優(yōu)化止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿含量測(cè)定方法

劉競(jìng) 劉東升 朱旭江 王蘭霞

【摘 要】

目的：補(bǔ)充和完善止咳祛痰糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用HPLC法測(cè)定鹽酸麻黃堿含量：以日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。結(jié)果：鹽酸麻黃堿在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.2%（RSD<3%）。結(jié)論：優(yōu)化的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的要求，該研究方法可為其質(zhì)量控制提供參考。

【關(guān)鍵詞】

止咳祛痰糖漿；HPLC；鹽酸麻黃堿

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）06-0042-04

Optimization of Extraction Method of Ephedrine Hydrochloride and Antitussive Syrup

LIU Jing1 LIU Dongsheng2 ZHU Xujiang2 WANG Lanxia1*

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China;

2.Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070，China

Abstract：

Objective To supplement and improve the quality standard of cough relieving and expectorant syrup. Methods The content of ephedrine hydrochloride was determined by HPLC method： Hitachi HITACHIHPLCcolumn （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used as chromatographic column， methanol-0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution-triethylamine （10∶90∶0.02） as mobile phase， flow rate： 1.0 mL/min， injection volume： 10 μL， detection wavelength was 205 nm. Results Ephedrine hydrochloride had a good linear relationship in the corresponding range， and the average recovery was 100.2% （RSD<3%）. Conclusion The optimization method is simple， accurate and meets the requirements of quality standard. this research method can provide reference for its quality control.

Keywords：

Cough and Expectorant Syrup; HPLC; Ephedrine Hydrochloride

止咳祛痰糖漿是由桔梗、百部及苦杏仁三味藥材經(jīng)煎煮、濃縮為清膏，后加入鹽酸麻黃堿加工而成，其功效是潤(rùn)肺祛痰，止咳定喘［1］。用于傷風(fēng)咳嗽、慢性支氣管炎及支氣管哮喘?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［WS-10036（ZD-0036）-2002-2012Z］，標(biāo)準(zhǔn)中收載性狀、薄層鑒別（鹽酸麻黃堿、桔梗）和鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定，但在檢驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)鹽酸麻黃堿的實(shí)際投料和鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定值存在差異，可能由于供試品溶液制備過(guò)程中提取過(guò)程過(guò)于復(fù)雜以及溶液揮干過(guò)程中鹽酸麻黃堿損失造成。基于以上原因補(bǔ)充了鹽酸麻黃堿含量測(cè)定方法，以期完善止咳祛痰糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters alliance e2695型高效液相色譜儀；e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色譜工作站；日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；METTLER TOLEDO ME204（萬(wàn)分之一）；METTLER TOLEDO MS205DU（十萬(wàn)分之一）和XPE 26（百萬(wàn)分之一）型分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑與試藥 鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201508，含量：99.8%）對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。止咳祛痰糖漿樣品為A公司生產(chǎn)，批號(hào)為：2001056001、2001057001、2001058001、2003056001、2003057001、2003058001、2003060001、2006056001。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱選用日立HITACHI HPLC column（4.6mm×250 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密量取樣品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品22.02 mg，置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻線，搖勻，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻線，搖勻，即得。

2.2.3 陰性溶液制備 按處方比例及制備工藝，配制不含鹽酸麻黃堿的陰性樣品，并按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性考察 取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液、供試品溶液及缺鹽酸麻黃堿的陰性樣品適量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，各精密吸取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)樣，結(jié)果如圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陰性色譜圖中在與鹽酸麻黃堿相應(yīng)的保留時(shí)間沒(méi)有色譜峰，說(shuō)明其他藥材及溶劑對(duì)鹽酸麻黃堿的測(cè)定無(wú)干擾，以本法測(cè)定止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿的含量具有專屬性。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取對(duì)照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定峰面積積分值，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，得到鹽酸麻黃堿的回歸方程為Y=2402.6X-9512.6，相關(guān)系數(shù)r=0.9999；表明鹽酸麻黃堿在158.544～2113.92 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算，RSD為1.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品（批號(hào)：2001056001），按照“2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定，并計(jì)算樣品中待測(cè)成分的含量。結(jié)果含量平均值為0.58 mg/mL，RSD為1.62%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)（批號(hào)：2001056001）供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0 h、4 h、16 h、24 h、30 h、36 h進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液中鹽酸麻黃堿的峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示36 h內(nèi)鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為1.29%，說(shuō)明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定可測(cè)。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取樣品（批號(hào)：2001056001）1 mL、對(duì)照品溶液1 mL（鹽酸麻黃堿0.7206 mg）置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，平行操作6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果鹽酸麻黃堿的平均加樣回收率分別為100.4%，RSD=2.99%（n=6），根據(jù)中國(guó)藥典2020年版“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”規(guī)定樣品中待測(cè)成分含量在0.01%～0.10%時(shí)，回收率限度為90%～108%，表明回收率良好。結(jié)果見表1。

2.3.7 樣品測(cè)定 依法制備供試品溶液并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)8批樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。

