宏基因組第二代測序技術在神經外科顱內感染病原學診斷中的應用價值

于海東,朱東,高麟,李海龍（包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院,內蒙古 包頭 014030）

顱內感染是神經外科術后常見的并發(fā)癥之一，雖然術前預防使用抗菌藥物、規(guī)范手術操作等措施可降低其發(fā)生率，但由于侵襲性操作及植入物的增多，導致細菌可通過直接進入、血行性播散或逆行浸潤而到達腦膜或腦脊液間隙，從而引起發(fā)熱、嘔吐，重者可出現(xiàn)意識不清、昏迷等臨床表現(xiàn)，病情進展迅速，如果治療不及時，往往可導致嚴重的后遺癥甚至死亡，因此感染的早期識別及治療至關重要。腦脊液細菌培養(yǎng)是明確顱內感染病原菌的常規(guī)方法，但是檢測時間較長，無法滿足臨床早期快速診斷需要。宏基因組第二代測序技術可以在單個檢測樣本中識別所有潛在病原體，在臨床感染病原學診斷領域具有良好的應用前景[1]。此次研究則分析宏基因組第二代測序技術在神經外科顱內感染病原學診斷中的應用價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2020年1月-2022年1月收治的18例神經外科手術后擬診顱內感染患者為研究對象，兩周后由3位神經外科專家共同判斷是否確診為顱內感染。18例神經外科術后擬診顱內感染患者中男10例，女8例，年齡范圍37-68歲，平均年齡（40.09±2.10）歲。納入標準：①入組前接受開顱、內鏡手術或者腦室穿刺引流術者。②術前無顱內感染表現(xiàn)者。③患者及家屬均知情同意。排除標準：①既往有中樞神經系統(tǒng)感染病史、免疫系統(tǒng)缺陷。②曾經接受免疫抑制治療。③配合度較低者。④中途退出者。本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法 嚴格無菌操作進行腰椎穿刺或者抽取腦室引流管內腦脊液10mL，在完成所有必要檢查后，剩余1-2mL腦脊液在-20℃條件下保存，12h內干冰運輸?shù)交炇覚z測平臺進行腦脊液mNGS檢測。具體操作：DNA提取和定量：1-2mL腦脊液樣本離心取沉淀物，按照試劑盒步驟提取DNA，以生物分析儀結合PCR進行測序前質量控制，按照試劑盒操作手冊進行DNA文庫構建。上機測序：檢測范圍包括已知1428種細菌、1130種病毒、73種真菌、48種寄生蟲和40種衣原體。生物信息分析：過濾掉長度＜35bp和低質量、低復雜序列后，生成高質量數(shù)據(jù)，通過BWA對比，去除人源序列，余下數(shù)據(jù)和專用微生物大數(shù)據(jù)庫進行對比，并和生物信息分析，獲得每種微生物序列深度和覆蓋率。

1.3 觀察指標 分析宏基因組第二代測序技術靈敏度、特異度、準確率。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）×100%，準確度=準確例數(shù)/每組對應總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 將數(shù)據(jù)納入SPSS20.0軟件中分析，計量資料比較采用t檢驗，并以（±s）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗，并以率（%）表示，P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

經臨床復核，即3名神經重癥專家對患者的臨床資料、實驗室檢查及影像學檢查進行綜合判讀并給出臨床診斷，最終臨床確診神經外科術后顱內感染12例，未感染6例。mNGS檢測診斷神經外科術后顱內感染的靈敏度和特異度及準確率分別為100%（12/12）、83.3%（5/6）、94.4%（17/18）；腦脊液細菌培養(yǎng)組靈敏度和特異度及準確率分別為66.7%（8/12）、50.0%（3/6）、61.1%（11/18）；宏基因組第二代測序技術靈敏度、特異度、準確率均高于常規(guī)腦脊液細菌培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 宏基因組第二代測序技術和腦脊液細菌培養(yǎng)靈敏度、特異度、準確率比較

3 討論

正常狀態(tài)下，由于有血腦屏障、腦膜、顱骨及頭皮等組織的保護，中樞神經系統(tǒng)一般不容易發(fā)生感染，但手術破壞了這些屏障，導致顱腔和外界相通，微生物極容易進入顱腔并繁殖，致使患者顱內感染幾率大大增加，從而引起嚴重的顱內感染。所以早期明確病原菌并盡快采取合適的抗生素治療對降低感染死亡率、改善預后尤為重要[2]。

目前臨床多依賴傳統(tǒng)腦脊液培養(yǎng)作為中樞神經系統(tǒng)感染的病原體鑒定方法，但由于其原理是通過體外培養(yǎng)檢出，周期較長，并且容易受到抗生素應用的影響，可使陽性率顯著降低。mNGS是用二代測序技術，又稱深度測序或高通量測序，能對樣品中的所有基因序列進行測定。該方法不需要對引起感染的病原體類型有預先的猜測，因此能發(fā)現(xiàn)樣品中所有的序列，可檢測上萬種微生物，對于感染患者的診治具有重要作用。與傳統(tǒng)微生物研究方法相比，宏基因組測序技術規(guī)避了絕大部分微生物不能培養(yǎng)、痕量菌無法檢測的缺點，因此近年來在環(huán)境微生物學研究中得到了廣泛應用。宏基因組第二代測序技術是以聚合酶鏈式反應為基礎，非靶向檢測樣本種存在的細菌、真菌、寄生蟲等病原體，具有高通量等特點[3]。并且宏基因組第二代測序技術檢測時間較短，不會受到抗生素治療的影響，目前已經成為多個感染領域的研究熱點[4-5]。近幾年業(yè)內開始研究其在中樞神經系統(tǒng)感染中的應用情況。有研究發(fā)現(xiàn)，基因組第二代測序技術在感染病原學診斷中準確率較高[6-7]。此次研究則分析宏基因組第二代測序技術在神經外科顱內感染病原學診斷中的應用價值，結果發(fā)現(xiàn)，宏基因組第二代測序技術靈敏度、特異度、準確率均高于常規(guī)腦脊液細菌培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，宏基因組第二代測序技術在神經外科顱內感染病原學診斷中具有一定價值，值得臨床重視并推廣。但本研究病例數(shù)少，為單中心研究，且研究對象均為開顱術后患者，具有一定局限性，探索mNGS更多的診斷價值仍需要更進一步研究。