成熟度對(duì)烤煙上部煙葉生理特性及煙葉質(zhì)量的影響

賈中林，尹啟生，陳廣晴，李許濤，戴華鑫，陳壯壯，梁太波*，張艷玲

（1.深圳煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東 深圳 518110；2.中國(guó)煙草總公司 鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001；3.河南省煙草公司，河南 鄭州 450000）

成熟度是煙葉質(zhì)量的核心要素，煙葉適熟采收是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉的關(guān)鍵，對(duì)卷煙質(zhì)量的貢獻(xiàn)占整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的1/3［1-2］。烤煙上部煙葉是指煙株頂部4~6片煙葉，占單株總產(chǎn)量的40%左右；相比其他部位的煙葉，上部煙葉煙氣濃度更高、香氣量更足、滿足感更強(qiáng)，優(yōu)質(zhì)的上部煙葉是生產(chǎn)高檔卷煙的重要原料，對(duì)卷煙香味及風(fēng)格都有很大貢獻(xiàn)［3］。良好的成熟度是保證烤煙烘烤質(zhì)量的前提，受生態(tài)環(huán)境、品種特性及栽培技術(shù)等多種因素影響，不同地區(qū)適宜的上部煙葉采收成熟度存在明顯差異。劉輝等［4］研究認(rèn)為，貴陽(yáng)煙區(qū)云煙87上部煙葉在葉面80%黃綠色、主脈變白2/3以上時(shí)采收，烤后煙葉的外觀和感官質(zhì)量較好；王春凱等［5］研究認(rèn)為，云煙97在7~8成黃時(shí)采收的烤后煙葉感官評(píng)吸質(zhì)量顯著優(yōu)于8~9成黃時(shí)采收的烤后煙葉；張冰濯等［6］研究表明，湘南煙區(qū)烤煙上部煙葉適當(dāng)提高采收成熟度，可以改善煙葉的外觀和感官品質(zhì)，但當(dāng)成熟度超過(guò)一定程度后，煙葉質(zhì)量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，具體表現(xiàn)為煙葉過(guò)熟、身份變薄、油分減少、香氣質(zhì)下降、雜氣和刺激性增加。目前，河南部分煙區(qū)仍存在上部煙葉采生、采青現(xiàn)象，導(dǎo)致烤后煙葉存在組織結(jié)構(gòu)緊密，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，刺激性大、雜氣重等問(wèn)題。此外，由于受煙株個(gè)體差異和環(huán)境因素的影響，即使在同一采收期，不同上部煙葉的成熟度和鮮煙素質(zhì)也會(huì)存在較大差異。因此，針對(duì)產(chǎn)區(qū)實(shí)際情況，明確采收成熟度對(duì)烤煙上部煙葉質(zhì)量的影響，對(duì)確定適宜采收成熟度、提高上部煙葉質(zhì)量具有重要意義。本試驗(yàn)以豫西地區(qū)主栽品種云煙99為研究對(duì)象，參照當(dāng)?shù)責(zé)熮r(nóng)采收上部煙葉實(shí)際狀況，在大田煙葉成熟期采集不同成熟度的上部煙葉，通過(guò)分析不同成熟度鮮煙葉生理生化指標(biāo)和初烤煙葉內(nèi)外在質(zhì)量情況，明確成熟度對(duì)鮮煙葉生理特性及烤后煙葉質(zhì)量的影響，為高可用性上部煙葉的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年在河南省三門峽靈寶市朱陽(yáng)鎮(zhèn)進(jìn)行。供試烤煙品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙99。試驗(yàn)地土壤為褐土，土壤理化性質(zhì)為：pH值7.8，有機(jī)質(zhì)含量12.4 g/kg，堿解氮含量54.2 mg/kg，有效磷含量25.2 mg/kg，速效鉀含量233 mg/kg。大田移栽行距為1.20 m，株距為0.50 m，其他田間管理措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程實(shí)施。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在烤煙上部煙葉成熟期，依據(jù)葉面顏色和主脈變白程度，對(duì)上部倒數(shù)第3~4片煙葉進(jìn)行成熟度檔次劃分，分為4個(gè)成熟度梯度：M1，葉面60%~70%黃綠色、主脈變白1/4左右；M2，葉面70%~80%黃綠色、主脈變白1/2左右；M3，葉面80%~90%黃綠色、主脈變白3/4左右；M4，葉面90%~100%黃綠色、主脈基本全白。每個(gè)梯度采集200片左右煙葉，一部分帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定生理指標(biāo)，另一部分按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝烘烤，采集烤后煙葉樣品，測(cè)定化學(xué)成分并進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 煙葉生理指標(biāo)測(cè)定 質(zhì)體色素測(cè)定：質(zhì)體色素含量測(cè)定采用李合生［7］的方法，用80%丙酮作為提取液，分別在波長(zhǎng)663、646和470 nm下測(cè)定其吸光值，根據(jù)公式計(jì)算相應(yīng)的色素含量，分光光度計(jì)為島津UV-2550型。

