HPLC法測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量

盧向紅 劉利輝 汪霞 佘林立

【摘 要】 目的：建立以高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿作為指標(biāo)成分，采用Zafex Acutfex PA-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫：25 ℃，流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉）-乙腈（63∶37），流速：1.0 mL·min-1，PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：322nm。 結(jié)果：鹽酸巴馬汀在0.6530～9.7955 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ｒ=0.9999，方法的平均回收率為97.13%，RSD為0.89%（n=6）。蛇床子素在0.3260～4.8903 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ｒ=0.9998，方法的平均回收率為95.86%，RSD為0.69%（n=6）。鹽酸小檗堿在16.3554～245.3304 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ｒ=0.9999，方法的平均回收率為98.81%，RSD為0.80%（n=6）。結(jié)論：建立的苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和分離度好，可用于同時(shí)測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，為更好地控制苦柏洗劑質(zhì)量穩(wěn)定和可靠提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 苦柏洗劑；鹽酸巴馬汀；蛇床子素；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R917?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）01-0028-04

Determination of Palmatine Hydrochloride， Osthol and Berberine Hydrochloride in Kubo Lotion By HPLC

LU Xianghong1 LIU Lihui1 WANG Xia1 SHE Linli2*

1.Loudi? Institute? for Food and? Drug? Inspection ＆ Testing， Loudi? 417000，China;

2.Yueyang Xinhuada Pharmaceutical Co Ltd，Yueyang 414000，China

Abstract：Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of Palmatine hydrochloride、Osthol and Berberine hydrochloride in Kubo Lotion.Method With Palmatine hydrochloride、Osthol and Berberine hydrochloride as the index components， HPLC was used. Zafex Acutfex PA-C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm），column temperature of 25 ℃，a mobile phase composed of 0.1% phosphoric acid solution （containing 15% acetonitrile and 0.2% sodium dodecyl sulfate） - acetonitrile（63∶37） were adopted. Flow rate： 1.00 mL·min-1. PDA detector， detection wavelength： 322nm. Result The linear range of Palmatine hydrochloride was 0.6530～9.7955 μg·mL-1 （r=0.9999）. The average recovery of the method was 97.13% with RSD of 0.89%（n=6）.The linear range of Osthol was 0.3260～4.8903 μg·mL-1（r=0.9998）. The average recovery was 95.86% with RSD of 0.69% （n=6）.The linear range of Berberine hydrochloride was 16.3554～245.3304 μg·mL-1（r=0.9999）. The average recovery of the method was 98.81% with RSD of 0.80%（n=6）.Conclusion The established method for the determination of Palmatine hydrochloride、Osthol and Berberine hydrochloride in Kubo lotion was accurate， repeatable and had good separation degree. It could be used for the simultaneous determination of Palmatine hydrochloride、Osthol and Berberine hydrochloride in Kubo lotion， and provided a scientific basis for better quality control of Kubo lotion.

Keywords：Kubo lotion; Palmatine Hydrochloride；Osthol；Berberine Hydrochloride；HPLC

苦柏洗劑是由岳陽(yáng)市第二人民醫(yī)院制劑室委托岳陽(yáng)新華達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)的中藥制劑，其處方組成為苦參、鴉膽子、黃柏、丁香、蛇床子、海馬、白鮮皮、薄荷素油和艾葉。具有清熱解毒，燥濕殺蟲，祛風(fēng)止癢的功效，臨床主要用于真菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、老年性陰道炎、宮頸糜爛、濕疹及陰部瘙癢等癥屬濕熱者［1］。處方中君藥黃柏的主要活性成分為生物堿，其中鹽酸小檗堿是含量最高的生物堿，可達(dá)1.4%～5.8%［2］， 體外研究［3-5］

表明，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿均具有較強(qiáng)的抗炎作用和抗菌能力以及廣泛的抗菌譜。臣藥蛇床子主要成分是香豆素類化合物，如蛇床子素等，蛇床子素具有抑制炎癥發(fā)生、抗過敏等作用［6-7］。這三個(gè)成分是該藥發(fā)揮臨床療效的主要化學(xué)成分，原標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)這三個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，使得制劑質(zhì)量難以得到有效控制。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，制定了與臨床療效相關(guān)成分的含量控制方法，對(duì)增強(qiáng)藥品質(zhì)量可控性，保證臨床用藥安全性，具有十分重要的意義，為進(jìn)一步提高和完善藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?儀器與材料

1.1 儀器 Thermo Fisher HPLC色譜儀（U3000） Chromeleon色譜工作站；梅特勒托利多 XSE205DU電子天平（十萬分之一）；超聲波清洗儀 KQ-300DE

