羅哌卡因?qū)侨饬黾毎鲋?、侵襲及雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導(dǎo)因子1α信號通路的影響

張素冰,高 輝,趙濱濱,張丹琦

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉手術(shù)科,黑龍江 哈爾濱 150040)

骨肉瘤是一種惡性梭形細胞腫瘤,具有不成熟的骨樣組織,好發(fā)于青少年,疾病引發(fā)的疼痛癥狀會被誤認(rèn)為是成長引起的,在性別發(fā)病率上男性遠多于女性[1-2]。骨肉瘤具有惡性程度強、侵襲、轉(zhuǎn)移快且早的特點,具有較高致死率,患者預(yù)后差,即使手術(shù)切除后仍有復(fù)發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險,長期生存率無顯著提高[3]。因此,治療藥物的進一步篩選及相關(guān)信號通路機制的探索仍是臨床研究的熱點。羅哌卡因是臨床麻醉、鎮(zhèn)痛類藥物,屬于左旋長效酰胺類藥物。研究[4-5]認(rèn)為手術(shù)途中使用麻醉藥物對降低乳腺癌、食管鱗癌等癌癥復(fù)發(fā)有幫助。朱婧等[6]研究認(rèn)為羅哌卡因可降低胃癌細胞(MGC-803)增殖并阻滯細胞周期。有關(guān)羅哌卡因?qū)侨饬龅淖饔眠€未研究,羅哌卡因是否會對骨肉瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移有影響?本研究將對此展開研究。雷帕霉素靶蛋白(Rapamycin target of rapamycin,mTOR)是骨肉瘤經(jīng)典致癌通路之一,其激活可調(diào)控下游靶基因參與對腫瘤進程的影響[7]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)在胃癌[8]、肺癌[9]等多種腫瘤中存在高表達,腫瘤細胞惡性增殖會導(dǎo)致體內(nèi)氧缺失,此環(huán)境下促使HIF-1α水平升高,為腫瘤細胞提供生長環(huán)境,促進腫瘤的轉(zhuǎn)移,其亦是mTOR的關(guān)鍵下游因子[10]?；诖?本研究探討羅哌卡因?qū)侨饬黾毎挠绊懠捌渑cmTOR/HIF-1α通路的關(guān)系,為骨肉瘤治療的藥物及通路研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要細胞與試劑 MG63細胞(CL-0157)購自普諾賽公司;羅帕卡因(T54853)購自上海源葉公司;Ki-67(ab21700)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2,ab92536)、MMP-9(ab283575)、mTOR(ab32028)、HIF-1α(ab51608)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,ab9485)抗體、羊抗兔IgG二抗(ab6721)購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及MG63細胞增殖抑制率檢測:常規(guī)培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞并傳代處理。取對數(shù)生長期的MG63細胞,以每孔2×104個細胞數(shù)的密度在96孔板中接種,分別加入終濃度為0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml的羅哌卡因溶液[6](DMEM培養(yǎng)基稀釋)。48 h后,每孔加入100 μl CCK-8試劑(避免氣泡生成)。孵育2 h后,測定450 nm處吸光值,檢測MG63細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 MG63細胞分組:將對數(shù)期MG63細胞分為對照組、羅哌卡因低濃度組、羅哌卡因中濃度組、羅哌卡因高濃度組。對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)。羅哌卡因低、中、高濃度組分別在培養(yǎng)基中加入50、100、200 μg/ml濃度的羅哌卡因。

