖掘與小麥品質(zhì)性狀相關(guān)的新位點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以來(lái)自國(guó)內(nèi)外的259份冬小麥品種（系）為材料，對(duì)其蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、淀粉含量、沉降值和籽粒硬度等品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合90K SNP芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以期發(fā)現(xiàn)新的控制小麥品質(zhì)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，并發(fā)掘品質(zhì)性狀相關(guān)單倍型，為分子標(biāo)記輔助優(yōu)質(zhì)小麥育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種（系）共計(jì)259份，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)專用麥類作物工程技術(shù)研究中心收集保存，包括203份我國(guó)主要冬麥區(qū)主要推廣的品種（系）和56份國(guó)外冬小麥品種（系）。國(guó)內(nèi)材料來(lái)自黃淮冬麥區(qū)（110份），北部冬麥區(qū)（46份），長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)（28份）和西南冬麥區(qū)（19份）；國(guó)外材料主要來(lái)自法國(guó)、意大利和阿根廷等，供試材料分別于2018—2019年和2019—2020年種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯試驗(yàn)站，田間種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，3行種植，行長(zhǎng)2 m，行距20 cm，田間管理按當(dāng)?shù)剞r(nóng)藝規(guī)程進(jìn)行。

1.2 表型測(cè)定

為保證測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，待小麥材料進(jìn)入蠟熟后期時(shí)，人工對(duì)每一品種（系）的小麥材料進(jìn)行收割，將收獲的小麥材料自然晾干，并儲(chǔ)存2個(gè)月后利用瑞典Perten IM9500型近紅外谷物分析儀測(cè)定小麥每一品種（系）的蛋白質(zhì)含量（grain protein content，GPC）、濕面筋含量（wet gluten content，WGC）、淀粉含量（grain starch content，GSC）、沉降值（sedimentation value，SV）和籽粒硬度（grain hardness，GH），每份品種（系）重復(fù)測(cè)定3次，使用校準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)測(cè)量值，校準(zhǔn)樣品的品質(zhì)數(shù)據(jù)由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所利用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)獲得。

1.3 表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 26.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用QTL IciMapping V4.1軟件進(jìn)行方差分析，計(jì)算廣義遺傳力公式為：2=g2/（g2+e2），其中，g2為遺傳方差，e2為環(huán)境方差。

1.4 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

實(shí)驗(yàn)室前期利用90K SNP芯片對(duì)供試材料進(jìn)行了基因分型，剔除最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＜5%和缺失率＞20%的SNP標(biāo)記，共獲得16 737個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記，應(yīng)用Power Marker軟件計(jì)算多態(tài)性信息量（polymorphic information content，），=1-Σ2（2表示第個(gè)位點(diǎn)的第個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率）。從篩選過(guò)的標(biāo)記中，隨機(jī)選取2 000個(gè)最小等位基因頻率大于10%且在染色體上均勻分布的SNP標(biāo)記，利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方（2）作為衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）參數(shù)，通用Tassel 5.0軟件計(jì)算2，以第95百分位的2值作為閾值估測(cè)LD衰減距離。GWAS結(jié)果中，超過(guò)LD衰減距離的位點(diǎn)則認(rèn)為是2個(gè)不同的位點(diǎn)。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因的篩選

采用Meta-R軟件對(duì)2個(gè)環(huán)境的籽粒品質(zhì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，獲得最佳線性無(wú)偏估計(jì)值（best linear unbiased prediction，BLUP），根據(jù)BLUP值，進(jìn)行曼哈頓圖和Q-Q圖的作圖。用導(dǎo)入90K SNP標(biāo)記基因芯片的Tassel 5軟件應(yīng)用MLM（Q+K）混合線性模型對(duì)2個(gè)環(huán)境及聯(lián)合環(huán)境下的BLUP值表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以=1.0×10-3為閾值，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性。

