多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓單個核細胞中PGC-1α mRNA表達水平

董慧娟　程楊燕　鄭林　李春艷　顏靜秀

【摘要】 目的：探討多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓單個核細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（PGC-1α）mRNA表達水平及臨床意義。方法：收集2018年2月-2021年12月上饒市人民醫(yī)院收治的初治65例MM患者（MM組）和30例營養(yǎng)性貧血患者（對照組）的骨髓標本，提取單個核細胞，利用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法檢測各組研究對象骨髓單個核細胞中PGC-1α mRNA表達情況，并分析其與臨床相關指標之間的相關性。結果：MM組患者骨髓單個核細胞PGC-1α mRNA相對表達量顯著高于對照組（P<0.05）；MM組β2-微球蛋白（β2-MG）、乳酸脫氫酶（LDH）、C反應蛋白（CRP）及血鈣等臨床相關指標水平均顯著高于對照組（P<0.05），MM組血紅蛋白（Hb）水平顯著低于對照組（P<0.05）；經(jīng)Pearson相關性分析，發(fā)現(xiàn)PGC-1α mRNA相對表達量與β2-MG、LDH、血鈣和CRP水平呈正相關（P<0.05），與Hb呈負相關（P<0.05）。結論：PGC-1α mRNA在臨床上的表達與β2-MG、LDH、血鈣和CRP呈正相關，與Hb呈負相關，并且在MM骨髓單個核細胞中高表達，因此，認為可將其作為臨床監(jiān)測MM病情的一項重要指標。

【關鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α 核細胞 實時熒光定量聚合酶鏈式反應

Expression Level of PGC-1α mRNA in Bone Marrow Mononuclear Cells of Patients with Multiple Myeloma/DONG Huijuan， CHENG Yangyan， ZHENG Lin， LI Chunyan， YAN Jingxiu. //Medical Innovation of China， 2023， 20（09）： -111

[Abstract] Objective： To investigate the expression level and clinical significance of peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activation factor-1α （PGC-1α） mRNA in bone marrow mononuclear cells of patients with multiple myeloma （MM）. Method： Bone marrow samples were collected from 65 MM patients （MM group） and 30 nutritional anemia patients （control group） admitted to Shangrao People's Hospital from February 2018 to December 2021. Mononuclear cells were extracted from the specimens to detect the expression level of PGC-1α mRNA by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） method， and its correlation with clinical related indicators was analyzed. Result： The relative expression level of PGC-1α mRNA in bone marrow mononuclear cells of the MM group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. The levels of β2-microglobulin （β2-MG）， lactate dehydrogenase （LDH）， C-reactive protein （CRP） and blood calcium in the MM group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）， while the level of hemoglobin （Hb） was significantly lower than that in the control group （P<0.05）. Pearson correlation analysis found that the relative expression level of PGC-1α mRNA was positively correlated with β2-MG， LDH， blood calcium and CRP levels （P<0.05）， and negatively correlated with Hb （P<0.05）. Conclusion： The expression of PGC-1α mRNA is positively correlated with β2-MG， LDH， serum calcium and CRP in clinical practice， and negatively correlated with Hb， and is highly expressed in MM bone marrow mononuclear cells. Therefore， it is considered that it can be used as an important index for clinical monitoring of MM.

[Key words] Multiple myeloma Peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activation factor-1α Nuclear cell Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

First-author's address： Shangrao People's Hospital， Jiangxi Province， Shangrao 334000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.09.026

