基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討仙鶴草抗肝纖維化的作用機(jī)制

李麟　賴?yán)妗⑷A寶

摘要 目的：探究仙鶴草抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法：根據(jù)多種規(guī)則篩選仙鶴草化學(xué)成分，預(yù)測獲得靶基因，與肝纖維化發(fā)病機(jī)制相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行比對獲得仙鶴草抗肝纖維化的可能作用靶點(diǎn)。通過生物學(xué)信息注釋庫DAVID對關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，采用Cytoscape構(gòu)建仙鶴草化合物-靶點(diǎn)-信號通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證仙鶴草對大鼠肝星狀細(xì)胞-T6（HSC-T6）肝纖維化指標(biāo)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原1型α1（COL1A1）及蛋白激酶B（AKT）蛋白磷酸化的影響。結(jié)果：關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等，主要參與調(diào)控腫瘤信號通路、PI3K/AKT信號通路、腫瘤蛋白聚糖、胰島素抵抗和FoxO信號通路等。仙鶴草提取物可抑制HSC-T6中α-SMA、COL1A1蛋白的表達(dá)，升高AKT的磷酸化水平，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的部分預(yù)測結(jié)果。結(jié)論：仙鶴草可通過作用于PI3K/AKT信號通路等發(fā)揮抗肝纖維化作用。

關(guān)鍵詞 仙鶴草；肝纖維化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；PI3K/AKT信號通路；靶點(diǎn)

Anti-liver Fibrosis Mechanism of Agrimoniae Herba Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

LI Lin，LAI Liling，LIU Huabao

（Department of Hepatic Diseases，Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400021，China）

Abstract Objective：To explore the anti-liver fibrosis mechanism of Agrimoniae Herba.Methods：The chemical compounds of Agrimoniae Herba were screened out by multiple methods and the target genes were predicted and obtained.The potential targets of Agrimoniae Herba against liver fibrosis were obtained through the comparison with the targets related to the pathogenesis of liver fibrosis.Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were carried out for associated targets through DAVID.The chemical compound-target-pathway interaction network was visualized by Cytoscape software.The effects of Agrimoniae Herba on the expression of α-smooth muscle actin（α-SMA） and collagen type 1 alpha 1（COL1A1） and the phosphorylation of protein kinase B（AKT） in rat hepatic stellate cell-T6（HSC-T6） were further verified by experiments.Results：The key targets were mainly AKT1，STAT3，caspase-3，Jun，and ESR1，which were mainly involved in the regulation of tumor signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，tumor proteoglycans，insulin resistance，F(xiàn)oxO signaling pathway，etc.Agrimoniae Herba extract could inhibit the protein expression of α-SMA and COL1A1 and increase the phosphorylation level of AKT in HSC-T6，which verified the partial prediction results of network pharmacological analysis.Conclusion：Agrimoniae Herba could inhibit liver fibrosis by acting on the PI3K/AKT and other signaling pathways.

Keywords Agrimoniae Herba; Liver fibrosis; Network pharmacology; PI3K/AKT signaling pathway; Target

中圖分類號：R285；R282文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.010

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理過程，可以表現(xiàn)為肝功能減退、門靜脈高壓等，可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重后果［1］。肝纖維化是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，也是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)，嚴(yán)重影響了我國人民的身體健康和生命質(zhì)量［2］。中醫(yī)藥在改善肝纖維化癥狀、恢復(fù)肝功能、改善肝內(nèi)血液循環(huán)，甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫等方面的優(yōu)勢已成為中西醫(yī)共識［3］。

仙鶴草（Agrimoina pilosa Ledeb.，APL）為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草，又名脫力草、龍牙草、馬鞭草、石打穿等，最早見于《淮南草本》。仙鶴草味苦、澀、平，歸肺、肝、脾經(jīng)，是主要用于治療各種出血證、痢疾、虛癆等病的傳統(tǒng)中藥。仙鶴草的主要成分包括酚類、黃酮類、多糖類、三萜類、鞣質(zhì)、微量元素如Mg、K和P等物質(zhì)［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有較強(qiáng)的降血糖、抗腫瘤、抑菌和抗病毒活性［5-7］。本課題組在治療肝纖維化、肝硬化中應(yīng)用仙鶴草已有多年經(jīng)驗(yàn)，臨床療效顯著，并在前期研究中發(fā)現(xiàn)仙鶴草具有減輕肝纖維化的作用。