生物酶活性測(cè)定：采用蘇州格銳思生物科技有限公司的酶活試劑盒，分別對(duì)鮮煙葉碳代謝相關(guān)的淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和氮代謝相關(guān)的硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 煙葉化學(xué)成分測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)［8］對(duì)鮮煙葉冷凍干燥后的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，初烤煙葉先在55 ℃下鼓風(fēng)干燥，粉碎過(guò)60目篩后再進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)。按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 216—2007［9］測(cè)定煙葉淀粉含量，按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2002［10］測(cè)定水溶性糖含量，按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 160—2002［11］測(cè)定總植物堿含量，按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 161—2002［12］測(cè)定總氮含量，按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 282—2009［13］測(cè)定游離氨基酸含量，按照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 447—2012［14］測(cè)定糖組分（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖）含量。

1.3.3 中性致香成分測(cè)定 采用GC/MS測(cè)定烤后煙葉中性致香成分，采用同時(shí)蒸餾萃取法進(jìn)行前處理，以二氯甲烷為萃取溶劑，同時(shí)蒸餾萃取時(shí)間為2 h。萃取完后，將二氯甲烷萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL，加入內(nèi)標(biāo)（乙酸苯乙酯），進(jìn)行GC/MS分析。分析所得圖譜經(jīng)NIST計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索，選擇化合物的特征離子為定量離子，以其定量離子面積和內(nèi)標(biāo)定量離子面積比計(jì)算其相對(duì)含量。

GC/MS條件：色譜柱為DB-5彈性石英毛細(xì)管柱（60.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL ；載氣：氦氣；載氣流量：1 mL/min；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230℃；電離方式：EI；電離電壓：70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍：30~350。

1.3.4 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 每個(gè)成熟度梯度選取調(diào)制后具有代表性的煙葉2.0 kg，對(duì)烤后煙葉進(jìn)行抽梗、切絲、卷接，按照YC/T 138—1998［15］煙草及煙草制品感官評(píng)價(jià)方法的規(guī)定進(jìn)行感官品質(zhì)鑒定，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、余味等，感官質(zhì)量評(píng)價(jià)總分根據(jù)賦值法計(jì)算。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用 Microsoft Excel 2019、SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素法方差分析和 Duncan’s 新復(fù)極差法比較檢驗(yàn)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟度對(duì)煙葉質(zhì)體色素含量的影響

隨著成熟度的增加，煙葉中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素含量的變化規(guī)律相似，均呈逐漸降低的趨勢(shì)（圖1）。煙葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量均以M1成熟度最高，M4最低，不同成熟度之間存在較大差異。整個(gè)成熟過(guò)程中葉綠a降解量為0.54 mg/g，大于葉綠素b的降解量（0.15 mg/g)，葉綠素的總降解量為0.69 mg/g，類胡蘿卜素的降解量為0.12 mg/g。葉綠素的降解量明顯高于類胡蘿卜素的，這也是在煙葉成熟過(guò)程中顏色由綠轉(zhuǎn)黃的重要原因。