1.2 試劑 水為I級(jí)純化水，乙腈（HoneyWell，批號(hào)：T8FA1H）為色譜純，磷酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190301）為優(yōu)級(jí)純、十二烷基硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160413）為分析純。

鹽酸巴馬汀對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110732-201913，含量85.7%）；蛇床子素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110822-202111，含量99.7%）；鹽酸小檗堿對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110713-202015，含量85.9%）。

苦柏洗劑由受委托生產(chǎn)企業(yè)岳陽(yáng)新華達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為200701、201201、210301、210701。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zafex Acutfex PA-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：25 ℃，0.1%磷酸溶液（含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉）-乙腈（63∶37），流速：1.0 mL·min-1，PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸巴馬汀對(duì)照品15.24 mg，蛇床子素對(duì)照品16.35 mg，鹽酸小檗堿對(duì)照品23.80 mg，分別加甲醇制成每1 mL含鹽酸巴馬汀32.65 μg·mL-1，蛇床子素16.30 μg·mL-1，鹽酸小檗堿817.77 μg·mL-1的溶液，作為儲(chǔ)備液備用。

2.2.2? 供試品溶液的制備 取本品3瓶?jī)?nèi)容物混勻，離心，精密取上清液10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇8 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按苦柏洗劑的處方和制備工藝，分別制備缺黃柏和蛇床子的陰性樣品，再按2.2.2供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣12 μL，色譜圖如圖1。峰形對(duì)稱尖銳，基線平穩(wěn)，各峰之間的分離度為2.17、3.54，達(dá)到基線分離，陰性樣品在三個(gè)主峰位置無干擾峰，如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成含鹽酸巴馬汀0.6530 μg·mL-1、1.3061 μg·mL-1、1.6326 μg·mL-1、3.2652 μg·mL-1、6.5303 μg·mL-1、9.7955 μg·mL-1，蛇床子素0.3260 μg·mL-1、0.6520 μg·mL-1、0.8150 μg·mL-1、1.6301 μg·mL-1、3.2602 μg·mL-1、4.8903 μg·mL-1，鹽酸小檗堿16.3554 μg·mL-1、32.7107 μg·mL-1、40.8884 μg·mL-1、81.7768 μg·mL-1、163.5536 μg·mL-1、245.3304 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣體積為10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以各對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次12 μL，計(jì)算得到鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.29%、1.01%和0.37%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（210301）樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下供試品液制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量RSD分別為：1.17%、1.23%和1.79%，表明本法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液（批號(hào)：210301）在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h分別進(jìn)樣12 μL，依法測(cè)定，鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.72%、0.71%和0.34%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量（鹽酸巴馬汀：2.462 μg·mL-1，蛇床子素：1.270 μg·mL-1，鹽酸小檗堿：59.434 μg·mL-1）的同一樣品（批號(hào)：210301）6份，各5 mL置20 mL容量瓶中，各加水5 mL，精密加入含鹽酸巴馬?。?.490 μg·mL-1）、蛇床子素（4.108 mg·mL-1）和鹽酸小檗堿（216.450 μg·mL-1）的混合對(duì)照品溶液1.5mL，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按樣品測(cè)定方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.9 樣品測(cè)定 取四批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 通過查閱文獻(xiàn)［8-11］，在實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了0.1%磷酸溶液（含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉）-乙腈，甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺，乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)及多個(gè)比例，經(jīng)過反復(fù)比較，采用0.1%磷酸溶液（含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉）-乙腈（63∶37）進(jìn)行洗脫，鹽酸巴馬汀、蛇床子素、鹽酸小檗堿與相鄰峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱性好，理論塔板數(shù)均在20000以上。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)不同，其紫外最大吸收波長(zhǎng)也不同。采用PDA檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿在346 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，蛇床子素在322 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，為提高檢測(cè)靈敏度，因此選擇322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦柏洗劑中指標(biāo)性成分的提取方法進(jìn)行了探索，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿屬于異喹啉生物堿，蛇床子素屬于香豆素類，均不溶于石油醚。分別考察了萃取和超聲兩種提取方法，結(jié)果顯示用石油醚（30～60 ℃）萃取除雜或者用二氯甲烷提取樣品，雜質(zhì)成分減少，但主成分也會(huì)有所損失，且操作繁瑣。取樣品溶液加甲醇超聲提取，結(jié)果樣品中其他成分峰對(duì)主峰無干擾，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便。同時(shí)比較了不同的超聲時(shí)間（10 min、20 min和30 min），結(jié)果超聲20 min樣品含量最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇用甲醇超聲20 min的方法提取樣品。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法法測(cè)定苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，為進(jìn)一步提高、完善原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制苦柏洗劑的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2022-05-09 編輯：劉 斌）