高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肌肉中尼卡巴嗪、地克珠利和托曲珠利的主要代謝物殘留量

◎宋佳盛，李 彤，李勝南，劉貴銘，?，摤摚瑒ⅧP海

（牡丹江醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

尼卡巴嗪屬于二硝基類抗球蟲藥，是4,4-二硝基均二苯脲（DNC）和α-羥基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）復(fù)合物，主要用于預(yù)防雞柔嫩艾美耳球蟲和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲，尼卡巴嗪進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)HDP排泄迅速，DNC排泄緩慢起主要抗球蟲作用[1]。地克珠利和托曲珠利是均三嗪類的高效、廣譜、的抗球蟲藥，可有效預(yù)防和治療雞、兔、羊和豬等禽畜艾美耳寄生蟲病。其中，地克珠利進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)不易分解，主要以原體抑蟲，而托曲珠利在動(dòng)物體內(nèi)可快速磺化成為妥曲珠利砜，起到抗球蟲作用。二硝基類和均三嗪類抗球蟲藥具有較強(qiáng)的治療效果，但由于其半衰期較短，頻繁用藥導(dǎo)致食品中藥物代謝物殘留增加影響食品安全，危害人體健康。歐盟和中國均頒布食品安全標(biāo)準(zhǔn)，對雞肌肉、皮和脂肪及肝、腎中這3種抗球蟲藥物代謝物最大殘留限量做了明確的規(guī)定[2]。因此，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照用法用量，并遵守停藥期，以避免食品中超標(biāo)殘留。

抗球蟲藥代謝物殘留量的檢測方法有免疫法[3]、液相法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]法，其中，免疫分析法往往需要制作相應(yīng)復(fù)雜的抗體，存在準(zhǔn)確率不高等缺點(diǎn)。液相色譜法儀器操作簡單，可以同時(shí)檢測多種抗球蟲藥物，但靈敏度僅能達(dá)到1 ug/kg。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中推薦的首選方法，靈敏度高可達(dá)1 ng/kg，檢出限低，完全能夠滿足實(shí)際需要[6]。實(shí)驗(yàn)采集不同地區(qū)雞肌肉樣品，選用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利的代謝物殘留量分析，結(jié)果令人滿意。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

尼卡巴嗪（4,4-二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利砜（北京TMstandard科技股份有限公司）、乙腈、甲醇，其余所用試劑均為分析純，水為超純水，現(xiàn)用現(xiàn)制。

AB SCIEX 4500型三重四極桿質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司 美國）；UltiMate3000型高效液相色譜儀（Thermo公司 美國）；204E型電子天平（METTLER TOLEDO公司 德國）；QC10260超聲清洗儀（天津旗美公司）；4型渦旋混合器（IKA公司 德國）；3-18型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司 德國）；PureLab Classic超純水器（ELGA公司 英國）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取尼卡巴嗪（以4,4二硝基均二苯脲計(jì)）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg（精確至0.1 mg，按純度值折算）。用甲醇溶解并定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液質(zhì)量銥度為1 000 mg/L。-20 ℃以下避光貯存，保存期為12個(gè)月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

分別準(zhǔn)確量取100 μL尼卡巴嗪（4,4二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至10 ml ，質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光保存，180 d內(nèi)有效。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ

分別準(zhǔn)確量取100 μL托曲珠利-d3溶液，用甲醇稀釋為10 mL,質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光保存，180 d內(nèi)有效。

1.2.4 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ

準(zhǔn)確內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ1 mL ，用乙腈定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為0.1 mg/L，4 ℃貯存，保存期為30 d。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)使用液

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，目標(biāo)化合物濃度分別為0.2 μg/L、0.5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L。

1.3 試樣制備

選取200 g用均質(zhì)器混合均勻，-4 ℃以下保存?zhèn)溆?。稱取均質(zhì)試樣2.00 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 uL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅰ，加入2 mL水渦旋混勻，再加入10 mL乙腈，旋渦混合30 s超聲提取20 min。10 000 r/min離心10 min（-5 ℃)。在15 mL離心管內(nèi)加入250 mg DSC-18和2 g無水硫酸鈉，再加上述上清6 mL，轉(zhuǎn)速9 000 r/min 離心時(shí)間5 min，最后取上清液1 mL用于HPLCMS/MS測定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Kinetex F5 C18（Phenomenex 美國），50 mmx3 mm、2.6 μm；柱溫設(shè)置20 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相：A 水，B 乙腈。液相色譜梯度洗脫條件表見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：離子源溫度為500 ℃；毛細(xì)管電壓為5.5 kV；脫溶劑氣溫度為550 ℃；脫溶劑氣流量為40 psi ；掃描模式：多離子反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM )。其它質(zhì)譜參數(shù)表見表2。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)表

