肉蓯蓉苯乙醇苷調(diào)控GSK3β/Nrf2/ARE通路減輕腦中動脈梗死大鼠氧化應(yīng)激損傷實驗研究

李 亮,蔣曉帆,李 俠,張 嬋,余 良

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院,陜西 西安 710032)

近年來,腦血管疾病患病率逐年上升,已成為全球60歲以上人口死亡的第二大原因,其中缺血性腦卒中約占60%～80%[1]。目前臨床尚缺乏有效的治療手段,患者發(fā)病后常遺留神經(jīng)功能障礙,對其身心健康和生活質(zhì)量造成嚴重影響[2]。氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血性腦病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,腦組織缺血缺氧后,局部自由基顯著增多,而抗氧化酶的功能降低,引起腦血管和神經(jīng)細胞損傷,此時通過調(diào)動機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除增多的自由基可有效抑制腦組織損傷進展[3]。肉蓯蓉苯乙醇苷是從肉蓯蓉中提取的一類苯乙醇苷類化合物,具有較強的抗氧化活性,研究[4]發(fā)現(xiàn)其可通過抑制低氧下腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)修復(fù)腦損傷。研究[5-6]顯示,糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)/核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)信號通路與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,通過靶向調(diào)節(jié)該信號通路可有效減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷?；诖?本實驗通過誘導(dǎo)腦中動脈梗死(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型探究肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)MCAO大鼠氧化損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠100只,購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[合格證編號:SCKX(陜)2019-001號],體重(200±20)g。實驗前1周于SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng),溫度保持(23±3)℃,相對濕度40%～70%。

1.2 主要試劑 肉蓯蓉苯乙醇苷(批號:20210701,九江華漢生物科技有限公司);尼莫地平(批號:220814,山東新華制藥公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑(北京索萊寶科技公司);大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技公司);Nissl染色試劑盒(上海生工生物工程公司);抗-GSK3β、Nrf2、血紅素氧化酶-1(HO-1)、GAPDH(Santa Crutz公司);GSK3β、Nrf2、HO-1、GAPDH基因引物(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與干預(yù):動物稱重后按體重高低依次分籠,隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組和肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組,每組20只。通過大腦中動脈線栓法制備MCAO模型[7]:大鼠腹腔注射水合氯醛(按400 mg/kg)麻醉后,于頸正中部做一切口,并沿切口分離暴露左頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈,結(jié)扎頸總、頸外動脈,在頸總動脈近分叉處放置一根手術(shù)線,隨后于分叉處剪一切口,從切口處插入線栓以阻斷中動脈血供。線栓于頸總動脈插入頸內(nèi)動脈,前進約18～20 mm可感到阻力,隨后逐層縫合切口,假手術(shù)組僅分離上述血管而不予結(jié)扎。缺血再灌2 h后,陽性對照組給予尼莫地平(12 mg/kg);肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組分別給予肉蓯蓉苯乙醇苷150、300 mg/kg,每日灌胃1次,共14 d;假手術(shù)組及模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.2 神經(jīng)功能評定:分別于造模及治療結(jié)束后評價大鼠神經(jīng)功能缺損情況[8]。1～4分為實驗納入標準,將不符合模型評定標準的大鼠剔除。0分指活動無異常,未見肢體神經(jīng)功能損傷表現(xiàn);1分指肢體神經(jīng)功能輕微缺損,提尾懸吊時不能充分伸展缺血側(cè)前肢;2分指肢體神經(jīng)功能中度缺損,爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈、追尾;3分指肢體神經(jīng)功能重度缺損,行走時向?qū)?cè)傾斜;4分指意識喪失,不能自發(fā)行走。

1.3.3 腦含水量檢測:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,采用電子分析天平立即稱取腦組織濕重,之后放入60 ℃烘箱烘烤72 h,再次稱重,反復(fù)稱至2次重量差<0.3 mg,得到腦組織干重[9]。根據(jù)干濕重之比,按(濕重-干重)/濕重×100%計算腦含水量。

1.3.4 腦梗死占比檢測:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,將腦組織于-20 ℃速凍20 min左右取出,放于切片板上間隔2 mm做連續(xù)冠狀切片,共計5片。切片放入2% TTC溶液,避光均勻染色30 min(37 ℃)。取出組織,PBS沖洗3次后用4%多聚甲醛固定24 h。正常組織染色后為紅色,蒼白及未著色區(qū)即為腦梗死區(qū)。染色結(jié)束后,整齊排列各組大腦切片并拍照,采用Image Pro 軟件處理圖像,測算每個腦片梗死面積。腦梗死占比=腦梗死面積/腦切片面積×100%。