將穩(wěn)定SNP標(biāo)記的延伸序列在普通小麥中國(guó)春基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://urgi.versailles.inrae.fr/blast_iwgsc/）進(jìn)行BLAST比對(duì)，并在Wheat Omics 1.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://wheatomics.sdau.edu.cn/）中進(jìn)行基因功能注釋。

1.6 單倍型分析

用Haploview軟件對(duì)定位到的顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。

2 結(jié)果

2.1 小麥籽粒品質(zhì)性狀的表型變異

通過(guò)對(duì)259份冬小麥品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量和籽粒硬度等5個(gè)籽粒品質(zhì)性狀的表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差分析（表1），結(jié)果表明，不同環(huán)境間各性狀均表現(xiàn)較大差異，其中，淀粉含量變異系數(shù)最小，沉降值變異系數(shù)最大。淀粉含量的峰度接近于1，其余各性狀的峰度和偏度絕對(duì)值均小于1，服從正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀特征。2019—2020年的供試小麥除淀粉含量平均值外其余各項(xiàng)指標(biāo)與2018—2019年相比均有下降。259份供試材料的5個(gè)品質(zhì)性狀在基因型、環(huán)境、基因型及環(huán)境互作間均呈現(xiàn)出極顯著差異（＜0.001）。所測(cè)性狀的廣義遺傳力（2）范圍為0.77—0.84，其中，淀粉含量遺傳力最低（0.77），籽粒硬度的遺傳力最高（0.84）。5個(gè)性狀的遺傳力均較高，說(shuō)明這些品質(zhì)性狀主要受遺傳變異的影響。

表1 259份自然群體小麥籽粒品質(zhì)性狀統(tǒng)計(jì)分析

GPC：蛋白質(zhì)含量；WGC：濕面筋含量；SV：沉降值；GSC：淀粉含量；GH：籽粒硬度；E1：2018—2019環(huán)境點(diǎn)；E2：2019—2020環(huán)境點(diǎn)，下同。***代表差異顯著水平＜0.001

GPC: grain protein content; WGC: wet gluten content; SVsedimentation value;GSC: grain starch content; GH: grain hardness; E1: 2018-2019 environmental point; E2: 2019-2020 environmental point. the same as below.***Significant at＜0.001

5個(gè)籽粒品質(zhì)性狀的變異特征在不同麥區(qū)中表現(xiàn)不盡相同，變異范圍為0.67%—19.76%，其中，蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值變異系數(shù)最小的是西南冬麥區(qū)，淀粉含量變異系數(shù)最小的是長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)，籽粒硬度變異系數(shù)最小的是黃淮冬麥區(qū)，整體來(lái)看，西南冬麥區(qū)的品質(zhì)性狀表現(xiàn)最為穩(wěn)定。除淀粉含量外，其余4個(gè)品質(zhì)性狀的均值均表現(xiàn)為黃淮冬麥區(qū)＞北部冬麥區(qū)＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)＞西南冬麥區(qū)＞國(guó)外品種，黃淮冬麥區(qū)小麥品種（系）的品質(zhì)表現(xiàn)較為優(yōu)異（表2）。

2.2 SNP多態(tài)性和群體結(jié)構(gòu)分析

90K基因芯片中篩選出16 737個(gè)SNP標(biāo)記，物理圖譜總長(zhǎng)度為14 043.30 Mb，相鄰標(biāo)記間的平均物理距離為0.84 Mb。A、B和D基因組分別包含7 158（42.77%）、7 361（43.98%）和2 218個(gè)（13.25%）標(biāo)記。A和B基因組的染色體組所用標(biāo)記數(shù)目、標(biāo)記密度、遺傳多樣性和多態(tài)信息含量均高于D染色體組。全基因組的變異范圍為0.01—0.51，平均值為0.26（電子附表1）。