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）主要與漿細胞在骨髓中發(fā)生惡性增生有關，為血液腫瘤疾病中常見的一種。相關研究報道顯示，其在臨床上的死亡率一般較高[1]。MM發(fā)病機制較復雜，一般認為其主要與基因突變或遺傳等因素有關[2]。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1（peroxisome proliferator-activated receptorγ co-activation factor-1，PGC-1）是核激素受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉錄共激活因子，主要包括3個亞型，分別為：PGC-1α、PGC-1β和PGC-1相關因子，PGC-1α作為PGC-1家族中的一員，近年因其在褐色脂肪組織的適應性產(chǎn)熱過程中發(fā)揮作用而被發(fā)現(xiàn)[3]。大量證據(jù)顯示，在能量代謝較旺盛的機體組織（肝腎臟、心肌及骨骼肌等）中，PGC-1α也會表現(xiàn)為高表達狀態(tài)[4-6]?；诙囗椦芯繄蟮繮GC-1α在正常細胞代謝中所發(fā)揮的重要作用，近年關于該基因在腫瘤代謝作用中的研究，因此也受到一定關注。金蕾蕾等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α通過對腫瘤代謝的調控，可促進其發(fā)生和發(fā)展，同時對腫瘤微環(huán)境酸堿度的改變，不僅有利于提高腫瘤細胞攝取糖和脂質合成的能力，另外還有利于減弱使用化療藥物后所引起的氧化應激反應。不過，目前關于PGC-1α在MM患者中的研究還相對較少，本研究主要檢測初治MM患者骨髓單個核細胞中PGC-1α mRNA表達水平，并探討其與臨床相關指標的相關性，以期為MM的治療提供新靶點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年2月-2021年12月上饒市人民醫(yī)院收治的65例初治MM患者（MM組）和30例營養(yǎng)性貧血患者（對照組）的骨髓標本。納入標準：（1）所有納入MM患者均符合文獻[8]《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2017年修訂）》中關于MM相關診斷標準，且為初治患者，誘導及鞏固化療方案均以蛋白酶體抑制劑（硼替佐米、伊沙佐米）、免疫調節(jié)劑（來那度胺、泊馬度胺）為主；（2）對照組確診營養(yǎng)性貧血，且均有取骨髓標本檢測；（3）所有研究者一般資料完整。排除標準：（1）自身存在其他免疫相關疾病；（2）合并患有其他可能影響PGC-1α表達的惡性腫瘤疾病?；颊弑救思凹覍賹Ρ狙芯烤哂兄闄?。該研究已通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 骨髓單個核細胞中PGC-1α mRNA檢測方法 治療前收集相關數(shù)據(jù)。（1）RNA提?。撼槿」撬铇吮綞DTA抗凝，量約3 mL，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液（廠家：上?？评噭┯邢薰荆┟芏忍荻入x心分離單個核細胞。Trizol溶解提取的單個核細胞，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇清洗，提取細胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度測定純度及濃度，OD260/OD280=1.8～2.2為合格，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?）cDNA合成：按PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑盒（生產(chǎn)廠家：日本TAKARA公司）進行，反應體系5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dt 0.5 μL，Random 6 Primer 0.5 μL，total RNA 500 ng，RNase free dH2O加至10 μL。37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s反應后-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）引物合成：本研究中所用的PGC-1α及內(nèi)參β-actin引物（廠家：上海生工生物技術有限公司）序列為：PGC-1α上游引物5'TGCAGCCTAACTCCTCCCAC3'，下游引物5'AATAGGCCATCCATGGCTAGTCC3'；β-actin上游引物5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3，下游引物5'ATACTCCTGCTTGCTGATCC3'。（4）熒光定量PCR：實時熒光定量PCR反應按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒（廠家：日本TAKARA公司）進行，反應體系20 μL，包括了SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上游引物（10 μM）0.4 μL，下游引物（10 μM）0.4 μL，ROX Rererence Dye II （50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌ddH2O 6.8 μL。ABI PRISM ?7500 Fast Real-Tmie PCR System上95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，反應結束后軟件自動 得出mRNA的拷貝數(shù)。最終計算結果采用2-ΔΔCt值（其中ΔΔCt=ΔΔCtPGC-1α-ΔΔCtβ-actin）來表達基因的表達水平。

1.2.2 收集可判斷兩組研究對象病情或預后情況相關的臨床指標 主要包括：血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2-MG）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）及血鈣等。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件統(tǒng)一分析本研究所有記錄數(shù)據(jù)，計量資料均用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Pearson對PGC-1α表達水平與臨床指標之間的相關性進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 MM組患者中男36例，女29例；年齡27～86歲，平均（53.18±7.84）歲，包括IgA κ型7例，IgG κ例24例，IgA λ例12例，IgG λ例16例，輕鏈型6例，隨訪過程中20例患者出現(xiàn)難治復發(fā)。對照組中男19例，女11例；年齡35～71歲，平均（52.84±7.63）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 所提取RNA完整性和純度 采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA，可見2條清晰RNA帶，無明顯降解；采用紫外分光光度計檢測其A260/A280≥1.8，提取RNA純度較高。

2.3 MM組與對照組骨髓單個核細胞中PGC-1α mRNA相對表達量比較 MM組（65例）骨髓單個核細胞中PGC-1α相對表達量為（73.09±21.84），而對照組（30例）為（1.33±0.20），經(jīng)比較，MM組顯著高于對照組（P<0.05）。

