甘肅省武威市荷蘭豆根腐病病原菌種類的鑒定

張敏，劉永剛，李惠霞，石明明，韓變，Boakye Thomas Afriyie，喬萬強(qiáng)，魏雪娟

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅省無公害農(nóng)藥工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

荷蘭豆（Pisum sativumvar.saccharatum）屬豆科蝶形花亞科豌豆屬，是豌豆的變種，屬于軟莢豌豆［1］，又稱食莢豌豆。荷蘭豆作為重要的蔬菜種類主要食用嫩莢或嫩莖尖，生育周期短，含有大量的維生素、微量元素、胡蘿卜素及果糖等成分［2］，具有較高的食用價(jià)值和應(yīng)用前景。武威市具有高海拔、無污染和光照充足等優(yōu)勢(shì)，荷蘭豆的年種植面積超過1 300 hm2［3］，該地區(qū)生產(chǎn)的荷蘭豆作為高原夏菜的重要品種供應(yīng)著我國(guó)南方的夏季蔬菜市場(chǎng)。

根腐病是豌豆的重要病害，一般造成減產(chǎn)10%～30%，重病地區(qū)可以減產(chǎn)60%，甚至絕產(chǎn)［4］。以前荷蘭豆根腐病在武威市偶有發(fā)生，但由于近年來大面積連作和抗病品種的缺乏，該病有加重的趨勢(shì)，制約了荷蘭豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對(duì)于荷蘭豆根腐病病原的研究尚未見報(bào)道，其病原是否與豌豆根腐病病原一致，尚不清楚。

據(jù)國(guó)外報(bào)道，豌豆根腐病病原有尖孢鐮孢菌Fusrium oxysporum［5］、燕麥鐮孢菌F.avenaceum與絲囊霉Aphanomyces euteiches［6］，其中以燕麥鐮孢菌引起的根腐病最為嚴(yán)重［7］。國(guó)內(nèi)報(bào)道的病原菌有幾十種，包括茄病鐮孢菌F.solani［8］、尖孢鐮孢菌F.oxysporum［9］、木賊鐮孢菌F.equiseti、根串珠霉Thielaviopsis basicola、腐霉Pythiumspp.、立枯絲核菌Rhizoctonia solani與豌豆絲囊霉A.euteiches［10］等病原，其中尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌與豌豆絲囊霉［10］為優(yōu)勢(shì)種類。甘肅省定西、榆中及平?jīng)龅鹊赝愣垢〔≡N類有多種［11-12］，其中以尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌與豌豆絲囊霉為優(yōu)勢(shì)病種類［13］，但在武威市尚缺乏相關(guān)研究。

武威市是甘肅省荷蘭豆主要種植區(qū)域［14］，但尚未見根腐病病原的研究和報(bào)道，其病原菌和優(yōu)勢(shì)種類尚不明確。針對(duì)這一現(xiàn)狀，本研究擬通過病原菌的分離和鑒定，以期明確武威市荷蘭豆根腐病病原及其優(yōu)勢(shì)種類，為該病害的及時(shí)有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：2020～2021年，根腐病樣采集自甘肅省武威市天祝藏族自治縣荷蘭豆種植地。致病性測(cè)定用荷蘭豆品種為珍綠。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L；水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）：瓊脂15 g、自來水1 L；康乃馨葉片水瓊脂培養(yǎng)基（carnation leaves agar，CLA）：瓊脂15 g、蒸餾水1 L，在培養(yǎng)皿倒入培養(yǎng)基前加入10～15片滅菌康乃馨葉片（3～4 mm2）。

試劑：真菌基因組DNA提取試劑盒，無水乙醇、葡萄糖、瓊脂糖，均購(gòu)于西安擎科生物技術(shù)有限公司（西安）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 荷蘭豆根腐病病原菌的分離純化 采用組織分離法分離荷蘭豆根腐病病原物。從植株病健交界處剪取約0.5 cm2病組織，用75%酒精浸30 s，無菌水沖洗3次后，用滅菌濾紙吸干，放置于PDA 上，于（25±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用單孢分離法純化病原菌：將孢子懸浮液稀釋至10倍鏡視野下有5～8個(gè)孢子，用1 mL無菌注射器將懸浮液轉(zhuǎn)移至WA培養(yǎng)基上，于（25±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，用無菌針頭挑取萌發(fā)的孢子，于WA培養(yǎng)基培養(yǎng)。待純化后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 荷蘭豆根腐病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將純化的菌株接種于PDA 與CLA 培養(yǎng)基上，置于（25±1）℃下全黑暗培養(yǎng)，7 d 后觀察其在PDA 培養(yǎng)基上的菌絲形狀和色素產(chǎn)生情況，并拍照記錄。在CLA 中放入滅菌的蓋玻片，15 d 后于顯微鏡下觀察CLA 培養(yǎng)基上分生孢子形態(tài)。形態(tài)學(xué)鑒定參考John.F Leslie 等［15］和王拱辰等［16］的方法，進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 荷蘭豆根腐菌株基因組DNA 的提取 采用真菌基因組DNA試劑盒提取病原菌DNA。PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后將菌絲刮下，在滅菌的研缽中加液氮研磨成粉末，具體試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。供試菌株的基因組DNA于-20 ℃保存，備用。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定 利用rDNA-ITS序列引物ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）與翻譯延長(zhǎng)因子TEF-1α 序列擴(kuò)增引物EF-1H（5'ATGGGTAAGGAGGACAAGAC3'）和EF-2T（5'GGAAGTACCAGTGATCATGTT3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成。