利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，在K=3處ΔK值最大，并且曲線變化程度最大（圖1-A)。由圖1-B可以看出供試材料可以分為3個(gè)亞群，該結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致（圖1-C）。亞群1包含117份（45.17%）品種（系），主要來(lái)自河南（21份，17.90%）、陜西（21份，17.90%）和四川（15份，12.80%）；亞群2包含74份（28.57%）品種（系），主要來(lái)自國(guó)外（34份，45.95%）和北京（24份，32.40%）；亞群3包含68份（26.25%）品種（系），主要來(lái)自河南（29份，42.60%）。

表2 基于BLUP值的國(guó)內(nèi)外冬小麥品種（系）籽粒品質(zhì)性狀統(tǒng)計(jì)分析

2.3 標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析

基于LD衰減距離，將在物理圖譜上前后10 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個(gè)候選位點(diǎn)，利用90K基因芯片分型的16 737個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)2個(gè)環(huán)境及BLUP值表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到94個(gè)與5個(gè)籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記（＜0.001），除1D和3D染色體外均有分布。其中51個(gè)標(biāo)記在2個(gè)及以上的分析環(huán)境中出現(xiàn)，是比較穩(wěn)定的SNP標(biāo)記，分布于1A、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5B、5D、6A和7A染色體的18個(gè)位點(diǎn)內(nèi)，表型貢獻(xiàn)率為4.27%—10.98%（圖2和表3）。其中，與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的12個(gè)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分布于1A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5B、5D和7A染色體，表型貢獻(xiàn)率為4.27%—8.55%；與濕面筋含量相關(guān)的9個(gè)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分布于1A、2B、3A、3B、4A、4B、5B和7A染色體，表型貢獻(xiàn)率為4.32%—8.91%；與沉降值相關(guān)的12個(gè)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分布于1A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5B、5D、6A和7A染色體，表型貢獻(xiàn)率為4.25%—8.06%；與淀粉含量相關(guān)的11個(gè)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分布于1A、2B、2D、3A、4A、4B、5B、5D、6A和7A染色體，表型貢獻(xiàn)率為4.27%—7.59%；與籽粒硬度相關(guān)的7個(gè)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分布于2A、2B、3B、5D和7A染色體，表型貢獻(xiàn)率為4.66%— 10.98%。

在這些顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)中，有13個(gè)位點(diǎn)同時(shí)與2個(gè)及2個(gè)以上籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)。位于2B、2D和3A和染色體的、和位點(diǎn)同時(shí)在2個(gè)環(huán)境及BLUP值中被檢測(cè)到，其中，和位點(diǎn)與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)，位點(diǎn)與蛋白質(zhì)含量、沉降值和淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.32%— 7.07%。位于1A、2B（2）、3A、4A、4B和5B染色體的、、、、、和與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.27%—7.59%。位于3B染色體的與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.55%— 8.91%，位于2D、5D和7A和染色體的、、與蛋白質(zhì)含量、沉降值和淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.53%—8.52%。位于6A染色體的與沉降值和淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.44%— 5.44%。位于7A染色體的與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為4.64%—6.40%（表4）。

A：蛋白質(zhì)含量；B：濕面筋含量；C：沉降值；D：淀粉含量；E：籽粒硬度

A: Grain protein content; B: Wet gluten content; C: Sedimentation value; D: Grain starch content; E: Grain hardness

圖2 基于BLUP值的小麥籽粒品質(zhì)性狀的曼哈頓圖和Q-Q圖

Fig. 2 Manhattan and Q-Q plots of wheat grain quality traits based on BLUP values

表3 與小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)

續(xù)表3 Continued table 3

E3：聯(lián)合環(huán)境下的BLUP值，加粗表示新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。下同 E3: BLUP value in joint environment, bolded are newly discovered loci. the same as below