2.4 單因素方差分析 為探究止咳祛痰糖漿兩種提取方法的鹽酸麻黃堿含量變化是否有顯著性差異，采用單因素方差分析法［3-4］對(duì)HPLC法檢測(cè)得到的鹽酸麻黃堿數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運(yùn)用 SPSS Statistics 22.0對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)提取方法（A），優(yōu)化后提取方法（B）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

通過(guò)對(duì)止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿含量進(jìn)行單因素方差分析，由上表可知：鹽酸麻黃堿的含量在A提取方法和B提取方法兩組的比較中存在顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04＜0.05），且B提取方法的含量大于A提取方法。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)考察 取“2.2”項(xiàng)下鹽酸麻黃堿對(duì)照品的單標(biāo)溶液，在190到400 nm之間進(jìn)行掃描，測(cè)得光譜圖。從圖譜可以看出鹽酸麻黃堿在205 nm處有最大吸收。參照《中國(guó)藥典》［5］2020年版一部麻黃（檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm）、鎮(zhèn)咳寧糖漿（檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm）、鼻炎通噴霧劑（檢測(cè)波長(zhǎng)為213 nm）和原方法中的檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm分別進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽酸麻黃堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm時(shí)，對(duì)照品和樣品都能得到較好的色譜峰，能夠減少溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.2 峰純度考察 取止咳祛痰糖漿“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以DAD檢測(cè)器進(jìn)行190～400 nm掃描檢測(cè)，計(jì)算峰純度。

峰純度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中鹽酸麻黃堿峰未檢測(cè)到雜質(zhì)峰，純度因子在計(jì)算出的閾值限值內(nèi)，說(shuō)明在該色譜條件下，鹽酸麻黃堿純度符合要求。

3.3 提取溶劑的選擇 提取方法修訂主要參照《中國(guó)藥典》2020版一部［5］麻黃和鎮(zhèn)咳寧糖漿含量測(cè)定項(xiàng)下及相關(guān)文獻(xiàn)［6-13］報(bào)道中的鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定方法，精密吸取一定量的樣品加稀乙醇或者原方法中加流動(dòng)相（0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液）分別進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于原方法中加流動(dòng)相（0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液）稀釋液，選用稀乙醇對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后，供試品溶液色譜圖中雜峰相對(duì)減少且基線更加平穩(wěn)，而不同稀釋溶液稀釋后色譜峰的峰面積相同。所以將供試品溶液的提取過(guò)程最終修訂為“精密量取本品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得”。

3.4不同色譜柱考察 為了考察該含量測(cè)定方法的耐用性，精密吸取同一批號(hào)（批號(hào)：2001056001）的供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除色譜柱分別改為資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG（250×4.6 mm，5 μm）、費(fèi)羅門Phenomenex Gemini（250mm×4.6 mm，5 μm）、泰克美（250 mm×4.6 mm，5 μm）和安捷倫 Agilent HC C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）外，其他條件按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比較不同色譜柱的分離效果及含量值，各色譜柱分離效果良好，含量RSD為1.57%，表明該分析方法在不同色譜柱下分析耐用性較好。

3.5 不同柱溫考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除柱溫分別改為25 ℃、30 ℃、35 ℃外，其他條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比較三種不同柱溫（±5 ℃）的鹽酸麻黃堿的含量值，含量RSD為2.37%，表明該分析方法在柱溫±5℃范圍內(nèi)耐用性良好，能適應(yīng)柱溫微小的變動(dòng)。

3.6 不同流速考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除流速分別改為0.9 mL/min、1.0 mL/min和1.1 mL/min外，其他條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比較三種不同流速（±0.2 mL/min）的鹽酸麻黃堿的含量值，含量RSD為1.58%，表明該分析方法在流速±0.2 mL/min范圍內(nèi)耐用性良好，能適應(yīng)流速微小的變動(dòng)，方法耐用性較好。

3.7 不同流動(dòng)相比例考察 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，除流動(dòng)相比例分別改為甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（12∶88∶0.02）、甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）和甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（8∶92∶0.02）外，其他條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿的含量，RSD為2.14%。說(shuō)明該分析方法能適應(yīng)流動(dòng)相甲醇、0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液比例的微小變動(dòng)，方法耐用性較好。

3.8 差異性分析 通過(guò)對(duì)A方法和B方法進(jìn)行單因素方差分析得出兩種方法具有顯著性差異，并且B方法測(cè)得含量大于A方法。B方法測(cè)得鹽酸麻黃堿的含量更接近實(shí)際投料值，說(shuō)明廠家按處方投料，造成差異的原因是A方法可能是制備供試品溶液過(guò)程中過(guò)于復(fù)雜，在萃取、轉(zhuǎn)移等操作中造成鹽酸麻黃堿損失。而新建立的提取方法，操作方便快捷，也不會(huì)造成鹽酸麻黃堿的損失，使得止咳祛痰糖漿的標(biāo)準(zhǔn)更加完善。

綜上所述，本研究所建立的HPLC法測(cè)定止咳祛痰糖漿中鹽酸麻黃堿含量測(cè)定方法，經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、耐用性強(qiáng)，為止咳祛痰糖漿質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2022-08-09 編輯：劉 斌）