以供試菌株DNA為模板，用ITS1和ITS4引物對(duì)目標(biāo)菌株ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以dd H2O為陰性對(duì)照。擴(kuò)增體系為25 μL（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖凝膠上電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)目的片段后，將PCR產(chǎn)物送西安擎科生物技術(shù)有限公司（西安）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST 比對(duì)，下載相似度較高的序列，使用BioEdit 7.0.5 進(jìn)行比對(duì)分析，以Gibberella zeae（DQ459820）和Plectosphaerella cucumerina（EU594566）為外群，用MEGA 6.06以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定病原菌的種類。

表1 目的基因序列PCR反應(yīng)體系Table 1 DNA sequencing PCR reaction system

1.2.5 病原菌致病性測(cè)定 在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行致病性測(cè)定，試驗(yàn)采用根部刺傷接種法。5%的次氯酸鈉浸泡后50 ℃水浴鍋中燙種15 min，30 ℃的溫水浸種4 h，將種子平鋪在托盤中催芽7 d，種子露白后種入花盆，待荷蘭豆苗子長(zhǎng)至6 cm 左右進(jìn)行致病性試驗(yàn)。病原菌加無菌水洗脫孢子制成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，組培瓶中裝入50 mL孢子懸浮液，以無菌水為對(duì)照。無菌針頭刺傷荷蘭豆根部，孢子懸浮液中浸泡12 h后，移栽至小花盆。每盆種植1 株，共16 個(gè)處理，1 個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于人工氣候箱中培養(yǎng)（18～25 ℃、16/8 光周期、3 000 lx），1 周后觀察發(fā)病情況。參考張麗娟等［17］的荷蘭豆根腐分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)（表2），統(tǒng)計(jì)病原菌對(duì)荷蘭豆的發(fā)病率與病情指數(shù)。

表2 荷蘭豆根腐的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Disease classification standard of snow pea root rot

表3 16株鐮孢菌對(duì)荷蘭豆幼苗的致病性測(cè)定Table 3 Pathogenicity test of 16 strains of Fusarium spp.on snow pea seedlings

待植株發(fā)病后，按照1.2.1中的方法再次分離病原，觀察菌落、孢子形態(tài)，同時(shí)提取其DNA，PCR 擴(kuò)增后測(cè)序后比對(duì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 與SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷蘭豆根腐病癥狀描述

荷蘭豆根腐病在田間零星分布。癥狀表現(xiàn)為病株生長(zhǎng)緩慢，矮小，整個(gè)根系變褐，葉片發(fā)黃，越靠近地面葉片發(fā)黃愈加明顯。地上莖部表現(xiàn)枯黃，莖基部為紅褐色，根部逐漸變色，發(fā)病輕的植株仍可開花結(jié)莢，但籽粒不飽滿，嚴(yán)重植株地下莖及根部全部變成褐色至腐爛（圖1）。

圖1 武威市荷蘭豆根腐病田間癥狀Figure 1 Field symptoms of snow pea root rot in Wuwei City

2.2 荷蘭豆根腐病病原的分離結(jié)果

經(jīng)分離純化，獲得16株鐮孢菌。根據(jù)菌落形態(tài)和色素、菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)及孢子形態(tài)，將鐮孢菌菌株初步歸為2組。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

以菌株W2 為代表組，在PDA 平板上培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為38.2～38.5 mm。菌落分布均勻，菌絲白色，稀疏，光滑有隔膜、分支。在CLA培養(yǎng)基上大型分生孢子單瓶梗產(chǎn)孢，無色紡錘形或鐮刀型，較寬、粗壯、直或彎曲，多數(shù)3 個(gè)隔膜，大?。?4.15～33.08）μm×（3.51～5.27）μm。小型分生孢子呈假頭狀，卵圓形、橢圓形或腎形，有隔或無隔，大?。?.207～11.212）μm×（2.079～3.881）μm；厚垣孢子無色，球形單生，多在菌絲中間或者短的側(cè)枝上形成（圖2）。依據(jù)上述形態(tài)特征，將W2、W4、W6、W1、W7、W13、W11、W9、W13-1、W12、W10、W8-1 與W8歸為一組，初步鑒定為茄病鐮孢菌F.solani。

