褪黑素通過激活Nrf2抑制鐵死亡改善隨意皮瓣存活

樓承浩，盧穎楓，王健

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 創(chuàng)面修復(fù)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 手外科·周圍神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

隨意皮瓣是骨外科、創(chuàng)面修復(fù)科重要的修復(fù)重建手段[1-2]。隨意皮瓣手術(shù)方式相對便捷，然而，隨意皮瓣的遠(yuǎn)端容易發(fā)生缺血再灌注損傷，導(dǎo)致皮瓣組織壞死[3]。鐵死亡是一種特殊的細(xì)胞死亡模式，在導(dǎo)致缺血再灌注損傷影響組織存活起到一定作用[4]。目前對于抑制鐵死亡的可能分子機(jī)制有了一定的研究，核紅細(xì)胞因子2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）在減輕脂質(zhì)過氧化抑制鐵死亡上起到了關(guān)鍵作用[5]。抑制Nrf2可能會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物（lipid hydroperoxide, LPO）的積累和促進(jìn)鐵死亡相關(guān)的疾病發(fā)生[6]。褪黑素（melatonin, MLT）是一種由松果體分泌的激素，主要與調(diào)節(jié)人體晝夜節(jié)律相關(guān)，同時也具有極強(qiáng)的抗氧化能力和過氧化物自由基清除能力[7]。其不良反應(yīng)少，安全性高，近年來大量研究表明MLT在免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保護(hù)心血管、抗腫瘤等多種疾病上都具有治療作用[8-9]。為了進(jìn)一步探討MLT對皮瓣保護(hù)的機(jī)制，了解鐵死亡對皮瓣存活的影響，在小鼠上設(shè)計一系列實驗以探討MLT是否可以通過抑制鐵死亡從而減輕隨意皮瓣的缺血再灌注損傷，促進(jìn)隨意皮瓣的存活。

1 材料和方法

1.1 材料成年雄性C57BL/6小鼠（18～20 g）由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0020。麻醉后去除背部毛發(fā)。在小鼠背部設(shè)計1.5 cm×4.5 cm隨意皮瓣，將皮瓣鈍性分離。在皮瓣基部切斷雙側(cè)髂腰動脈4-0醫(yī)用縫線原位縫合。將小鼠隨機(jī)分組，首先取20只小鼠隨機(jī)分為對照組、MLT組。第二步聯(lián)合使用Nrf2抑制劑ml385，取45只小鼠隨機(jī)分為對照組、MLT組、MLT+ ml385組。自造模開始，對MLT組和MLT+ml385組小鼠腹腔內(nèi)注射MLT 20 mg/kg，MLT+ml385組在給藥前30 min腹腔內(nèi)注射Nrf2抑制劑ml38530 mg/kg。對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)7 d。

1.2 小鼠術(shù)后皮瓣形態(tài)學(xué)觀察觀察皮瓣的顏色、質(zhì)地、彈性等以判斷皮瓣存活情況。切取完整皮瓣組織，稱重并記錄為皮瓣濕重。烘箱中充分烘干記為皮瓣干重。使用干濕重變化計算各組皮瓣組織含水量，評估皮瓣水腫情況。

1.3 激光多普勒血流灌注（laser Doppler blood flow，LDBF）成像麻醉后用脫毛膏脫去新生毛發(fā)，用激光多普勒儀對小鼠背部血流信號進(jìn)行掃描。使用moor LDI Review軟件分析數(shù)據(jù)，評估皮瓣血流量及灌注強(qiáng)度。

1.4 免疫組織化學(xué)染色將皮瓣組織切片烘干脫蠟水化。使用兔二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）染色。實驗中所用一抗：caspase-3 （1:100）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）（1:100）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）（1:100）、CD34（1:100），梯度脫水后中性樹膠封片。

1.5 組織HE及Masson染色染色前將切片脫蠟水化。按HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）及Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書步驟染色。梯度乙醇及二甲苯脫水后中性樹膠封片。

1.6 皮瓣組織丙二醛（malonaldehyde,MDA）、脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide,LPO）、組織鐵（tissue iron,Fe）含量檢測及谷胱甘肽（glutathione,GSH）檢測使用提取試劑將各組小鼠中段皮瓣組織低溫勻漿后離心取上清液用于后續(xù)檢測。按說明書分別使用MDA檢測試劑盒、LPO測試盒及組織Fe測定試劑盒、GSH檢測試劑盒檢測各組組織提取液中各種含量。

1.7 透射電子顯微鏡麻醉后迅速割取約0.5 mm× 1 mm×1 mm大的全層皮瓣組織塊，2.5%戊二醛固定。1%鋨酸后固定，醋酸鈾溶液室溫染色1 h。梯度丙酮脫水，放入包埋液包埋后在65 ℃烘箱聚合1～ 2 d。用玻璃刀切半薄切片，染色觀察定位后，進(jìn)行超薄切片，染色烘干后進(jìn)行電鏡觀察。