然而，目前對仙鶴草抗肝纖維化的作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的研究，對其作用機(jī)制的研究基本限于單個(gè)基因或單項(xiàng)病生機(jī)制，而中藥發(fā)揮作用具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等作用特點(diǎn)，因此仙鶴草在逆轉(zhuǎn)肝纖維化中的角色有待系統(tǒng)性的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)進(jìn)行分析，可為中藥的研究提供新思路［8］，故本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路多層次的網(wǎng)絡(luò)圖，對仙鶴草抗肝纖維化可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，并通過實(shí)驗(yàn)研究對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為后續(xù)的深入研究提供切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC（肝星狀細(xì)胞）-T6由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病毒性肝炎研究所彭明利教授贈送，細(xì)胞加入含10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 仙鶴草地上部分干燥全草（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：2002145）由重慶市中醫(yī)院肝病科主任醫(yī)師劉華寶鑒定為仙鶴草（Agrimoina pilosa Ledeb.）的干燥地上部分。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國，貨號：SH30809.01），優(yōu)級胎牛血清（PAN Biotech公司，德國，貨號：st30-3302p），蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)，貨號：p0013B），兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth Muscle Actin，α-SMA）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：8456），膠原1型α1（Collagen Type 1 Alpha 1，COL1A1）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：91144），兔抗大鼠p-AKT（蛋白激酶B）單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國，貨號：4058），兔抗大鼠AKT多克隆抗體（Cell Signaling，美國，貨號：9272），內(nèi)參GAPDH多克隆抗體（武漢三鷹生物，貨號：10494-1-AP），二抗（杭州聯(lián)科生物，貨號：70-GRT007），IumiQ通用型ECL發(fā)光試劑盒（上海圣爾生物，貨號：SB-WB012），CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（同仁化學(xué)公司，日本，貨號：CK04）。二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋貿(mào)易株式會社，日本，型號：MCO-15AC-SC型），垂直電泳轉(zhuǎn)移裝置（Bio-Rad公司，美國，型號：Mini-PROTEAN Tetra 1658001型），Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad公司，美國，型號：Mini Trans-Blot Module 1703935型），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：CFX96型），脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號：TS-2000A型），酶標(biāo)儀（Bio-Tek儀器有限公司，美國，型號：ELX800型），高速臺式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：TG16-WS型），-80 ℃低溫冰箱（海爾生物醫(yī)療股份有限公司，型號：DW-86L388J型）。

1.2 方法

1.2.1 仙鶴草化合物的收集與篩選 通過檢索臺灣中醫(yī)藥資料庫（TCM Database@Taiwan，http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw）、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在線數(shù)據(jù)庫TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid）、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//chemdb.sgst.cn/scdb/default.asp）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），收集整理仙鶴草化學(xué)成分，并經(jīng)TCMSP對各化合物進(jìn)行口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）分析（篩選標(biāo)準(zhǔn)：OB≥30%，DL≥0.18），或根據(jù)類藥五原則（Lipinski Rule of 5）進(jìn)行篩選，并檢索文獻(xiàn)中已報(bào)道的仙鶴草主要活性成分。

1.2.2 仙鶴草的靶點(diǎn)預(yù)測 使用ChemDraw Professional 16.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制化合物結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)換為*.mol2格式文件，導(dǎo)入PharmMapper在線平臺（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper），采用反向分子對接的方法進(jìn)行潛在靶點(diǎn)的預(yù)測。從有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取化合物Smiles格式，導(dǎo)入SWISS Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測潛在靶點(diǎn)。將獲得的結(jié)果輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）校正為官方名稱（Official Symbol）。對數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果匯總、去重，作為仙鶴草化合物的預(yù)測靶點(diǎn)以進(jìn)一步分析。