圖2 茄鐮孢菌W8培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征Figure 2 Cultural and morphological characteristics of Fusarium solani W8

以菌株W15 為代表組，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，菌落直徑為34.7～35.7 mm。菌落中間土黃色，邊緣紫紅色，有明顯的同心輪紋。在CLA 培養(yǎng)基上，單瓶梗產(chǎn)孢，大型分生孢子鰻魚形，細(xì)長(zhǎng)，頂細(xì)胞和足細(xì)胞明顯，多數(shù)5 個(gè)隔膜，大?。?7.31～68.51）×（3.14～4.19） μm。小型分生孢子呈卵形或棍棒形，0～1 隔，大?。?1.072～19.60）μm×（2.83～4.50） μm。依據(jù)上述形態(tài)特征將W15、W14與W14-1 歸為一組，初步將該組病菌鑒定為燕麥鐮孢菌F.avenaceum（圖3）。

圖3 燕麥鐮孢菌W14培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征Figure 3 Cultural and morphological characteristics of Fusarium avenaceum W14

2.4 代表菌株分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 rDNA-ITS 序列分析 采用通用引物ITS1/ITS4 擴(kuò)增后測(cè)序，經(jīng)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 比對(duì)和MEGA 系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結(jié)果表明，3個(gè)株菌的ITS序列聚為2支。第I組包括W1與W2 菌株，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一支，該類菌與茄鐮孢菌F.solani的ITS 序列聚為一支，同源性最近，遺傳距離為0，登錄號(hào)分別為MK110648、EU263916、MH855484和MW710931，將其鑒定為茄病鐮孢菌。第II 組代表菌株W15 與燕麥鐮孢菌F.avenaceumOK331346 和MW016665 的ITS 序列聚為一支，與燕麥鐮孢菌的遺傳近距離為0，相似性為100%，故將其鑒定為燕麥鐮孢菌（圖4）。

2.4.2 基于EF-1α 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 以3 株代表菌株的DNA為模板，采用TEF-1α基因特異性引物EF-1H/EF-2T 擴(kuò)增得到600 bp 左右的目的片段。經(jīng)NCBI中比對(duì)分析，代表菌株與燕麥鐮孢菌與茄病鐮孢菌的相似度高達(dá)99%以上。利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果相似。病原物聚為2類，第I類代表菌株W1和W2與茄鐮孢菌的TEF 序列聚為一個(gè)分支，同源性達(dá)99%，登錄號(hào)分別為MG857318 與MH822037，將其鑒定為茄病鐮孢菌。第II類代表菌株W15與燕麥鐮孢菌聚在一起，同源性為100%，登錄號(hào)分別為MK572748、MN958288、MK937121，與形態(tài)鑒定結(jié)果相符，將其鑒定為燕麥鐮孢菌（圖5）。

圖5 基于EF-1α序列構(gòu)建荷蘭豆根腐病2種病菌與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of two pathogens and other related strains based on the EF-1α sequences

2.5 荷蘭豆根腐致病性測(cè)定

致病性試驗(yàn)與根腐病田間癥狀基本一致（圖6）。從病株重新分離的病原菌經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，與接種的病原菌相同，符合柯赫氏法則。表明這16 株菌是荷蘭豆根腐致病菌，其病情指數(shù)為16.5～38，其中菌株W14-1病情指數(shù)最高為38，菌株W8病情指數(shù)最低為16.5。接種16 株病菌后，發(fā)病率為100%，而對(duì)照未發(fā)病。

圖6 16株鐮孢菌對(duì)荷蘭豆幼苗的致病性測(cè)定結(jié)果Figure 6 Results of pathogenicity test of 16 strains of Fusarium spp.on snow pea

3 討論

豌豆可分為軟莢豌豆和硬莢豌豆，硬莢豌豆即為豌豆，也叫糧用豌豆，以生產(chǎn)豌豆粒為主，但其嫩莢也可作蔬菜食用［1］。軟莢豌豆就是荷蘭豆，也叫食莢豌豆，主要以嫩莢作為蔬菜食用，一般不用于生產(chǎn)豌豆粒［18］。荷蘭豆與豌豆在外形上有明顯的差異，豌豆豆莢厚籽粒飽滿，顏色偏淺，豌豆花冠顏色多樣，多為紫色或紅色。荷蘭豆豆莢皮較薄，籽粒很小，外形呈扁平狀，豆莢顏色偏深綠，花冠顏色主要為白色，生育期較短，且收獲時(shí)間早于豌豆［19］。

