不同種植地天麻6種主要成分的比較研究

楊成翠，唐玉鳳，程立君，馬克堅(jiān)，高國希，李春燕，楊順強(qiáng)*

（1.昭通學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省天麻與真菌共生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省天麻綠色種植與加工工程研究中心，云南 昭通 657000；2.云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明 650000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650000）

天麻是我國傳統(tǒng)貴重藥材，一般認(rèn)為天麻素是天麻重要的活性成分，2010 版《中國藥典》中天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也是以天麻素作為重要的參考指標(biāo)［1］。隨著研究的深入，學(xué)者們普遍認(rèn)為天麻藥效作用的發(fā)揮主要是其多個(gè)成分協(xié)同作用的結(jié)果，其中天麻素、對(duì)羥基苯甲醇（天麻苷元）、對(duì)羥基苯甲醛等酚類化合物被認(rèn)為是天麻的主要活性成分。2020年版《中國藥典》中要求天麻供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，樣品中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總含量不低于0.25%，另外4個(gè)特征峰為巴利森苷類物質(zhì)的特征峰［2］。隨著研究的深入，巴利森苷類物質(zhì)逐漸被認(rèn)為是天麻的重要有效成分。劉智慧等［3］研究表明，巴利森苷A和巴利森苷C可顯著改善東莨菪堿損傷的空間學(xué)習(xí)記憶能力，且改善效果優(yōu)于天麻素；Wang等［4］研究認(rèn)為，巴利森苷J(rèn)和巴利森苷B對(duì)心肌細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用；Wang等［5］研究認(rèn)為，巴利森苷及其衍生物對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有一定的保護(hù)作用［5］；康傳志等［6］研究表明，天麻素類與巴利森苷類物質(zhì)在生物合成和積累上存在必然的聯(lián)系，各成分間在植物機(jī)體內(nèi)必然存在相互轉(zhuǎn)化。天麻生長發(fā)育和主要成分的積累受產(chǎn)地條件［7-8］、栽培模式［9-10］、種苗等級(jí)［10-11］、天麻種質(zhì)［5,12-13］等因素的綜合影響。但是相同來源的天麻種苗，采用相同的栽培模式在不同環(huán)境條件下栽培，其藥用活性成分也可能會(huì)存在個(gè)體和產(chǎn)地間的差異，為此，本研究對(duì)不同種植地天麻個(gè)體中天麻素、天麻苷元和巴利森苷A、B、C、E 含量進(jìn)行了比較研究，以期為天麻資源開發(fā)利用、品種選育和科學(xué)栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年1月，將來源于昭通市小草壩鎮(zhèn)小草壩村同一種植戶，單個(gè)重20~30 g的天麻種（烏天麻）分別栽種于云南省昭通市彝良縣小草壩鎮(zhèn)小草壩村(以下簡(jiǎn)稱小草壩鎮(zhèn)，編號(hào)XCB)、云南省昭通市鎮(zhèn)雄縣碗廠鎮(zhèn)白巖壩村(以下簡(jiǎn)稱碗廠鎮(zhèn)，編號(hào)WC)、云南省昭通市永善縣水竹鄉(xiāng)水竹村(以下簡(jiǎn)稱水竹鄉(xiāng)，編號(hào)SZ)及貴州省畢節(jié)市國家森林公園拱攏坪雷音谷景區(qū)(以下簡(jiǎn)稱拱攏坪雷音谷景區(qū)，編號(hào)GLP)4個(gè)不同的種植地。2019年1月20日，分別從上述栽培點(diǎn)采樣，采集3個(gè)生長健壯，無病蟲害，單個(gè)重100 g左右的天麻作為樣品，用清水洗凈，100 ℃蒸制透心，冷卻，65 ℃烘干，粉碎過3號(hào)篩，備用。3個(gè)天麻的混合樣為1次重復(fù)，重復(fù)3次。

1.2 儀器與試劑

LC-30AD高效液相色譜系統(tǒng)包括高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV-VIS檢測(cè)器和色譜工作站（日本島津公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品天麻素（批號(hào)110807-201809）和對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)111970-201702）均購于中國食品藥品檢定研究院；標(biāo)準(zhǔn)品巴利森苷A（批號(hào)PS011129）、巴利森苷B（批號(hào)PS011138）、巴利森苷C（批號(hào)PS011140）、巴利森苷E（批號(hào)PS012053）均購于成都普思生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取適量天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和巴利森苷A、B、C、E對(duì)照品，加75%乙醇溶解，分別制成單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，再分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品液制備 稱取1.0 g左右天麻樣品，置于錐形瓶中，加入75%乙醇25 mL，超聲提取30min，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，濾液用于天麻素、對(duì)羥基苯甲醇及巴利森苷類物質(zhì)的測(cè)定，每個(gè)天麻3次重復(fù)。

1.3.3 測(cè)定方法 采用高效液相色譜法對(duì)天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和巴利森苷含量進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Phernomex Gemini 5 μ C18 110A（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈(A)、0.1%磷酸水(B)。0~10 min，A∶B=2∶98；10~20 min，A∶B=8∶92；20~30 min，A∶B=12∶88；30~47 min，A∶B=25∶75；47~53 min，A∶B=90∶10；53~60 min，A∶B=2∶98。流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長：270 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較（新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品成分分離測(cè)定

將混合標(biāo)準(zhǔn)液和天麻樣品提取液上機(jī)檢測(cè)，在50 min內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)液檢測(cè)出了天麻素(GA)、對(duì)羥基苯甲醇(HA)和巴利森苷A(PA)、巴利森苷B(PB)、巴利森苷C(PC)、巴利森苷E(PE)6種天麻的主要成分，獲得了基線穩(wěn)定、無拖尾、靈敏度高的理想圖譜。天麻樣品液也檢測(cè)出了多種天麻的主要成分（圖1）。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的圖譜，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各成分濃度與峰面積的線性回歸方程，線性關(guān)系良好（表1），可作為樣品中各成分含量計(jì)算使用。