圖1 不同成熟度煙葉質(zhì)體色素含量

2.2 成熟度對(duì)煙葉碳氮代謝酶活性的影響

不同成熟度煙葉碳氮代謝相關(guān)酶活性變化如圖2所示，隨著成熟度的增加，鮮煙葉淀粉酶活性逐漸降低，在M1成熟度時(shí)為8.05 mg/(min·g)，至M4時(shí)降至4.05 mg/(min·g)；蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在M4成熟度時(shí)達(dá)到最大值，為1.30 μg/(min·g)，說(shuō)明在煙葉成熟過(guò)程中淀粉的分解代謝逐漸減弱，而蔗糖的分解代謝逐漸增強(qiáng)。煙葉氮代謝關(guān)鍵酶硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性隨著成熟度的增加呈拋物線變化，在M2成熟度時(shí)達(dá)到最大值，分別為86.33 μg/(h·g)和9.53 U/g，之后活性迅速下降，說(shuō)明在煙葉成熟后期氮合成代謝強(qiáng)度逐漸降低。

圖2 不同成熟度煙葉碳氮代謝相關(guān)酶活性

2.3 成熟度對(duì)煙葉碳氮代謝產(chǎn)物的影響

從圖3A可以看出，隨著成熟度的增加，鮮煙葉碳代謝產(chǎn)物中總糖、還原糖和淀粉含量均表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，還原糖含量的最大值出現(xiàn)在M2成熟度時(shí)，為7.48%；總糖和淀粉含量在M3成熟度時(shí)達(dá)到最大值，分別為12.05%和36.80%。對(duì)碳代謝產(chǎn)物中可溶性糖組分進(jìn)行分析（圖3B），發(fā)現(xiàn)果糖和葡萄糖在糖組分中所占比重較大，含量在25~40 mg/g之間，蔗糖和麥芽糖含量相對(duì)較低，在3~10 mg/g之間。隨著成熟度的增加，果糖和葡萄糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，蔗糖含量逐漸升高，麥芽糖含量則逐漸降低。隨著成熟度的增加，鮮煙葉氮代謝產(chǎn)物中總氮和游離氨基酸含量逐漸降低（圖4），在M4成熟度時(shí)降至最小值，分別為1.96%和4.65 μg/g，較M1成熟度分別下降了17.30%和50.27%。煙葉總植物堿含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在M2成熟度時(shí)達(dá)到最大值，為3.41%，之后逐漸降低。

圖3 不同成熟度鮮煙葉碳代謝產(chǎn)物含量

圖4 不同成熟度鮮煙葉氮代謝產(chǎn)物含量

2.4 成熟度對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分的影響

由表1可以看出，隨著成熟度的增加，烤后煙葉的總糖、還原糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，均在M3成熟度時(shí)達(dá)到最大值，分別為26.94%和22.51%；總氮含量整體呈逐漸降低的變化趨勢(shì)；總植物堿和淀粉含量呈逐漸增加的變化趨勢(shì)，至M4成熟度時(shí)達(dá)到最大值，分別為3.66%和5.02%。烤后煙葉的氮堿比值隨著成熟度的增加而逐漸降低，糖堿比值則表現(xiàn)為先增加后降低的變化趨勢(shì)。

表1 不同成熟度烤后煙葉化學(xué)成分 %

不同成熟度烤后煙葉游離氨基酸含量如表2所示，本研究共檢測(cè)了21種游離氨基酸，包括18種蛋白氨基酸和3種非蛋白氨基酸。參照文獻(xiàn)［16］將蛋白氨基酸分為八大類，分別為酸性、堿性、芳香族、脂肪族、含羥基類、含硫類、亞氨基酸類和酰胺類氨基酸。與鮮煙葉相比，烤后煙葉中游離氨基酸含量顯著增加。隨著成熟度的增加，烤后煙葉各氨基酸組分與總游離氨基酸含量變化趨勢(shì)相似，均呈逐漸降低的趨勢(shì)。整個(gè)成熟過(guò)程中游離氨基酸總量下降了17.15 mg/g，以亞氨基酸類含量下降最多，為9.78 mg/g。煙葉中芳香族、酸性、堿性和酰胺類氨基酸占總游離氨基酸的比例隨著成熟度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)，而脂肪族和亞氨基酸含量占比整體呈升高的趨勢(shì)。