目前，雖然有關(guān)豌豆根腐病病原的研究較多，但關(guān)于荷蘭豆根腐病病原種類尚未見報(bào)道。引起荷蘭豆根腐病的病原有多種，不同的地區(qū)病原和優(yōu)勢(shì)種類不盡相同。國(guó)外報(bào)道籽用豌豆根腐病病原有尖孢鐮孢菌［20］、燕麥鐮孢菌與絲囊霉Aphanomyces euteiches［21］，以燕麥鐮孢菌為重要病原。目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道有數(shù)十種病原菌可以導(dǎo)致豌豆根腐病的發(fā)生，茄病鐮孢菌F.solani和尖孢鐮孢菌F.oxysporum是北京地區(qū)的優(yōu)勢(shì)病原［9］，在青海茄病鐮孢菌和豌豆絲囊霉Aphanomyces euteiches具有較強(qiáng)致病力［10］，福建省豌豆根腐病由多種病原復(fù)合侵染，茄病鐮孢菌和絲囊霉致病力最強(qiáng)［22］。本研究在甘肅省武威市分離得到的荷蘭豆根腐病原為茄病鐮孢菌和燕麥鐮孢菌，以茄病鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)種類，這一結(jié)果與豌豆根腐病的病原不完全一致。甘肅省豌豆根腐病病原菌種類較多［23-24］，定西、榆中及平?jīng)龅貐^(qū)以茄病鐮孢菌、尖孢鐮孢菌與豌豆絲囊霉為豌豆根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌［12］。據(jù)孫順娣等［25］早期報(bào)道，甘肅省籽粒豌豆根腐病病原優(yōu)勢(shì)種類為茄病鐮孢菌，說明茄病鐮孢菌分布較廣，既是豌豆根腐病，也是荷蘭豆根腐病的優(yōu)勢(shì)病原。本研究發(fā)現(xiàn)燕麥鐮孢菌是引起武威市荷蘭豆根腐病病原之一，甘肅其他地區(qū)尚未見報(bào)道其是否為豌豆根腐病病原。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，雖然燕麥鐮孢菌分離頻率較低，為18.75%，但個(gè)別菌株如W14-1 致病力較強(qiáng)，病情指數(shù)最高，為38.0。武威市是甘肅省燕麥主產(chǎn)區(qū)，而燕麥鐮孢菌是燕麥根腐病的主要病原菌［26］，推測(cè)該地區(qū)燕麥和荷蘭豆輪作可能是造成這一結(jié)果的原因之一。關(guān)于該地區(qū)荷蘭豆根腐病發(fā)生危害和造成的損失，病害的發(fā)生規(guī)律，及其病原種類與種植制度的關(guān)系還需要進(jìn)一步調(diào)查研究。

鐮孢菌的形態(tài)復(fù)雜，在生長(zhǎng)過程中形態(tài)變異較大，形態(tài)鑒定很難準(zhǔn)確地將其鑒定到種［27］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，將內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、線粒體小亞基核糖體mtSSU、β微管蛋白和翻譯延長(zhǎng)因子TEF-1α 逐漸用于鐮孢菌的鑒定［28］，尤其以利用ITS 和TEF-1α 更為普遍［29］。TEF-1α 序列中EF-1α 位點(diǎn)核苷酸的替換率高，較ITS序列有較多的種間變異，對(duì)親緣關(guān)系較近的鐮孢菌有較高分辨力，是鐮孢菌屬真菌鑒定的有效方法［30］。目前，鐮孢菌的鑒定均采用在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，選擇特異基因片段對(duì)其進(jìn)行鑒定，但對(duì)于鐮孢菌親緣關(guān)系較近的種和復(fù)合種，單一片段很難準(zhǔn)確鑒定，還需挖掘更多的基因片段或多基因聯(lián)合才能更準(zhǔn)確地鑒定［27］。本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)鑒定，ITS和TEF序列聯(lián)合分析的方法，鑒定了甘肅省武威市荷蘭豆根腐病的病原。其他研究者［31］也利用ITS和TEF序列聯(lián)合分析，鑒定辣椒根腐病原菌。

4 結(jié)論

本研究明確了甘肅省武威市荷蘭豆根腐病病原為茄病鐮孢菌與燕麥鐮孢菌，其中茄病鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)種類，分離頻率81.25%；燕麥鐮孢菌分離頻率為18.75%。室內(nèi)致病性測(cè)定發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為16.5～38.0，其中菌株W14-1 病情指數(shù)最高為38.0，菌株W8病情指數(shù)最低為16.5。