水酶法提取羊油的工藝優(yōu)化及理化分析

王玉丹，馬玉瑩，韓玲，余群力，曹暉

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司，陜西 寶雞 721000）

我國羊肉產(chǎn)量不斷增加，羊脂產(chǎn)量也不斷增多［1］。羊油是指經(jīng)檢驗檢疫合格的羊經(jīng)過屠宰后，取新鮮完整的脂肪組織，經(jīng)過高溫?zé)捴?，得到的油脂?］。羊油作為食用油脂的重要組成部分，具有獨特的風(fēng)味和優(yōu)質(zhì)的功能性，比植物油更具有利用價值［3］。羊油中富有多種飽和脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)價值和熱量，特別適合供給寒冷地區(qū)的人們食用［4］。作為羊肉加工副產(chǎn)物，羊脂資源豐富，但因其加工利用率低，導(dǎo)致資源浪費、環(huán)境污染嚴(yán)重［5］。

因此，本試驗以羊板油為原料，采用水酶法提取羊油，探究提取條件對羊油提取率的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化羊油提取工藝條件，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜比較分析水酶法和傳統(tǒng)干法所得油脂中脂肪酸的組成并進(jìn)行品質(zhì)分析，以期為羊油的高效提取提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊脂，采自甘肅古浪中天羊業(yè)有限公司，選取年齡在1歲左右公羊的羊板油，去除外部結(jié)締組織，切碎，置于-18 ℃環(huán)境中；碘化鉀、碘、氫氧化鉀、硫代硫酸鈉、無水硫酸鈉、石油醚，均為分析純；中性蛋白酶，蛋白酶活力50 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司，均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

SSY-H型恒溫水浴鍋，北京京創(chuàng)泰寧偉業(yè)科技發(fā)展有限公司；JA2003 型電子天平，陜西德祥實驗設(shè)備有限公司；JP-020S型超聲波清洗器，亦為超聲技術(shù)有限公司；QL-866 漩渦振蕩器，紹興萬力儀器有限公司；GCMS-6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，廣東惠州市華高儀器設(shè)備有限公司。LHS-150SC 電熱恒溫干燥箱，武漢江宇制造有限公司；PHS-320酸度計，武漢吉爾德科技有限公司；TGL-16M 高速冷凍離心機，浙江納德科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊油水酶法提取工藝 羊脂→除雜→切碎→攪成糜狀→用蒸餾水調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)溫度→加酶→水浴酶解→離心（5 000 r/min，15 min）→上清液→羊油。

1.3.2 單因素試驗 依據(jù)預(yù)試驗，選擇中性蛋白酶，參考王慶玲［6］的方法，在料液比1∶1 、酶解時間2 h、溫度55 ℃的基礎(chǔ)條件下，保持其他條件不變，只改變其中1 個因素，設(shè)置酶添加量100、300、500、700、900 U/g、酶解時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、料液比2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g∶mL）、溫度50、55、60、65、70 ℃，以提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次。

1.3.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，以酶添加量（A）、時間（B）、料液比（C）和溫度（D）為自變量，提取率為因變量，設(shè)計四因素三水平試驗（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Response surface test factor level

1.3.4 羊油理化指標(biāo)測定 碘值：參考《GB/T 5532-2008 動植物油脂碘值的測定》；酸值：參考《GB/T 5009.229-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價的測定》；過氧化值：參考《GB/T 5009.227-2016動植物油脂 過氧化值測定》；皂化值：參考《GB/T 5534-2008動植物油脂 皂化值的測定》。

1.3.5 羊油脂肪酸組成分析

其中u=u(x,y,t)=vx，α,β,γ1,γ2,γ3是任意常數(shù)。最近馬文秀教授等人利用Hirota雙線性形式獲得了方程(1)的Lump形式解[17]。接下來我們將利用Hirota雙線性形式討論方程(1)的混合型孤子解。

1.3.5.1 脂肪的甲酯化 參考李濤等［12］的方法，并稍作修改。稱取0.5 g 樣品于具塞試管中，加入10 mol/L KOH 溶液0.35 mL，無水甲醇2.65 mL，55 ℃水浴皂化1.5 h，每30 min 振搖1 次。水浴結(jié)束后，取出試管，冷卻，加入12 mol/L 的H2SO4溶液0.29 mL，55 ℃水浴1.5 h進(jìn)行游離脂肪酸甲酯化，同時每30 min振搖1次。水浴結(jié)束后，取出試管冷卻，加入1.5 ml 正己烷，搖勻，轉(zhuǎn)至離心管，離心5 min（3 000 r/min），取上清液待測。采用GC-MC進(jìn)行脂肪酸組成分析。