2 結(jié)果

2.1 提取過程的優(yōu)化

2.1.1 選取提取溶劑

選擇正己烷、乙腈、三氯甲烷、二甲基亞砜和丙酮等5種有機(jī)溶劑對雞肉和雞蛋中地克珠利進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取效率分別為98.4%、80.9%、76.3%、69.6%、57.7%。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取溫度的選擇

選擇5、0、-5 ℃低溫冷凍條件下樣品提取，提取效率分別為99.2%、97.4%和92.3%，選擇-5 ℃作為提取溫度。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

使用甲醇-水和乙腈-水2種流動(dòng)相，對托曲珠利和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分離。由圖1可以看到，使用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的信號強(qiáng)度更高，干擾信號更低。因此，選擇乙腈-水作為最佳流動(dòng)相。

圖1 乙腈-水位流動(dòng)相時(shí)托曲珠利和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖

2.2.2 流動(dòng)相組成比例的影響

對比流動(dòng)相乙腈-水中乙腈比例分別為60%、80%、100%時(shí)分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈比例增大，目標(biāo)色譜峰出峰變快，響應(yīng)信號強(qiáng)。見圖2。

圖2 流動(dòng)相中不同比例乙腈-水對保留時(shí)間的影響結(jié)果圖

2.2.3 流速的影響

為了研究流速對分離效果的影響，比較了300、350、400 μL/min 3種不同流速下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，在流速降低時(shí)，保留時(shí)間延長，峰高和峰面積增加，分離效果更好。因此，選擇了300 μL/min作為最佳流速。

2.2.4 柱溫的影響

在20、30、40 ℃三種不同的柱溫下，對50 mg/L的尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分離。結(jié)果顯示，在溫度升高的情況下，峰面積沒有明顯變化，但是出峰時(shí)間具有顯著差異。在30 ℃和40 ℃時(shí)，尼卡巴嗪的出峰時(shí)間都比20 ℃時(shí)快很多。因此，選擇了30 ℃作為最佳柱溫。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將濃度均為100 μg/L尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣，通過碰撞能量、去簇電壓等條件優(yōu)化，建立質(zhì)譜參數(shù)。尼卡巴嗪選擇136和107作為定量和定性離子，地克珠利選擇333和222.9作為定量和定性離子，托曲珠利砜選擇399和147.8作為定量和定性離子，托曲珠利母離子不易形成碎片，分子離子選擇424.2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以目標(biāo)組分峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱軸，標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度ρ（μg/L）為橫軸，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。

表3 3種抗球蟲藥主要代謝物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限表

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

對地產(chǎn)雞肉、雞蛋樣品進(jìn)行采樣后進(jìn)行精密度、回收率實(shí)驗(yàn)。稱取雞肉或雞蛋 200 g，按上述制樣方法制取待測溶液6份，計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）并對精密度評價(jià)。結(jié)果如下：尼卡巴嗪RSD為2.04%，回收率87.5%~109%；地克珠利RSD為1.93%，回收率95.7%~107%；托曲珠利RSD為1.39%，回收率97.2%~106%；托曲珠利砜RSD為1.63%，回收率92.6%~101%。

2.6 實(shí)際樣品分析

在黑龍江省6個(gè)城市采集雞肉66份、雞蛋66份，使用該方法檢測其中抗球蟲類藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞肉和雞蛋樣品中尼卡巴嗪、地克珠利含量均＜0.1 μg/L，托曲珠利、托曲珠利砜均＜1.0 μg/L，表明，黑龍江省的雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥物的食品風(fēng)險(xiǎn)很低。

3 結(jié)語

通過對黑龍江省部分城市的雞肉和雞蛋樣品中抗球蟲類藥物殘留量的檢測，結(jié)果樣品中均未檢出，符合國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量的要求。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和性能評價(jià)后，超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法可對雞肉和雞蛋中3種抗球蟲藥殘留量進(jìn)行有效測定，方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠，可以作為食品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利和托曲珠利砜的檢測方法。