2.4 單倍型分析

通過(guò)對(duì)定位獲得的表型貢獻(xiàn)率高的多效應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，SNP位點(diǎn)所在的區(qū)域LD值較高，能形成LD Block，位于5D染色體559.92—562.12 Mb區(qū)段的與左翼5個(gè)SNP標(biāo)記形成一個(gè)跨度為477 kb的LD Block（圖3-A），該Block存在4個(gè)單倍型（Hap1、Hap2、Hap3和Hap4），供試材料中包含Hap1、Hap2、Hap3和Hap4的材料分別有174、30、15和4份（圖3-B）。對(duì)含有單倍型的品種（系）進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)含量、沉降值和淀粉含量的均值表現(xiàn)分別為Hap1（15.87%、43.34 mL和61.74%）、Hap2（16.37%、48.43 mL和61.22%）、Hap3（16.47%、49.25 mL和61.18%）和Hap4（15.61%、41.60 mL和61.78%）。具有單倍型Hap2和Hap3的品種（系）的蛋白質(zhì)含量和沉降值顯著（＜0.05）高于具有單倍型Hap1的品種（系）；具有單倍型Hap1的品種（系）的淀粉含量極顯著（＜0.001）高于具有單倍型Hap2和Hap3的品種（系）；在蛋白質(zhì)含量、沉降值和淀粉等性狀上，具有單倍型Hap3的品種（系）均比具有單倍型Hap2的品種（系）高，但差異不顯著。具有單倍型Hap4的品種（系）在各性狀間跟具有單倍型Hap1、Hap2和Hap3的品種（系）無(wú)顯著性差異（圖3-C），可能由于材料數(shù)量較少的原因，對(duì)此不進(jìn)行分布頻率的鑒定。

具有單倍型Hap1、Hap2和Hap3的品種（系）的分布頻率表現(xiàn)為Hap1（74.22%）＞Hap2（16.21%）＞Hap3（6.92%）（圖3-B）；西南冬麥區(qū)品種（系）全部為單倍型Hap1，沒(méi)有其他3種單倍型，單倍型Hap2和Hap3分布頻率最高的麥區(qū)分別是黃淮冬麥區(qū)（18.75%）和國(guó)外品種（18.75%）。單倍型Hap1的分布頻率在不同麥區(qū)的表現(xiàn)為西南冬麥區(qū)（100.00%）＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)（91.67%）＞黃淮冬麥區(qū)（79.17%）＞北部冬麥區(qū)（76.47%）＞國(guó)外品種（68.75%）；單倍型Hap2的分布頻率表現(xiàn)為黃淮冬麥區(qū)（18.75%）＞北部冬麥區(qū)（14.71%）＞國(guó)外品種（12.50%）＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)（4.17%）；單倍型Hap3的分布頻率表現(xiàn)為國(guó)外品種（18.75%）＞北部冬麥區(qū)（8.82%）＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)（4.17%）＞黃淮冬麥區(qū)（2.08%）（圖4）。

A：位點(diǎn)的LD Block分析；B：不同等位基因的4種單倍型；C：不同單倍型品種（系）的品質(zhì)表型差異

A: LD Block analysis of the6 locus; B: four haplotypes with different alleles; C: quality phenotypic differences of different haplotype varieties (lines)

圖3的單倍型分析

Fig. 3 Haplotype analysis of thelocus

2.5 小麥籽粒品質(zhì)候選基因預(yù)測(cè)

將定位到表型貢獻(xiàn)率高且穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)在普通小麥中國(guó)春基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并在Wheat Omics 1.0數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因功能注釋，篩選到10個(gè)與小麥籽粒品質(zhì)相關(guān)的候選基因（表5）。這些候選基因主要與糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)的合成和分解、植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境應(yīng)答有關(guān)。其中，和均編碼細(xì)胞色素P450家族蛋白；編碼鋅指蛋白；編碼激酶家族蛋白；編碼糖基轉(zhuǎn)移酶；編碼LRR受體樣激酶家族蛋白；編碼磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；編碼F-box家族蛋白；編碼天冬氨酸蛋白酶。

表4 與2個(gè)及2個(gè)以上籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)

圖4 不同來(lái)源冬小麥D_GDS7LZN02F4FP5_176位點(diǎn)單倍型的分布頻率

表5 篩選獲得的候選基因信息

3 討論

3.1 優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選和不同麥區(qū)間小麥資源品質(zhì)的分析