表1 天麻6種主要成分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 混合對(duì)照品溶液和天麻樣品的HPLC色譜圖

2.2 天麻樣品重量及含水量

由表2可以看出，不同種植地天麻樣品平均鮮重差異不顯著，其中SZ種植地天麻樣品的平均鮮重最重，為104.737 g/個(gè)；XCB、SZ和WC這3個(gè)種植地天麻樣品的平均干重差異不顯著，WC種植地天麻樣品的平均干重最重，為26.818 g/個(gè)，顯著高于GLP種植地的；GLP種植地天麻樣品的平均含水量最高，為80.18%，顯著高于SZ和WC這2個(gè)種植地的，WC種植地天麻樣品的含水量最低，為74.10%，上述分析表明種植地不同影響了天麻的含水量。

表2 不同種植地天麻樣品含水量和重量

2.3 同一種植地天麻樣本間主要成分的含量

同一種植地天麻樣本間GA、HA、PA、PB、PC、PE含量及巴利森苷總量差異明顯（表3）。XCB種植地天麻樣本間的GA含量差異極顯著，其中XCB-1樣本中的GA含量最高，為2.186 mg/g；XCB-2樣本中的HA、PA、PB和PC含量均最高，分別為0.750、6.596、2.895和1.358 mg/g，均極顯著高于XCB-1和XCB-3的；XCB-3樣本中的PE含量極顯著高于XCB-1和XCB-2的，為9.693 mg/g。SZ種植地的天麻樣本間，SZ-2中的GA、HA、PA、PB和PC含量均極顯著高于SZ-1和SZ-3的，分別為：2.313、1.167、14.377、4.665和2.586 mg/g；SZ-3中的PE含量極顯著高于SZ-1和SZ-2的，為8.999 mg/g。WC種植地的天麻樣本間，WC-1和WC-2中的PC含量分別為1.695、1.684 mg/g，極顯著高于WC-3的，而在WC-1和 WC-2間差異不顯著；WC-1中的PE含量為13.074 mg/g，極顯著高于WC-2和 WC-3的；WC-2中的GA、HA、PA和PB含量均最高，分別為0.207、3.534、12.953和3.964 mg/g。GLP種植地的天麻樣本間，GLP-1樣本中的GA、PC和PE含量均極顯著高于GLP-2和GLP-3的，分別為3.849、2.310和4.260 mg/g；GLP-2中的PA含量最高，為6.753 mg/g，極顯著高于GLP-1和GLP-3的；GLP-3中的HA和PB含量均極顯著高于GLP-1和GLP-2的，分別為1.047和3.946 mg/g。各種植地天麻樣本間巴利森苷總量差異均達(dá)極顯著水平，其中SZ-2樣本的高達(dá)27.847 mg/g，GLP-2的僅為11.540 mg/g。

表3 不同產(chǎn)地天麻中主要成分含量 mg/g

2.4 不同種植地天麻主要有效成分的含量

由表3可知，不同種植地天麻樣本間GA的平均含量差異明顯，其中GLP種植地的平均含量最高，WC種植地的平均含量最低，分別為3.378和0.198 mg/g；WC種植地的HA平均含量為2.340 mg/g，顯著高于其他3個(gè)種植地的，XCB、SZ和GLP這3個(gè)種植地樣本間的HA平均含量差異不顯著。各種植地間PA、PB、PC和PE的平均含量差異均不顯著，其中，SZ種植地的PA、PC平均含量均最高，分別為10.179和1.904 mg/g，XCB種植地的均最低，分別為4.623、0.968 mg/g。WC種植地的PE平均含量最高，為7.952 mg/g，GLP種植地的最低，僅為3.411 mg/g。巴利森苷總量平均值從高到低依次為SZ（22.371 mg/g）＞W(wǎng)C（19.869 mg/g）＞XCB（15.388 mg/g）＞GLP（13.011 mg/g）。不同種植地天麻中GA、HA、PA、PB、PC、PE的平均含量及巴利森苷總量的平均值差異較大，但大多差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

康傳志等［14-17］研究表明，巴利森苷是天麻素和檸檬酸縮合而成的酯類物質(zhì)，天麻素和巴利森苷等主要成分在天麻體內(nèi)存在相互轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)中，不同種植地間GA和HA含量差異明顯；PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷總量差異較大，但均未達(dá)顯著水平，表明天麻中主要有效成分含量因種植地環(huán)境不同而存在差異。這可能是因?yàn)椴煌N植地生態(tài)環(huán)境條件的不同而影響了天麻主要成分的轉(zhuǎn)化和積累，可為天麻高品質(zhì)定向科學(xué)栽培提供依據(jù)。

鄭治洪等［18-21］對(duì)不同規(guī)格等級(jí)的天麻主要成分做了大量研究，發(fā)現(xiàn)天麻主要成分含量因天麻規(guī)格等級(jí)不同而存在差異。本試驗(yàn)中，同一種植地相似規(guī)格的各天麻樣本間GA、HA、PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷總量差異明顯。表明同一栽培環(huán)境下，同一規(guī)格等級(jí)的天麻樣本間各成分含量差異較大，天麻個(gè)體生長發(fā)育、主要成分轉(zhuǎn)化和積累等因天麻個(gè)體不同而存在差異，導(dǎo)致天麻主要成分含量個(gè)體差異較大。這為天麻品種選育和科學(xué)栽培提供了啟示。