1.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測提取各組皮瓣組織蛋白，經(jīng)凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和緩沖液封閉后用TBST清洗后，將膜浸潤至一抗稀釋液稀釋的目標(biāo)蛋白一抗中，4 ℃搖床上孵育過夜。實驗中所用一抗：Nrf2（1:1000），鐵結(jié)合蛋白輕鏈（ferritin light chain, FTL）（1:1000），血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）（1:1000），谷胱甘肽過氧化酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）（1:1000）。TBST洗去一抗，并將膜浸潤至用TBST稀釋的與種屬對應(yīng)的二抗中，室溫慢搖床孵育1.5 h。將曝光液均勻滴至PVDF膜表面，使用化學(xué)發(fā)光顯像儀成像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 8.4.2統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采取LSD-t檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLT促進(jìn)小鼠隨意皮瓣存活術(shù)后第3天，對照組小鼠隨意皮瓣出現(xiàn)大面積淤斑，MLT組僅隨意皮瓣遠(yuǎn)端散在分布部分淤點。術(shù)后第7天，對照組淤斑連接成片，組織發(fā)黑、干燥、皺縮變硬，壞死面積趨于穩(wěn)定，而MLT組僅隨意皮瓣遠(yuǎn)端存在少量壞死組織，在第3、第7天MLT組相比于對照組存活面積增加（均P＜0.05），見圖1A-D。LDBF成像評估，MLT組較對照組小鼠皮瓣血流信號強(qiáng)度增高（均P＜0.05），富血流面積較大，其近端及周邊可見少量新生血管進(jìn)入皮瓣內(nèi)，見圖1E、圖1F。對照組遠(yuǎn)端皮瓣明顯水腫，而MLT組水腫程度較低，MLT組組織含水量較對照組減少（均P＜0.05），見圖1G、圖1H。HE及Masson染色結(jié)果顯示，對照組小鼠皮瓣組織中膠原纖維排列不規(guī)則、疏松，小血管較少，MLT組膠原纖維排列密集有序，小血管數(shù)量多，見圖1I、圖1J。

圖1 MLT促進(jìn)小鼠隨意皮瓣存活

2.2 MLT提高隨意皮瓣的抗氧化能力并抑制鐵死亡MLT組皮瓣中凋亡指標(biāo)caspase-3的含量較對照組降低（P＜0.05），見圖2A、圖2B。MLT組CD34陽性小血管含量明顯高于對照組，并且VEGF表達(dá)增加（P＜0.05），見圖2C-F。MLT組抗氧化蛋白SOD2表達(dá)較對照組上調(diào)（P＜0.05），見圖2G、圖2H。MLT組MDA和LPO含量均較對照組降低（P＜0.05），見圖2I、圖2J。MLT組皮瓣中的組織Fe含量較對照組降低（P＜0.05），見圖2K。MLT組較對照組增加了皮瓣組織中GSH含量（P＜0.05），見圖2L。與對照組比MLT組Nrf2表達(dá)增加（P＜0.05），抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)e轉(zhuǎn)運蛋白SLC40A1的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），鐵死亡的關(guān)鍵抑制酶GPX4含量增加（P＜0.05），見圖2M-Q。2組小鼠皮瓣的缺血損傷區(qū)域發(fā)現(xiàn)線粒體膜密度增加，體積縮小，細(xì)胞核大小基本正常，但染色質(zhì)減少，核仁缺失，符合鐵死亡損傷的特征，見圖2R。

圖2 MLT提高隨意皮瓣的抗氧化能力并抑制鐵死亡

2.3 抑制Nrf2 拮抗MLT對小鼠隨意皮瓣存活的保護(hù)作用與MLT組比，MLT+ml385組Nrf2下調(diào)（P＜0.05）、抗氧化指標(biāo)HO-1下調(diào)（P＜0.05）、抗脂質(zhì)過氧化指標(biāo)GPX4下調(diào)（P＜0.05）、FTL下調(diào)（P＜0.05），見圖3。