我國(guó)是小麥生產(chǎn)大國(guó)，但每年仍需大量進(jìn)口優(yōu)質(zhì)小麥[19]，發(fā)展優(yōu)質(zhì)小麥和改良小麥品質(zhì)勢(shì)在必行[3]。發(fā)掘優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源對(duì)小麥品質(zhì)的遺傳改良具有重要作用。本研究通過(guò)對(duì)來(lái)自我國(guó)主要冬麥區(qū)和部分國(guó)外的冬小麥品種（系）進(jìn)行品質(zhì)綜合鑒定，篩選出一些品種綜合性狀突出和單一品質(zhì)指標(biāo)優(yōu)異的種質(zhì)資源，其中，最為優(yōu)質(zhì)的強(qiáng)筋品種有小偃54、中優(yōu)9507、京冬22、Mantol（意大利）和周麥32，最為優(yōu)質(zhì)的弱筋品種有皖麥29、百農(nóng)3217、Fr03724（法國(guó)）、陜354和Fr03717（法國(guó)），可作構(gòu)建品質(zhì)遺傳改良基礎(chǔ)研究的遺傳群體，也可作為品質(zhì)改良繁育的優(yōu)良骨干親本。

小麥籽粒品質(zhì)是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，其遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，不僅受到遺傳的調(diào)控，還受生態(tài)條件、栽培技術(shù)和儲(chǔ)存條件的影響[11, 20-21]。對(duì)我國(guó)主要冬麥區(qū)的小麥品種（系）的品質(zhì)性狀進(jìn)行綜合分析，有利于了解不同麥區(qū)間種質(zhì)資源的品質(zhì)狀況。本研究結(jié)果表明，不同麥區(qū)的籽粒品質(zhì)表現(xiàn)出較大差異，除淀粉含量外，蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和籽粒硬度等性狀的均值由高到低為黃淮冬麥區(qū)＞北部冬麥區(qū)＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)＞西南冬麥區(qū)。前人研究表明，蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值會(huì)隨緯度的增加而趨高[22-23]，這與本研究對(duì)上述性狀區(qū)域間比較后得到北部冬麥區(qū)＞長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)＞西南冬麥區(qū)的結(jié)果相一致。不同麥區(qū)間黃淮冬麥區(qū)的品質(zhì)表現(xiàn)最為優(yōu)異，這可能與黃淮冬麥區(qū)作為我國(guó)最大優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥產(chǎn)區(qū)[24]、育種工作者對(duì)其小麥品質(zhì)改良的研究起步較早有關(guān)[25]，也可能與當(dāng)?shù)責(zé)嶂悦媸?、?duì)面制品筋道要求較高、育種工作者在品種選育上更注重筋強(qiáng)的選擇有關(guān)。