1.2.3 MG63細胞平板克隆率檢測:收集1.2.2中四組MG63細胞,按照每孔200個細胞密度在24孔板中接種,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d,注意及時更換培養(yǎng)液(每3 d換液1次)。培養(yǎng)結(jié)束后對細胞固定(多聚甲醛)并染色(1%結(jié)晶紫),PBS沖洗干凈后拍照?？寺⌒纬陕?克隆細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 MG63細胞Ki-67表達檢測:將適量MG63細胞在24孔板中接種,PBS洗滌3次,多聚甲醛(4%)固定細胞,過氧化氫浸泡10 min,PBS洗滌后封閉,加入稀釋的Ki-67抗體(PBS稀釋,1∶100)孵育過夜。洗滌后加入山羊抗鼠二抗,37 ℃孵育1 h,PBS溶液洗滌,加入DAB顯色,蘇木精復(fù)染。經(jīng)分化、透明、封片后,顯微鏡下觀察染色情況。選取5個獨立視野,計數(shù)陽性細胞數(shù)(黃褐色)。Ki-67陽性率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 MG63細胞侵襲、遷移能力檢測:侵襲實驗中,將Matrigel膠加入Transwell小室,37 ℃條件下進行3 h固化,并加入5×104個MG63細胞。將500 μl DMEM培養(yǎng)基添加到下室中,培養(yǎng)箱孵育24 h。多聚甲醛(4%)固定,結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗滌2次,拍照并觀察MG63細胞侵襲數(shù)目。遷移實驗中,Transwell小室中不加入Matrigel膠,其余操作同侵襲實驗。

1.2.6 MG63細胞MMP-2、MMP-9、mTOR、HIF-1α蛋白表達檢測:收集各組MG63細胞,按照每孔3×106個細胞數(shù)量接種于24孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后采用BCA蛋白試劑盒對蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移至PVDF上(濕轉(zhuǎn)法),封閉1 h,添加MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、HIF-1α(1∶1000)、GAPDH(內(nèi)參,1∶5000),孵育過夜。洗滌后添加羊抗兔IgG(1∶5000)2 h。ECL顯影,測定蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 羅哌卡因?qū)侨饬黾毎鲋车挠绊?0、2.5、5、12、25、50、100、200、400 μg/ml濃度的羅哌卡因作用于MG63細胞后,對MG63細胞增殖抑制情況不同。當(dāng)羅哌卡因濃度≤25 μg/ml時,MG63細胞增殖抑制率均<90%;當(dāng)羅哌卡因濃度≥50 μg/ml時,MG63細胞增殖抑制率顯著升高,且隨羅哌卡因濃度升高,增殖抑制率呈上升趨勢(P<0.05);當(dāng)羅哌卡因濃度為100 μg/ml時,細胞增殖抑制率接近50%。因此,本研究分別選取50、100、200 μg/ml的羅哌卡因作為后續(xù)處理的低、中、高濃度。

2.2 羅哌卡因?qū)G63細胞克隆形成率的影響 見圖1。對照組及羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞克隆形成率依次為(44.32±6.33)%、(31.53±4.50)%、(22.02±3.14)%和(13.52±1.93)%。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞克隆形成率降低(P<0.05)。

圖1 四組MG63細胞平板克隆實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色)

2.3 羅哌卡因?qū)i-67的影響 見圖2。對照組及羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率依次為(46.72±7.72)%、(25.43±4.25)%、(17.24±3.05)%和(8.16±1.36)%。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組Ki-67陽性率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞Ki-67陽性率降低(P<0.05)。

圖2 四組MG63細胞Ki-67免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.4 羅哌卡因?qū)G63細胞侵襲和遷移的影響 見表1(圖3)。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)降低(P<0.05)。

表1 四組MG63細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)比較(個)

圖3 四組MG63細胞Transwell實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.5 羅哌卡因?qū)G63細胞侵襲相關(guān)蛋白的影響 見表2。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達降低(均P<0.05)。

表2 四組MG63細胞MMP-2和MMP-9表達比較

2.6 羅哌卡因?qū)G63細胞mTOR/HIF-1α通路的影響 見表3。與對照組比較,羅哌卡因低、中、高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因低濃度組比較,羅哌卡因中、高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。與羅哌卡因中濃度組比較,羅哌卡因高濃度組MG63細胞mTOR和HIF-1α蛋白表達降低(均P<0.05)。