表2 不同成熟度烤后煙葉游離氨基酸含量 mg/g

對(duì)烤后煙葉可溶性糖組分含量（圖5）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與鮮煙葉相比，烤后煙葉的果糖和葡萄糖含量均顯著增加，而蔗糖和麥芽糖含量出現(xiàn)了不同程度的下降，這與烘烤過(guò)程中蔗糖的進(jìn)一步降解密切相關(guān)?？竞鬅熑~的糖組分占比仍以果糖和葡萄糖含量占比較高，但兩者含量差異較鮮煙葉變小。隨著成熟度的增加，烤后煙葉中果糖和葡萄糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，最大值均出現(xiàn)在M3成熟度時(shí)，分別為132.17、132.41 mg/g。蔗糖和麥芽糖含量相對(duì)較低，隨著成熟度的提升，蔗糖含量略微下降，麥芽糖含量有升高的趨勢(shì)。

圖5 不同成熟度烤后煙葉糖組分含量

2.5 成熟度對(duì)烤后煙葉中性致香物質(zhì)含量的影響

經(jīng)GC/MS分析檢測(cè)得到了61種中性致香成分，按照致香官能團(tuán)的不同，可以將所測(cè)致香物質(zhì)劃分為醛類（13種）、醇類（7種）、酮類（32種）、酚類（1種）、酯類（5種）和含氮雜環(huán)類化合物（3種）。不同成熟度煙葉中以酮類物質(zhì)含量占比最大，醇類物質(zhì)占比次之。隨著煙葉成熟度的增加，酮類和中性致香物質(zhì)總含量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖6），其中在M3成熟度時(shí)含量最高，分別為71.61和88.27 μg/g，醇類物質(zhì)的含量逐漸增加，最大值出現(xiàn)在M4成熟度時(shí)，為21.17 μg/g。醛類物質(zhì)含量在成熟過(guò)程中呈逐漸降低的變化趨勢(shì)，在M4成熟度時(shí)降至最低，為1.92 μg/g。酚類、酯類等其他類致香物質(zhì)在烤后煙葉中含量較低，且隨著成熟度的增加整體呈升高的趨勢(shì)。

圖6 不同成熟度烤后煙葉中性致香物質(zhì)含量

2.6 成熟度對(duì)烤后煙葉感官質(zhì)量的影響

隨著成熟度的增加，烤后煙葉感官質(zhì)量總分呈先升高后略微降低的變化趨勢(shì)，以M3成熟度的分?jǐn)?shù)最高（表3）。各項(xiàng)指標(biāo)得分隨著成熟度的提升，整體上表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，但也有個(gè)別指標(biāo)如香氣量、勁頭、刺激性和余味的評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在M4時(shí)略有降低。綜合分析表明，在M3成熟度時(shí)烤后煙葉香氣質(zhì)好、香氣量足、勁頭適中、刺激性小、余味更舒適，感官質(zhì)量評(píng)價(jià)最好。

表3 不同成熟度烤后煙葉感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 分

3 討論

煙葉質(zhì)體色素是重要的香氣前體物質(zhì)，其本身不具有特征香氣，但可以通過(guò)分解、轉(zhuǎn)化形成對(duì)煙葉品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)的香氣成分［17］。在煙葉成熟過(guò)程中，隨著成熟度的不斷提升，葉綠體結(jié)構(gòu)由完整到破裂，葉綠素發(fā)生降解［18］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著煙葉成熟度的提高，葉綠素和類胡蘿卜素含量均逐漸降低，與前人研究結(jié)果類似［19-21］。葉綠素含量作為植物生長(zhǎng)過(guò)程的一個(gè)重要生化參數(shù)，常被用來(lái)指示葉片的生理狀況［22］。在整個(gè)成熟過(guò)程中葉綠素降解量顯著大于類胡蘿卜素降解量，葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化差異是造成不同成熟度煙葉之間顏色差異的主要原因，這一顏色變化也是目前生產(chǎn)上判斷煙葉成熟度的主要依據(jù)［23］。