3.2 小麥籽粒品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

GWAS是定位和挖掘數(shù)量性狀位點(diǎn)的有效途徑之一，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于小麥育種研究[13, 17-18]。小麥品質(zhì)相關(guān)性狀的基因挖掘也取得了較大進(jìn)展，考慮到籽粒品質(zhì)性狀的復(fù)雜性、前人定位到的位點(diǎn)不盡相同等因素[10, 18]。本研究采用MLM（Q+K）模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到18個(gè)與籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)，與前人研究結(jié)果相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)10個(gè)相似位點(diǎn)。本研究在2B（12.08—17.39 Mb，733.71—742.81 Mb）、2D（645.61 Mb）、3B（5.67—5.95 Mb）、4B（37.69 Mb）和5D（559.92—562.12 Mb）染色體定位到6個(gè)位點(diǎn)與CHEN等[26]（2B，8.08 Mb）、HAO等[27]（2B，723.96—731.60 Mb；5D，547.50—550.44 Mb）、RATHAN等[28]（2D，640.21 Mb）和嚴(yán)勇亮等[10]（3B，7.08 Mb；4B，43.56 Mb）定位到的與品質(zhì)相關(guān)的位點(diǎn)物理位置相距均在10 Mb以內(nèi)，根據(jù)LD衰減距離（10 Mb），判斷可能為相同位點(diǎn)。同時(shí)在5D染色體定位到的與籽粒硬度相關(guān)的標(biāo)記附近存在控制籽粒硬度的主效基因[16, 29]，其他學(xué)者在這一位置上也有類似的發(fā)現(xiàn)[18, 26, 30]。6A染色體73.72—75.02 Mb區(qū)域定位到的與沉降值和淀粉含量相關(guān)的位點(diǎn)與LOU等[18]定位的與淀粉、濕面筋和蛋白質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)（73.58—75.91 Mb）物理位置相吻合，可以判斷在6A染色體的73.72—75.02 Mb處可能存在控制不同籽粒品質(zhì)的基因。7A染色體的14.20—19.97 Mb區(qū)域定位到與蛋白質(zhì)、濕面筋含量和籽粒硬度相關(guān)的位點(diǎn)，與RATHAN等[28]定位的與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)和LOU等[18]定位的與吸水率和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間相關(guān)的位點(diǎn)物理位置相近；30.09—35.60 Mb區(qū)域定位到與蛋白質(zhì)、沉降值、淀粉含量相關(guān)的位點(diǎn)和嚴(yán)勇亮等[10]定位到與沉降值，淀粉含量，蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量相關(guān)的位點(diǎn)物理位置吻合。說(shuō)明7A染色體這兩個(gè)區(qū)域內(nèi)存在與多個(gè)品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，該區(qū)域內(nèi)可能存在控制多個(gè)品質(zhì)性狀的基因，可作為今后研究的重點(diǎn)區(qū)域。由于籽粒品質(zhì)性狀間具有高度的相關(guān)性，本研究定位到的穩(wěn)定位點(diǎn)中有超過(guò)70%（13/18）的位點(diǎn)同時(shí)與多個(gè)籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)，與品質(zhì)性狀相關(guān)的多效應(yīng)位點(diǎn)被大量定位，這一結(jié)果與前人研究報(bào)道相一致[10, 18, 30-32]。定位到的位點(diǎn)大多為多效應(yīng)位點(diǎn)，說(shuō)明了籽粒品質(zhì)性狀的復(fù)雜性，選擇多效應(yīng)位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行研究，可以同時(shí)改善多個(gè)品質(zhì)性狀。以上多效應(yīng)位點(diǎn)區(qū)域的發(fā)現(xiàn)可以作為今后小麥籽粒品質(zhì)研究的重點(diǎn)區(qū)域。

本研究在1A、2A（2）、2B、3A、4A、5B和7A染色體定位到的8個(gè)位點(diǎn)與已報(bào)道的相同染色體的與品質(zhì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)物理位置距離較遠(yuǎn)[30, 33]，可能是品質(zhì)相關(guān)性狀的新位點(diǎn)。其中2B（）和3A（）位點(diǎn)在2個(gè)環(huán)境和BLUP值下被共同檢測(cè)到，且與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和淀粉含量等性狀相關(guān)聯(lián)。接下來(lái)項(xiàng)目組將對(duì)2B和3A染色體的多效應(yīng)且穩(wěn)定的位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的研究，這些位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步解析小麥品質(zhì)的遺傳機(jī)理提供了依據(jù)。