表3 四組MG63細胞mTOR/HIF-1α通路蛋白比較

3 討 論

骨肉瘤是嚴(yán)重威脅青少年生存期與生存質(zhì)量的骨性癌癥[11]。手術(shù)切除與化療聯(lián)合治療是骨肉瘤的常規(guī)治療手段,實現(xiàn)保肢抑癌作用。麻醉藥物可發(fā)揮對癌細胞的抑制作用已經(jīng)過大量實驗驗證。例如,2、10、50 ng/ml舒芬太尼均可抑制宮頸癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移[12];丙泊酚可通過對miR-133a的調(diào)控參與對乳腺癌細胞增殖與侵襲的抑制[13];異丙酚抑制Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌細胞增殖[14]。

羅哌卡因是氨基酰類麻醉藥,在臨床中主要用分娩、術(shù)后鎮(zhèn)痛[15-16]。除鎮(zhèn)痛作用外,羅哌卡因也可發(fā)揮對癌細胞的抑制作用。陳穎等[17]研究顯示,羅哌卡因可通過抑制癌細胞線粒體呼吸作用,劑量依賴性地抑制人甲狀腺癌細胞增殖,并誘導(dǎo)甲狀腺癌細胞凋亡。張摯等[18]研究顯示,羅哌卡因可作用于乳腺癌腫瘤微環(huán)境,發(fā)揮對乳腺癌轉(zhuǎn)歸的影響,提高乳腺癌患者的生存時間。本研究選取0～400 μg/ml濃度的羅哌卡因作用于MG63細胞,發(fā)現(xiàn)0～25 μg/ml的羅哌卡因不對MG63細胞產(chǎn)生明顯增殖抑制作用,當(dāng)羅哌卡因濃度高于25 μg/ml時,MG63細胞的增殖抑制率逐漸升高,即一定濃度的羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖,因羅哌卡因濃度為100 μg/ml時細胞增殖抑制率接近50%,因此選取50、100、200 μg/ml的羅哌卡因作為研究濃度。本研究顯示,低、中、高濃度的羅哌卡因均可降低MG63細胞克隆形成率,抑制MG63細胞的增殖潛力,影響MG63細胞對生存環(huán)境的適應(yīng)性。骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移性是患者術(shù)后易復(fù)發(fā)的關(guān)鍵原因,其高轉(zhuǎn)移性與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有關(guān),因此治療藥物的抑制侵襲轉(zhuǎn)移能力是重要特征之一,本研究中經(jīng)低、中、高濃度的羅哌卡因處理后,MG63細胞的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均降低,即羅哌卡因具有抑制MG63細胞轉(zhuǎn)移的能力。Ki-67是增殖相關(guān)抗原,與細胞的有絲分裂有關(guān),在腫瘤的惡性增殖中不可或缺,本研究通過免疫組化法檢測不同組別間Ki-67表達情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)羅哌卡因處理后MG63細胞Ki-67陽性率降低,進一步說明了羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖。MMP-2和MMP-9是重要的腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移蛋白,可降解細胞外基質(zhì),破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障,在腫瘤浸潤中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中羅哌卡因處理后MG63細胞MMP-2和MMP-9蛋白水平顯著下降,提示羅哌卡因可降低MG63細胞的侵襲能力。

腫瘤細胞的惡性增殖往往伴隨環(huán)境內(nèi)氧缺失,氧缺失會導(dǎo)致HIF-1α水平升高,因此胃癌、肺癌等多種腫瘤組織中可見HIF-1α水平升高。mTOR是HIF-1α的關(guān)鍵上游,參與多種癌癥的經(jīng)典致癌途徑,可整合多種細胞外信號刺激,從而調(diào)節(jié)細胞功能,骨肉瘤中可見mTOR通路的激活。王華磊等[19]研究認(rèn)為,雷帕霉素通過mTOR/HIF-1α通路調(diào)控人骨肉瘤細胞凋亡。Rathore等[20]認(rèn)為,靶向mTOR是治療骨肉瘤的新方法。本研究中,經(jīng)羅哌卡因處理后,MG63細胞mTOR和HIF-1α水平均降低,提示羅哌卡因可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。

綜上所述,羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,并可抑制mTOR/HIF-1α通路的激活。但本研究僅探討了羅哌卡因與mTOR/HIF-1α的關(guān)系,羅哌卡因是否能通過mTOR/HIF-1α參與對MG63細胞的調(diào)控仍未可知,下一步將對此展開探討。