1.2.3 肝纖維化發(fā)病機(jī)制相關(guān)靶點(diǎn)的收集 從人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org）、療效靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、綜合性藥物數(shù)據(jù)庫（Drugbank，https：//www.drugbank.ca）、PolySearch2系統(tǒng)（http：//polysearch.cs.ualberta.ca）、人類基因數(shù)據(jù)庫（The Human Gene Database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）分別檢索關(guān)鍵詞“l(fā)iver fibrosis”或“hepatic fibrosis”和“cirrhosis”或“hepatocirrhosis”以尋找與肝纖維化相關(guān)的基因，利用韋恩圖將預(yù)測靶點(diǎn)和肝纖維化相關(guān)基因進(jìn)行比對，得到與仙鶴草和肝纖維化相關(guān)的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)。

1.2.4 通路注釋及“化合物-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，利用Graphpad Prism軟件作圖。將得到的化合物、靶點(diǎn)和信號通路導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape軟件中構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)分析，尋找關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和主要成分。

1.2.5 仙鶴草提取物的制備及其對HSC-T6活性和凋亡的影響 稱取500 g仙鶴草飲片，加入6倍質(zhì)量體積的蒸餾水，常溫浸泡30 min后煎煮，待煎煮液冷卻后過濾，重復(fù)3次，合并濾液進(jìn)行旋蒸濃縮，制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的仙鶴草提取物（APLE，主要含有仙鶴草酚、仙鶴草素、兒茶素、香豆素、咖啡酸等成分），使用時(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。取對數(shù)生長期的大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，接種于96孔板中，4×103個(gè)/孔，200 μL/孔，分別設(shè)空白對照組、APLE 0.5 μg/mL組、5 μg/mL組、50 μg/mL組、500 μg/mL組和5 mg/mL組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)上清液，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩10 min，全波長酶標(biāo)儀450 nm檢測吸光度。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-觀察組光密度450平均值/對照組光密度450平均值）×100%。

取對數(shù)生長期的HSC-T6接種于96孔板中，4×103個(gè)/孔，200 μL/孔，分別設(shè)空白對照組、APLE低濃度組（3 μg/mL）、APLE中濃度組（6 μg/mL）、APLE高濃度組（9 μg/mL）處理HSC-T6，48 h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測HSC-T6的凋亡情況。

1.2.6 仙鶴草提取物對血小板衍生生長因子-BB（Platelet-derived Growth FactorBB，PDGF-BB）刺激HSC-T6中α-SMA、COL1A1表達(dá)的影響 取不同濃度APLE作用于PDGF-BB刺激的HSC-T6，提取細(xì)胞總蛋白，與上樣緩沖液混勻、100 ℃水浴加熱5 min后冷卻備用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，1%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝膠自動成像儀顯影，記錄條帶灰度值，計(jì)算α-SMA和COL1A1蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激HSC-T6中AKT和p-AKT表達(dá)的影響 用0.5%小牛血清饑餓同步化過夜處理細(xì)胞后，對照組不加藥物處理，PDGF-BB組加入終濃度為10 ng/mL的PDGF-BB處理，APLE+PDGF-BB組先加入終濃度為10 μg/mL的APLE處理1 h后再加入終濃度為10 ng/mL的PDGF-BB處理，各組細(xì)胞孵育15 min后提取細(xì)胞總蛋白，與上樣緩沖液混勻、100 ℃水浴加熱5 min后冷卻備用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，1%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝膠自動成像儀顯影，記錄條帶灰度值，計(jì)算AKT和p-AKT蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 仙鶴草的活性成分分析 根據(jù)篩選規(guī)則，共獲得41個(gè)化合物。見表1。將篩選出的化合物導(dǎo)入PharmMapper、SWISS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，對結(jié)果進(jìn)行匯總、去重，最終獲得預(yù)測靶點(diǎn)共528個(gè)。與肝纖維化相關(guān)的基因進(jìn)行比對后獲得與肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)共72個(gè)。