1.3.5.2 脂肪酸測定的氣相色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件：PE-5MS 毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 m，0.25 μm），氮氣流速1.0 mL/min，汽化室的溫度為290 ℃ ；流速1.0 mL/min；采用程序升溫，起始溫度55 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到290 ℃，保持30 min；進(jìn)樣方式為分流，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：電離子源溫度 240 ℃，電離模式在電子沖擊70 eV 時使用，接口溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，傳輸線溫度210 ℃，掃描范圍（m/z） 30～550。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行處理，Origin 9.0軟件作圖，Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶添加量對提取率的影響 從圖1可知，酶添加量在0～500 U/g 之間，羊油提取率呈上升趨勢，當(dāng)為500 U/g達(dá)到最大值，為93.63%。之后隨著酶添加量進(jìn)一步增加，羊油的提取率無顯著變化（P＞0.05）。其原因是底物濃度一定，酶添加量增大，加快了酶與底物的反應(yīng)速度，油脂釋放增大［13］。酶添加量繼續(xù)增加，因底物濃度一定，酶與底物反應(yīng)速度減慢，酶解較徹底，故提取率無顯著變化（P＞0.05）?？紤]成本宜選擇500 U/g 作為酶添加量。

圖1 提取率與酶添加量之間的關(guān)系Figure 1 The relationship between extraction rate and enzyme concentration

2.1.2 酶解時間對提取率的影響 從圖2可知，酶解時間在0.5～2 h之間，羊油提取率呈上升趨勢，當(dāng)為2 h 達(dá)到最大值，為93.50%。之后隨著酶解時間進(jìn)一步延長，羊油的提取率無顯著變化（P＞0.05）。其原因是酶解時間增加，破壞了油脂細(xì)胞壁成分，油脂分子團暴露，益于油脂釋放［14］。酶解時間繼續(xù)增加，酶與底物充分反應(yīng)，油脂釋放完全，提取率無顯著變化（P＞0.05）。故選擇2 h作為酶解時間。

圖2 提取率與酶解時間之間的關(guān)系Figure 2 The relationship between extraction rate and enzymatic hydrolysis time

2.1.3 料液比對提取率的影響 從圖3可知，料液比在2∶1～1∶1 之間，羊油提取率呈上升趨勢，當(dāng)為1∶1 達(dá)到最大值，為92.90%。之后隨著料液比進(jìn)一步增大，羊油的提取率顯著下降（P＜0.05）。其原因是料液比過低，酶與底物濃度降低，影響酶反應(yīng)速率，提取率下降［8］。料液比繼續(xù)增大，因酶與底物碰撞幾率降低，不利于提油［15］。故選擇1∶1 作為料液比。

圖3 提取率與料液比之間的關(guān)系Figure 3 The relationship between oil extraction rate and solid - liquid ratio

2.1.4 溫度對提取率的影響 從圖4可知，溫度在50～55 ℃之間，羊油提取率呈上升趨勢，當(dāng)為55 ℃達(dá)到最大值，為93.37%。之后隨著溫度繼續(xù)增加，羊油的提取率顯著下降（P＜0.05）。其原因是溫度較低，未達(dá)到酶的最適溫度，油脂部分酶解。溫度繼續(xù)上升，因高溫破壞了蛋白結(jié)構(gòu)，使酶變性，故提取率降低［16］。從而選擇55 ℃作為提取溫度。

圖4 提取率與溫度之間的關(guān)系Figure 4 The relationship between extraction rate and temperature