2.4 MM組和對照組臨床相關指標水平比較 MM組β2-MG、血鈣、LDH及CRP等臨床相關指標水平均顯著高于對照組（P<0.05），MM組Hb水平顯著低于對照組（P<0.05），見表1。

2.5 PGC-1α mRNA相對表達量與臨床指標相關性分析 經(jīng)Pearson相關性分析，發(fā)現(xiàn)PGC-1α mRNA相對表達量與β2-MG、LDH、血鈣和CRP水平呈正相關（P<0.05），與Hb呈負相關（P<0.05），見表2。

3 討論

MM是一種漿細胞惡性疾病，其主要特征為漿細胞在骨髓中發(fā)生惡性增生[9]，目前，該疾病隨著我國人口老齡化不斷加劇，其發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢[10]。MM在臨床上的癥狀通常呈多樣性，其典型癥狀包括：貧血、骨骼和腎功能損害及高鈣血癥等[11-14]，另外大多數(shù)MM患者可能還會伴有免疫球蛋白分泌異常[15]。MM患者在臨床上通常采取化療或移植干細胞的方法進行治療，近年，在臨床上盡管使用沙利度胺和硼替佐米等藥物對MM治療顯現(xiàn)出一定效果[16]，但由于該病不能根治且易復發(fā)，因此，尋找新的研究方向以降低其復發(fā)率，同時對MM治療效果的提高及預后的改善均有一定積極意義。

PGC-1α為輔激活因子，主要在基因的轉錄調控中發(fā)揮作用，對于細胞快速適應能量缺失的環(huán)境至關重要，可調節(jié)組織代謝活動，而癌細胞的一項重要特征即為代謝的重編程，癌細胞在營養(yǎng)缺乏的微環(huán)境中其生長可能會受限，但PGC-1α卻能幫助癌細胞適應該種環(huán)境[17]。本研究從mRNA水平研究了PGC-1α在骨髓單個核細胞中的表達情況，結果顯示，與對照組相比，MM患者中PGC-1α相對表達水平明顯更高，這與金銘等[18]研究結果類似，說明在腫瘤組織中PGC-1α表達存在異常，由此也認為PGC-1α與MM的發(fā)生及發(fā)展具有一定關聯(lián)?？紤]到倫理及實際問題，本研究對照組為營養(yǎng)性貧血患者，未以健康人群為對照，PGC-1α表達在初治MM患者中的表達有待進一步證實。

由于臨床常用Hb、血鈣、β2-MG、CRP及LDH等相關指標對患者病情、預后情況進行判斷[19]，因此本研究分析了PGC-1α表達與上述指標之間的相關性。結果顯示PGC-1α與患者血清β2-MG、LDH、血鈣和CRP水平呈正相關（P<0.05），與Hb呈負相關（P<0.05）。由于β2-MG一般由漿細胞表面脫落至血清，其水平在一定程度上可反映全身骨髓瘤細胞總數(shù)[20]，因而通常認為該指標與MM預后相關；通常當機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時，CRP在肝細胞中合成，由于其濃度與骨髓瘤細胞的生長因子IL-6的活性呈正相關[21]，因此認為該指標也可作為MM病情和預后相關指標，由于PGC-1α與這些指標均具有顯著相關性，故進一步提示PGC-1α可能也是MM病情和預后因素。趙菊芬等[22]在研究報告中指出，PGC-1β在激活PI3K/AKT/mTOR信號通路后，可促使乳腺癌干細胞上皮-間充質轉化，最終形成乳腺癌干細胞，并影響干性相關標志物的表達。楊亞玲等[23]認為結直腸癌組織中PGC-1α的表達水平與疾病嚴重程度密切相關，即PGC-1α表達水平越高，結直腸癌患者病情越嚴重。不過目前尚不確定是否可以將PGC-1α作為判斷初治MM預后的獨立因素，還需擴大樣本對MM患者生存期進行多因素回歸分析來證實。近年臨床采取沙利度胺、硼替佐米和雷利度胺等藥物治療MM，盡管發(fā)現(xiàn)均能有效延長其生存期，但由于MM屬于難治愈性疾病，因此認為在臨床上尋找新的治療靶點對MM治療具有一定積極意義。

綜上所述，PGC-1α mRNA在臨床上的表達與β2-MG、LDH、血鈣和CRP呈正相關，與Hb呈負相關，并且在MM骨髓單個核細胞中高表達，因此，認為可將其作為臨床監(jiān)測初治MM病情的一項重要指標。

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（收稿日期：2022-10-17） （本文編輯：何玉勤）