煙葉成熟過(guò)程中，碳氮代謝的強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度以及動(dòng)態(tài)變化會(huì)直接影響煙葉中各類化學(xué)成分的含量和比例［24］。淀粉酶是碳水化合物積累代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將煙葉中的淀粉降解為糖類。隨著煙葉成熟度的提高，淀粉酶活性逐漸降低，說(shuō)明淀粉的降解能力在下降，這與鮮煙葉中淀粉含量的積累變化相反［25］。蔗糖轉(zhuǎn)化酶可以催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，其活性大小反映了煙葉對(duì)光合產(chǎn)物的利用程度。隨著成熟度的增加，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性整體呈升高趨勢(shì)，與鮮煙葉中糖含量的變化趨勢(shì)相同。本研究還發(fā)現(xiàn)，淀粉和糖類物質(zhì)的含量在M4成熟度時(shí)均出現(xiàn)了不同程度的下降，可能與煙葉衰老程度加深，大部分干物質(zhì)隨著呼吸消耗的降解有關(guān)［26］。一般認(rèn)為，煙葉氮代謝強(qiáng)度在葉片功能盛期時(shí)較強(qiáng)，之后隨著成熟度的提高氮代謝強(qiáng)度逐漸減弱，碳代謝強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)［24］。硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶是植物體內(nèi)參與氮素還原、同化和循環(huán)的關(guān)鍵酶。賈保順等［27］研究表明，在煙葉移栽后80~110 d硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性整體呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在煙葉成熟前期（M1~M2）氮代謝相關(guān)酶活性短暫升高，在成熟后期（M2~M4）酶活性迅速降低，與前人研究結(jié)果類似［28］。煙葉成熟過(guò)程中總植物堿含量與氮代謝相關(guān)酶活性的變化趨勢(shì)相同，總氮和游離氨基酸含量均呈逐漸降低的變化趨勢(shì)，這與衰老葉片中氮素轉(zhuǎn)移活動(dòng)以及氨揮發(fā)有關(guān)［29-30］。總體來(lái)看，在煙葉成熟后期，煙葉氮代謝活動(dòng)強(qiáng)度逐漸減弱，碳的積累代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)。

烤后煙葉化學(xué)成分與感官質(zhì)量密切相關(guān)，影響上部煙葉感官質(zhì)量最主要的化學(xué)成分是總氮、總糖和煙堿［31］。目前，我國(guó)多數(shù)產(chǎn)區(qū)上部煙葉總氮和煙堿含量高于國(guó)外優(yōu)質(zhì)上部煙葉。隨著煙葉成熟度的增加，烤后煙葉總氮含量呈下降趨勢(shì)，總糖含量呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明在一定程度上提高煙葉成熟度，有利于協(xié)調(diào)烤后煙葉化學(xué)成分，提高煙葉質(zhì)量［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，烤后煙葉淀粉含量在M4成熟度時(shí)最高，與趙高坤等［33］的研究結(jié)果相似，相關(guān)原因可能與過(guò)熟煙葉淀粉酶活性較低，在烘烤過(guò)程中對(duì)淀粉的降解不徹底有關(guān)。氨基酸在調(diào)制過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)是煙草中重要的致香反應(yīng)，煙葉游離氨基酸含量與感官品質(zhì)密切相關(guān)［16］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，成熟度高的煙葉中游離氨基酸含量較低，氨基酸組分中脯氨酸含量占比較高，而與品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)的芳香族、酸性和堿性氨基酸含量占比較低，可能與成熟度高的煙葉在烘烤過(guò)程中更有利于氨基酸的降解轉(zhuǎn)化有關(guān)［34］。氨基酸與還原糖發(fā)生的棕色化反應(yīng)是烤后煙葉中性致香成分中酮類物質(zhì)的主要來(lái)源，隨著成熟度的提高，中性致香物質(zhì)含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，與烤后煙葉感官質(zhì)量變化一致，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)提高煙葉成熟度有利于烤后煙葉質(zhì)量的提升［35］。

4 結(jié)論

隨著成熟度的增加，煙葉氮代謝活動(dòng)強(qiáng)度逐漸減弱，總氮和游離氨基酸含量均逐漸降低，總植物堿含量呈增加趨勢(shì)。隨著成熟度的提高，煙葉中淀粉的分解代謝活動(dòng)逐漸減弱，蔗糖的分解代謝逐漸增強(qiáng)，煙葉中糖含量隨著成熟度的增加達(dá)到最大值后開始下降。采收成熟度對(duì)烤后煙葉質(zhì)量有較大影響，豫西地區(qū)上部煙葉以M3成熟度采收時(shí)，烤后煙葉內(nèi)在化學(xué)成分較協(xié)調(diào)，中性致香物質(zhì)含量高，感官質(zhì)量最佳。