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到水酶法提取羊油的二次多項回歸方程為：

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

由回歸模型方差分析（表3）可以看出，響應(yīng)模型的P＜0.000 1，F(xiàn)=25.20，失擬項P＝0.862 6＞0.05不顯著，該模型的擬合度較高。此外，R2為0.961 8，說明該模型能解釋96.18%的響應(yīng)值變化，只有很小的變量（3.82%）沒有得到合理的解釋，表明預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果具有很好的一致性。R2Adj為92.37%，說明試驗有92.37%受控制變化的因素影響，未控制因素對試驗結(jié)果的影響很小，以上結(jié)果表明該模型的擬合度良好，可用于羊油提取率的預(yù)測。由表3可知，一次項A對羊油提取率的影響較大，達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），B 對羊油提取率的影響較顯著（P＜0.05），而C、D對羊油提取率的影響不顯著（P＞0.05）。二次項A2、B2、D2對羊油提取率的影響極顯著（P＜0.01），C2對羊油提取率的影響不顯著（P＞0.05）。模型中的交互項AC、BD對羊油提取率的影響極顯著（P＜0.01），AB、AD、BC和CD對羊油提取率的影響不顯著（P＞0.05）。各因素對羊油提取率影響大小順序為：酶量（A）＞時間（B）＞料液比（C）＞溫度（D）。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 圖5是三維響應(yīng)面圖，顯示了4 個自變量與響應(yīng)值的影響。其說明2 個變量及其與另外2 個變量固定影響因變量的相互作用。等高線是響應(yīng)面在水平方向的投影，圓形等高線圖表示相應(yīng)變量間的相互作用可以忽略不計，而橢圓等高線圖表示相應(yīng)變量之間的顯著相互作用［17］。通過這些3D 響應(yīng)面及其各自的等高線圖，就能夠非常容易和方便地認(rèn)出2 個變量間的相互作用，和定位其最佳范圍。由圖5 可得知，各因素交互作用大小依次為：酶解時間與溫度＞酶添加量與料液比＞酶添加量與溫度＞酶解時間與料液比＞料液比與溫度＞酶添加量與酶解時間，與表3 中回歸分析結(jié)果相符。

圖5 四因素間交互作用響應(yīng)面圖Figure 5 Response surface diagram of interaction among four factors

2.3 最佳提取條件的確定及驗證

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出水酶法提取羊油的最優(yōu)組合為：酶添加量539.72 U/g，時間2.09 h，料液比1∶1，溫度55.53 ℃，預(yù)測得到的提取率為93.71%?？紤]實際生產(chǎn)的操作性，將羊油提取的工藝條件優(yōu)化為：酶添加量540 U/g，時間2.0 h，料液比1∶1，溫度56 ℃。對水酶法提取羊油的最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，3次平行試驗后，羊油提取率平均值為93.54%，這與回歸模型預(yù)測的值非常契合，從而驗證了模型的可靠性。因此，水酶法提取羊油的條件可靠且實用。

2.4 羊油理化指標(biāo)分析

采用傳統(tǒng)干法和水酶法提取羊油，對比不同的提取方法對羊油品質(zhì)及提油率的影響。由表4可知，水酶法提取羊油的提油率最高，為93.54%，顯著高于傳統(tǒng)干法（P＜0.05），相較于傳統(tǒng)干法（81.45%），提高了12.9%。這是由于在酶的作用下，油脂更容易滲出。水酶法提取羊油的酸值顯著低于傳統(tǒng)干法（P＜0.05），可能由于在水酶法提取羊油的過程中，堿中和了油脂中的部分游離脂肪酸［18］，使油脂酸值較低。碘值是衡量油脂不飽和程度的重要指標(biāo)，油脂中的不飽和脂肪酸含量越高，碘值就越大。相比于傳統(tǒng)干法提取，水酶法的碘值顯著較高（P＜0.05），說明水酶法提取工藝可以使油脂中存在的不飽和脂肪酸較好的保留下來；水酶法提取羊油的皂化值和過氧化值顯著低于傳統(tǒng)干法（P＜0.05），可能是由于傳統(tǒng)干法在提取過程中溫度較高，水酶法提取的溫度較低，過程較溫和，而高溫會加速油脂的氧化酸敗，使油脂過氧化值升高，品質(zhì)下降。綜合考慮羊油提油率與品質(zhì)，水酶法提取過程安全有效，可以有效的提高羊油的利用率，提取的羊油品質(zhì)較好。

表4 傳統(tǒng)干法和水酶法對羊油品質(zhì)和提取率的影響Table 4 Effects of traditional dry method and aqueous enzymatic method on the quality and extraction rate of sheep oil

2.5 羊油脂肪酸組成分析

為了解水酶法提取羊油的脂肪酸組成，在樣品甲酯化后使用GC-MC分析。結(jié)果示于表5中。羊油的水酶法中共含有17種脂肪酸，其中SFA占57.47%，UFA占42.53%。主要的SFA是C18∶0和C16∶0，占總脂肪酸的24.83%和16.52%，因此羊脂質(zhì)地很堅硬［19］；主要的UFA 是C18∶1n9t，占總脂肪酸的32.43%，這與李濤等人［12］的研究結(jié)果一致。在結(jié)果中，羊油的水酶法和干法中的脂肪酸無明顯差異。表明水酶法處理對羊油脂肪酸組成無明顯影響。