圖3 抑制Nrf2逆轉(zhuǎn)MLT減輕鐵死亡的作用

3 討論

隨意皮瓣在設(shè)計時不涉及主要血供血管，僅通過蒂部毛細(xì)血管網(wǎng)及基底部滲血提供血運，在較長的隨意皮瓣血運得到重建前皮瓣遠(yuǎn)端往往會由于血液灌注不足導(dǎo)致缺血損傷。MLT已被證明具有廣泛的生物學(xué)特性，除了調(diào)節(jié)生物節(jié)律的作用，在抗凋亡、抗炎、抗氧化方面的作用被廣泛研究[10-11]。本研究首先驗證了MLT對小鼠隨意皮瓣的存活具有保護(hù)作用，在組織形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為MLT增加了小鼠隨意皮瓣第3天及第7天的存活面積，一定程度上恢復(fù)了隨意皮瓣在第7天的血流灌注，促進(jìn)了小血管生成和皮瓣組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，在病理生理上MLT通過促進(jìn)小血管的再生，緩解了皮瓣組織中凋亡的發(fā)生，提升了皮瓣的抗氧化能力。隨意皮瓣在缺血再灌注損傷后代謝失衡產(chǎn)生的過量活性氧（reactive oxygen species, ROS）被認(rèn)為是導(dǎo)致皮瓣壞死的誘因之一。本研究結(jié)果證明MLT給藥后不但上調(diào)了抗氧化蛋白的表達(dá)，并且提升了抗氧化小分子GSH的含量，進(jìn)而提高了皮瓣組織抗氧化的潛力。并且MLT組MDA含量降低，提示MLT減輕了脂質(zhì)過氧化水平最終促進(jìn)了皮瓣存活。

為了深入探究MLT促進(jìn)隨意皮瓣存活的可能機(jī)制，通過掃描電鏡觀察到了隨意皮瓣的壞死中存在鐵死亡的發(fā)生，鐵死亡的本質(zhì)是一種由Fe介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷。鐵死亡的主要機(jī)制，一方面是細(xì)胞內(nèi)游離Fe離子異常積累，導(dǎo)致LPO的異常積累[12]；另一方面，GSH還原系統(tǒng)抗氧化能力代償不足，無法及時清除LPO導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。Fe代謝、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和表觀遺傳調(diào)控的紊亂都與缺血再灌注損傷中鐵死亡的進(jìn)展有關(guān)[14]。MLT在新生兒缺氧缺血性腦病模型中對鐵死亡的發(fā)生具有抑制作用[15]。MLT在小鼠腎小管上皮細(xì)胞中可以緩解急性腎損傷后發(fā)生的鐵死亡[16]。本研究MLT給藥后隨意皮瓣壞死區(qū)域的LPO水平降低、含量減少，說明MLT可能調(diào)節(jié)了不飽和磷脂和ROS之間的LPO反應(yīng)。Western blot檢測結(jié)果及組織GSH含量檢測結(jié)果表明MLT給藥后通過保護(hù)GSH抗脂質(zhì)過氧化還原系統(tǒng)抑制了鐵死亡。同時，對組織Fe含量測定及轉(zhuǎn)Fe蛋白SLC40A1表達(dá)的檢測提示MLT還促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的游離Fe向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)了隨意皮瓣中的Fe代謝。MLT可以通過抑制鐵死亡促進(jìn)隨意皮瓣存活。

MLT 是抑制隨意皮瓣鐵死亡的潛在信號通路。目前研究發(fā)現(xiàn)的鐵死亡調(diào)節(jié)通路包括TP53、NFE2L2、YAP1/YAP和WWTR1/TAZ等[13]。其中Nrf2在抑制鐵死亡上具有多重調(diào)節(jié)作用。此前已有大量研究表明，MLT可以激動Nrf2發(fā)揮生物學(xué)功能，有研究發(fā)現(xiàn)MLT可以通過激活A(yù)KT/Nrf2通路抑制氧化應(yīng)激，從而抑制公雞Leydig細(xì)胞的凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)MLT給藥后在皮瓣中Nrf2的表達(dá)水平顯著提升。因此，MLT對鐵死亡的抑制作用很可能是通過激活Nrf2而實現(xiàn)的。使用Nrf2的抑制劑ml385腹腔注射給藥以抑制皮瓣中Nrf2生物活性[18]。ml385導(dǎo)致了GSH合成降低、利用GSH進(jìn)行抗脂質(zhì)過氧化能力減弱、LPO含量增加、組織Fe代謝活性降低、組織Fe含量上升，從各方面說明了ml385可以阻斷MLT在皮瓣中對鐵死亡的抑制作用。這些結(jié)果也表明MLT對于隨意皮瓣鐵死亡的抑制作用依賴于激活Nrf2及其下游包括xCT/GSH/GPX4還原系統(tǒng)和Fe代謝相關(guān)的信號通路，Nrf2通過參與調(diào)控鐵死亡起到促進(jìn)隨意皮瓣存活的作用，但對于MLT如何在隨意皮瓣中激活Nrf2仍需進(jìn)一步探究。

本研究證明MLT可以促進(jìn)小鼠隨意皮瓣存活。鐵死亡是影響隨意皮瓣存活的因素之一，抑制鐵死亡能夠促進(jìn)隨意皮瓣存活；MLT可以通過激動Nrf2提高抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化并促進(jìn)Fe代謝抑制鐵死亡。但影響隨意皮瓣存活的因素眾多，機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步深入的研究及探索。