3.3 不同來(lái)源冬小麥的優(yōu)異單倍型分布規(guī)律

單倍型是指位于單條染色體上的一組SNP位點(diǎn)，已成為分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用的重要手段之一[34-35]。JIN等[36]對(duì)發(fā)掘了2個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的單倍型，其中TaAAP6-3B-Ⅰ擁有著更高的蛋白含量。本研究發(fā)掘了能夠提高蛋白質(zhì)含量和沉降值的單倍型Hap2和Hap3，而單倍型Hap2（16.21%）和Hap3（6.92%）在供試材料中的占比較低，可能與我國(guó)早期小麥育種目標(biāo)主要以高產(chǎn)為主，品質(zhì)性狀較產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀不易被直接觀測(cè)到，導(dǎo)致育種家早期對(duì)品質(zhì)的關(guān)注度較少、研究起步較晚[37-38]。后期可利用含有蛋白質(zhì)含量和沉降值高的單倍型Hap2和Hap3的品種（系）進(jìn)行品種的選育和改良。另外，本研究發(fā)掘到的具有單倍型Hap4的品種（系）在各性狀間跟具單倍型Hap1、Hap2和Hap3的品種（系）無(wú)顯著性差異，可能與供試品種（系）未能在各麥區(qū)間均勻取樣、樣本數(shù)量有限有關(guān)，因此，后續(xù)研究中可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以便獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

對(duì)不同來(lái)源的小麥優(yōu)異單倍型的分布進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，西南冬麥區(qū)的冬小麥品種（系）均為含有淀粉含量高的單倍型Hap1，這表明西南冬小麥品種（系）具有較高的淀粉含量。黃淮冬小麥品種（系）含有單倍型Hap2的分布頻率高于其他地區(qū)，這表明黃淮冬小麥品種（系）具有較高的蛋白質(zhì)含量和沉降值，這可能與黃淮冬麥區(qū)作為我國(guó)主要冬小麥產(chǎn)區(qū)和最大強(qiáng)筋小麥生產(chǎn)基地有關(guān)[24]。單倍型Hap3的分布頻率表現(xiàn)為國(guó)外冬小麥品種（系）遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)冬麥區(qū)的冬小麥品種（系），這可能與國(guó)外小麥育種家對(duì)小麥品質(zhì)重視度較高、品質(zhì)性狀研究起步較早有關(guān)。含單倍型Hap3的國(guó)外材料可作為高蛋白質(zhì)含量和高沉降值的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

3.4 候選基因預(yù)測(cè)

本研究獲得10個(gè)可能與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。位于2A染色體的基因編碼鋅指蛋白，該蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)控作用，參與種子的萌發(fā)及成熟、根系的發(fā)育和花器官的發(fā)育等過(guò)程[39]。推測(cè)該基因可能通過(guò)參與植物的發(fā)育調(diào)控進(jìn)而影響植物的物質(zhì)積累。位于3A、7A、2B和2D染色體的基因、、和分別編碼細(xì)胞色素P450、LRR類受體蛋白激酶、F-box家族蛋白和激酶家族蛋白，這些基因在調(diào)控小麥生長(zhǎng)發(fā)育、逆境應(yīng)答方面起到重要作用[40-43]，可能通過(guò)對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫的調(diào)節(jié)影響到小麥的品質(zhì)。此外，還在4A染色體發(fā)現(xiàn)了編碼磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因在光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)中執(zhí)行單糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[44]。推測(cè)該基因在有機(jī)物質(zhì)的積累中起到重要作用，從而影響小麥籽粒品質(zhì)的形成。位于7A染色體的編碼天冬氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，廣泛存在于各類生物中，參與了蛋白質(zhì)的加工和降解，被認(rèn)為影響了小麥籽粒品質(zhì)的形成[31]。位于2B染色體的編碼產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，糖基轉(zhuǎn)移酶可以將光合作用的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為雙糖、寡糖和多糖[45]，該基因可能與淀粉的積累有關(guān)，從而影響淀粉含量水平。位于5D染色體的編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因?qū)任镔A藏物質(zhì)的積累和分布具有重要的調(diào)控作用，對(duì)小麥品質(zhì)的形成也至關(guān)重要[46]。

4 結(jié)論

使用90K SNP基因芯片結(jié)合259份國(guó)內(nèi)外冬小麥品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量和籽粒硬度進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得18個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定SNP標(biāo)記位點(diǎn)，其中，有10個(gè)位點(diǎn)與前人結(jié)果一致，有8個(gè)位點(diǎn)是新的遺傳位點(diǎn)，有13個(gè)位點(diǎn)為多效應(yīng)位點(diǎn)。單倍型分析鑒定到Hap1、Hap2、Hap3和Hap4等4個(gè)不同單倍型，其中Hap1為能提高淀粉含量的單倍型，Hap2和Hap3為能提高蛋白質(zhì)含量和沉降值的單倍型。獲得10個(gè)可能與小麥籽粒品質(zhì)相關(guān)的候選基因，主要與糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)的合成和分解、植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境應(yīng)答相關(guān)。