表5 羊油中脂肪酸組成及含量Table 5 Composition and content of fatty acids in sheep oil

3 討論

水酶法提取羊油的工藝，受到酶添加量、酶解時間、料液比、溫度等條件的影響，在規(guī)定條件范圍內(nèi)，羊油提取率隨提取因素的變化而改變。本研究中，羊油提取效率隨著酶添加量的提高而出現(xiàn)了先增高后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢，這與賈俊強等［20］研究的中性蛋白酶水解蠶蛹油結(jié)果類似，很可能是在含量相當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白酶與底物充分反應(yīng)，在相應(yīng)時間內(nèi)，提取率顯著增加；酶添加量過量時，過量蛋白酶與底物無法結(jié)合，可能形成抑制效應(yīng)［21］。酶與底物的接觸時間影響著酶的活性，影響反應(yīng)程度［22］。試驗中隨著酶解時間的不斷增加，提取率呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢，這與劉倩霞等［23］研究的2種蛋白酶酶解曲拉干酪素條件優(yōu)化的結(jié)果相似，可能是因為在蛋白酶解初期，由于酶切位點較多，有利于水解反應(yīng)的進(jìn)行，使提取率上升趨勢明顯，而隨著酶解時間的不斷增加，暴露的酶切位點相對較少，酶與底物不能有效地結(jié)合，提取率趨于平緩［24］。試驗中料液比不斷增大，提取率呈先升高后下降的趨勢，可能是由于料液比較大時，酶與底物碰撞幾率降低，不利于提油［18］，提取率下降；料液比過低，酶與底物的濃度降低，影響酶反應(yīng)速率，提取率下降［8］。由于酶屬于生物活性物質(zhì)，其構(gòu)象和活性取決于提取溫度［17］。試驗中溫度的升高使提取率先升高后下降，此結(jié)果與王慶玲等［5］研究的豬油的水酶法提取工藝結(jié)果相似，可能是溫度上升，加快了酶促反應(yīng)的速率，過高的溫度，使酶變性失活，導(dǎo)致酶反應(yīng)速率減慢［5］。

油脂理化性質(zhì)和脂肪酸組成反映了油脂的品質(zhì)。由于酶、熱和微生物的作用，油脂會發(fā)生水解，生成游離脂肪酸，影響油脂的質(zhì)量［25］。油脂中游離脂肪酸含量的多少，是油脂品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，而酸價是脂肪中游離脂肪酸含量的重要標(biāo)志，可作為油脂變質(zhì)程度的指標(biāo)［26-27］。在本研究中，水酶法提取的羊油酸值顯著低于傳統(tǒng)干法（P＜0.05），可能由于在水酶法提取羊油的過程中，堿中和了油脂中的部分游離脂肪酸［18］，使油脂酸值較低。過氧化值是油脂和脂肪酸等被氧化程度的一種指標(biāo)，以 1 kg樣品中活性氧的毫摩爾數(shù)表示，也可用油脂過氧化物從碘化鉀中析出的碘占試樣的百分比來表示。水酶法提取的羊油過氧化值優(yōu)于傳統(tǒng)干法，可能是水酶法提取的過程溫和，傳統(tǒng)干法提取溫度較高，高溫加速油脂的氧化酸敗，使油脂過氧化值升高，說明水酶法提取的油脂氧化程度低，這與程倩［28］研究的水酶法提取葵花籽仁油工藝優(yōu)化的結(jié)果相似。碘值是衡量油脂不飽和程度的重要指標(biāo)，油脂中的不飽和脂肪酸含量越高，碘值就越大。與傳統(tǒng)干法相比，水酶法的碘值顯著較高，說明水酶法提取工藝可以使油脂中存在的不飽和脂肪酸較好的保留下來。在本研究中，水酶法與干法提取的羊油中脂肪酸組成與含量基本一致，此結(jié)果與王慶玲等［6］研究的豬油水酶法提取工藝結(jié)果相似，表明運用水酶法提取羊油的過程安全，提油率高，羊油的脂肪酸組成未受到影響。由此可見，水酶法提取羊油的提取率高，油脂品質(zhì)較好。

4 結(jié)論

本研究采用水酶法提取羊油，在單因素和響應(yīng)面試驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到最佳提取條件為酶添加量540 U/g，酶解時間2 h，料液比1∶1，溫度56 ℃。在此條件下，羊油提取率為93.54%，顯著高于傳統(tǒng)干法。且水酶法所得羊油理化指標(biāo)優(yōu)于傳統(tǒng)干法，脂肪酸組成與含量基本一致，均主要含有油酸、硬脂酸和棕櫚酸等。水酶法作為提取羊油的新方式，條件溫和，提取率高，品質(zhì)較好，對羊油的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。