2.2 關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)的GO和KEGG結(jié)果 對72個(gè)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能注釋分析，得到與肝纖維化關(guān)聯(lián)度較高（P<0.01）的GO富集分析結(jié)果。仙鶴草抗肝纖維化靶點(diǎn)主要富集的部分生物過程等。見圖1。對關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路注釋，得到與肝纖維化關(guān)聯(lián)程度較高（P<0.01）的部分KEGG富集分析結(jié)果。主要富集于Pathways in cancer、PI3K/AKT signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Insulin resistance和FoxO signaling pathway等信號通路。見圖2。

2.3 仙鶴草抗肝纖維化化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖的建立 關(guān)聯(lián)數(shù)目靠前5的化合物分別是（+）-Catechin-5-O-glucoside、Agrimol F、Agrimol G、Agrimol C、Gamma-Sitosterol。網(wǎng)絡(luò)圖中AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等基因的連接度排名靠前。見圖3。

2.4 仙鶴草提取物對HSC-T6活性和凋亡的影響

隨著提取物濃度的增加，HSC-T6的受抑制作用越明顯。見表2。與空白對照組或APLE低濃度組比較，APLE中濃度組和高濃度組的細(xì)胞凋亡率顯著升高。見表3。

2.5 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激后HSC-T6中α-SMA、COL1A1表達(dá)的影響 PDGF-BB處理后細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)明顯增加，加入APLE處理后，α-SMA和COL1A1蛋白的表達(dá)均降低。見圖4A。

2.6 仙鶴草提取物對PDGF-BB刺激后HSC-T6中AKT和p-AKT表達(dá)的影響 PDGF-BB處理后細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平明顯增加，APLE處理后PDGF-BB刺激的大鼠HSC-T6內(nèi)AKT磷酸化水平明顯受到抑制。見圖4B。

3 討論

肝纖維化相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“黃疸”“鼓脹”“積聚”等疾患早期，各種病因?qū)е碌牟±懋a(chǎn)物且具有共性病理特征。如《素問·平人氣象論篇》曰：“溺黃赤安臥者，黃疸，……目黃者曰黃疸。”《難經(jīng)·五十五難》云：“故積者，五臟所生；聚者，六腑所成也……故以是別知積聚也?！薄鹅`樞·水脹》言：“腹脹，身皆大，大與膚脹等也。色蒼黃，腹筋起，此其候也?！敝嗅t(yī)認(rèn)為多種因素綜合作用于機(jī)體，導(dǎo)致肝絡(luò)瘀滯不通、疏泄失職，肝體失卻柔潤，而發(fā)展為肝纖維化［9］。仙鶴草具有補(bǔ)虛扶正、化瘀散結(jié)的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草主要通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化等方式發(fā)揮作用［10-11］，而鮮有對其抗肝纖維化作用的研究。因此，本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究仙鶴草抗肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，并進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)中藥仙鶴草具有確切的抗肝纖維化作用，且本研究實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示仙鶴草提取物能夠降低α-SMA和COL1A1蛋白的表達(dá)，減少HSC-T6外基質(zhì)的沉積，抑制HSC-T6的活化，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確。研究表明仙鶴草可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，且本研究也驗(yàn)證了仙鶴草能促進(jìn)HSC-T6凋亡。從仙鶴草干燥部位中提取的均質(zhì)多糖能抑制骨肉瘤細(xì)胞株U-2 OS的活力并通過胱天蛋白酶-3依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這種抑制作用呈劑量依賴性；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明該均質(zhì)多糖成分對BALB/c裸鼠腫瘤的生長也有抑制作用［12］。張婷婷等［13］發(fā)現(xiàn)仙鶴草水提物能顯著抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖，促進(jìn)其凋亡，可通過上調(diào)線粒體凋亡通路中的B細(xì)胞淋巴瘤-2-相關(guān)X蛋白）、胱天蛋白酶-3表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，仙鶴草水提液能抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白表達(dá)及上調(diào)P53蛋白表達(dá)有關(guān)［14］。唐筱璐研究發(fā)現(xiàn)中藥仙鶴草水煎劑可以誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白和核因子κB（p65）的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的［15］。因此，結(jié)合本研究分析結(jié)果，推測仙鶴草可能是通過抑制HSC-T6增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