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Genome-wide association study of grain main quality related traits in winter wheat

DONG YiFan1, REN Yi1, CHENG YuKun1, WANG Rui1, ZHANG ZhiHui1, SHI XiaoLei2, GENG HongWei

1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University/Special High Quality Triticeae Crops Engineering and Technology Research Center, Xinjiang Agricultural University/Xinjiang Wheat Industry System Innovation Team, Urumqi 830052;2Institute of Crop Germplasm Resources, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091

【Objective】The quality of wheat grain was an important factor affecting the processing quality and nutritional. Mining loci and candidate genes significantly associated with wheat grain quality traits provided a basis for broadening the understanding of the genetic mechanism of quality traits and molecular marker-assisted quality. 【Method】By measuring five quality traits, including protein content (GPC), wet gluten content (WGC), starch content (GSC), settling value (SV) and grain hardness (GH), in 259 winter wheat varieties (lines) from domestic and abroad, and conducting genome-wide association analysis in combination with 90K SNP chip, the significant association loci located were subjected to haplotype analysis. 【Result】All five traits conformed to normal distribution and showed rich variation among different environments, and the coefficient of variation of sedimentation value was the largest (20.11%-24.42%). All traits have shown highly significant differences (＜0.001) among genotype, environment, and genotype×environment, with a broad-sense heritability of 0.77-0.84. A total of 44 loci significantly associated (＜0.001) with five traits were detected by genome-wide association analysis, distributed in 19 linkage groups other than chromosomes 1D and 3D. Eighteen loci were stable in two or more environments, involving all five traits including protein content (12), wet gluten content (9), starch content (11), sedimentation value (12) and grain hardness (7), explaining 4.27%-10.98% of the genetic variation. Thirteen of them were multi-effect loci, with the largest number of multi-effect loci (7) associated with traits such as protein content, wet gluten content, settling value and starch content. The,andloci located on 2B, 2D and 3A chromosomes were detected simultaneously at two environmental and BLUP values with a range of 4.32%-7.07% phenotypic contribution. Through haplotype analysis of multi-effect loci present in multiple environments with high phenotypic contribution, four different haplotypes, Hap1, Hap2, Hap3 and Hap4, which were significantly associated with traits such as protein content, sedimentation value and starch content, were uncovered at thelocus of chromosome 5D, among them Hap1 was a high starch content haplotype (＜0.001), while Hap2 and Hap3 were both haplotypes with high protein content and sedimentation value (＜0.05), and the four haplotypes accounted for 74.22%, 16.21%, 6.92% and 2.65%, respectively. The distribution frequencies of haplotypes from different sources of winter wheat were analyzed, in which the distribution frequencies of haplotype Hap2 with high protein content and sedimentation value were from high to low in the Huanghuai winter wheat regions＞northern winter wheat region＞abroad varieties＞middle and lower reaches of the Yangtze River winter wheat region＞southwest winter wheat region. Candidate genes were mined for stable genetic loci, and 10 candidate genes that might be related to wheat grain quality were screened. 【Conclusion】In the study, 18 stable loci significantly associated with grain quality traits were detected, 4 different haplotypes were identified, and 10 candidate genes related to grain quality were screened.

winter wheat; quality; SNP marker; GWAS; haplotype; candidate genes

2022-12-25；

2023-02-17

新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（2021A02001-1）、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科發(fā)展基金（XNCDKY2021018）

董一帆，E-mail：f1468989265@qq.com。通信作者耿洪偉，E-mail：hw-geng@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.002

（責(zé)任編輯 李莉）