本研究對仙鶴草所含化合物及預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)、GO及信號通路分析，其中PI3K/AKT信號通路已被證實(shí)參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。調(diào)控PI3K/AKT信號通路蛋白的表達(dá)可抑制HSC增殖、減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成與沉積［16］。楊洋［17］發(fā)現(xiàn)復(fù)方半枝蓮顆粒可通過抑制MAPK/ERK-PI3K/AKT信號通路抑制HSC的活化、促進(jìn)HSC凋亡，從而減輕CCl4肝纖維化模型大鼠的纖維化程度。吳霜［18］發(fā)現(xiàn)狗蟻草乙酸乙酯部位能夠通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因抑制HSC-T6的增殖，改善CCl4所致肝纖維化小鼠肝臟炎癥及肝纖維化指標(biāo)。施鳳等［19］發(fā)現(xiàn)中藥單體熊果酸能阻斷PI3K/AKT、P38MAPK信號通路、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinasess，TIMP）-1、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）-1蛋白的表達(dá)并抑制HSC-T6增殖。因此，深入研究仙鶴草調(diào)控PI3K/AKT信號通路的具體分子機(jī)制可為進(jìn)一步開發(fā)仙鶴草的臨床應(yīng)用提供新的切入點(diǎn)。本研究實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示經(jīng)仙鶴草提取物處理后細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平明顯受到抑制，表明仙鶴草提取物能夠通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控HSC-T6的活性，發(fā)揮抗肝纖維化作用。此外，本研究分析發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度靠前的靶點(diǎn)多位于癌癥信號通路、癌癥中的蛋白聚糖和胰島素抵抗等信號通路上。慢性乙型肝炎、肝硬化患者多伴有葡萄糖代謝紊亂，該部分患者的纖維化指標(biāo)多與胰島素抵抗呈線性正相關(guān)［20］，而既往研究及臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)也表明仙鶴草具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、降低血糖、改善胰島素抵抗等作用［13-14，21］。由DAVID分析結(jié)果可知肝纖維化靶點(diǎn)主要富集的生物學(xué)功能為細(xì)胞代謝、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)和細(xì)胞對含氧化合物的反應(yīng)等，表明肝纖維化階段主要為炎癥及細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)代謝異常，同時(shí)伴隨有細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)炎癥的發(fā)展和癌癥信號通路的激活。因此，在臨床上應(yīng)用仙鶴草治療肝纖維化患者，不僅可起到減輕肝纖維化程度、阻止疾病進(jìn)展的作用，還可起到防癌、減毒的功效。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對仙鶴草可能的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測、分析，對這些靶點(diǎn)作用的生物學(xué)功能及信號通路進(jìn)行分析，通過構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖分析了仙鶴草多成分、多靶點(diǎn)與肝纖維化之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，通過實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了仙鶴草抗肝纖維化的部分藥理學(xué)作用，探索了可能的作用機(jī)制，對進(jìn)一步深入探討仙鶴草抗肝纖維化作用機(jī)制提供了重要線索。后續(xù)將通過動物模型對上述機(jī)制研究進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

利益沖突聲明：無。

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（2021-02-18收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：重大疑難疾病中西醫(yī)臨床協(xié)作試點(diǎn)項(xiàng)目（國中醫(yī)藥辦醫(yī)政發(fā)〔2018〕3號-重慶）；成都中醫(yī)藥大學(xué)第二批醫(yī)院專項(xiàng)“杏林學(xué)者”學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（YYZX20180040）；重慶市科研機(jī)構(gòu)績效激勵(lì)引導(dǎo)專項(xiàng)基金（jxyn2020-4）；重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2019jscx-dxwtBX0023）作者簡介：李麟（1988.06—），女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肝纖維化、肝癌中西醫(yī)治療，E-mail：lilin515626@126.com