1.3.5 海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后,快速開胸暴露心臟,取輸液針從左心進針,使針尖穿入左心室,隨即找準主動脈弓,穿入主動脈,緩慢注射0.9%氯化鈉溶液后灌注PBS固定液(含4%多聚甲醛),1 h后斷頭取腦并于4%多聚甲醛中4 ℃固定72 h。分離海馬組織石蠟切片(5 μm厚)并脫蠟,乙醇梯度脫水,行Nissl染色后封片,顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.6 血清MDA、SOD、GSH-Px水平檢測:各組大鼠于治療結(jié)束后經(jīng)腹主動脈采血,3000 r/min離心分離血清,分裝保存于-20 ℃冰箱備用。采用ELISA法檢測血清中SOD、GSH-Px、MDA水平。血清臨用前置于室溫平衡1 h,3000 r/min 離心20 min后吸取上清,分別設(shè)空白孔、標準孔、樣品孔,樣品孔加樣品稀釋劑40 μl、血清樣品10 μl及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗100 μl,37 ℃恒溫箱溫育30 min。經(jīng)洗滌后加入顯色液,37 ℃避光溫育15 min,加終止液50 μl,酶標檢測儀于450 nm處測定各孔溶液OD值,按標準孔OD值繪制標準曲線,代入各樣本OD值得出SOD、GSH-Px、MDA的水平。

1.3.7 海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白水平測定:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,取海馬組織,加入裂解液于冰上裂解30 min。將裂解液移至離心管,4 ℃下以12000 r/min離心5 min提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),電泳、轉(zhuǎn)膜后加入5% BSA于搖床上室溫封閉2 h,加入稀釋好的一抗(1∶1000)4 ℃過夜。一抗回收后TBST洗滌5～10 min,吸盡洗滌液后立即加入稀釋好的二抗(1∶5000),室溫孵育1 h,TBST洗滌5～10 min。ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光后用Image J軟件分別計算GSK3β、Nrf2、HO-1與GAPDH的灰度值比值,得出蛋白相對表達量。

1.3.8 海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA水平測定:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦。采用TRIzol法提取RNA:取海馬組織100 mg,加入TRIzol試劑1 ml,勻漿器研磨后裂解 10 min,提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄,再按PCR試劑盒進行擴增,具體參數(shù):95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,擴增40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析,以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 五組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量比較 見表2。假手術(shù)組未見肢體神經(jīng)功能損傷。模型組神經(jīng)功能評分及腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高(均P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組大鼠經(jīng)治療后神經(jīng)功能缺損情況顯著改善,神經(jīng)行為學(xué)評分、腦組織含水量較模型組明顯降低(均P<0.05)。

表2 五組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較

2.2 五組大鼠腦梗死占比比較 見圖1。假手術(shù)組腦組織未見梗死灶,模型組、陽性對照組及肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組腦組織出現(xiàn)不同程度蒼白色損傷灶。模型組腦梗死占比較假手術(shù)組明顯增多(P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組腦梗死占比明顯縮小(均P<0.05)。

注：A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.3 五組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)變化 見圖2。假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細胞核清晰,尼氏小體豐富,呈藍色,細胞核周圍排列整齊。模型組細胞損傷明顯,腫脹變性,結(jié)構(gòu)紊亂,尼氏小體數(shù)量減少。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組給藥治療后神經(jīng)細胞形態(tài)改善,尼氏小體數(shù)量增多,細胞排列逐漸恢復(fù)規(guī)律。

注:A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組

注：A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.4 五組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比較 見表3。模型組與假手術(shù)組比較,血清SOD、GSH-Px活性明顯降低,MDA含量顯著增高(均P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組血清SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量下降(均P<0.05)。

表3 五組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比較

2.5 五組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白表達比較 見圖 3。模型組與假手術(shù)組比較, GSK3β蛋白表達增多,Nrf2、HO-1蛋白表達減少(均P<0.05)。肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組海馬組織GSK3β蛋白表達較模型組下調(diào),Nrf2、HO-1蛋白表達上調(diào)(均P<0.05)。

2.6 各組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表達比較 見表4。模型組與假手術(shù)組比較,海馬組織GSK3β mRNA表達明顯增多,Nrf2、HO-1 mRNA表達顯著減少(均P<0.05)。肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組海馬組織GSK3β mRNA表達較模型組顯著減少,Nrf2、HO-1 mRNA表達則明顯增多(均P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表達比較

3 討 論

缺血性腦卒中病理過程較為復(fù)雜,發(fā)病機制涉及免疫炎癥、自由基損傷、興奮性氨基酸毒性等多個環(huán)節(jié)[10]。大腦是對缺氧最為敏感的器官,缺血、缺氧狀態(tài)可對腦功能造成極大損害。以往研究[11]表明,氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧在腦缺血后神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,有效激活機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)是防治腦缺血損傷的一個重要策略。

Nrf2是調(diào)節(jié)機體多種抗氧化物質(zhì)和保護性酶類表達的核心轉(zhuǎn)錄因子[12]。在機體正常狀況下,其與細胞質(zhì)接頭蛋白(Keap-1)結(jié)合于細胞漿而保持非活性狀態(tài),機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)可促使Nrf2與Keap-1解偶連,Nrf2轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)與ARE特異性結(jié)合,并促進其下游HO-1等抗氧化蛋白的表達[13]。早期研究[14]認為,Nrf2表達水平主要受Keap-1的調(diào)控。而近年研究[15]證實,Nrf2水平可受到GSK3β等不依賴于Keap-1的調(diào)控方式調(diào)節(jié)。GSK3β具有多種生物學(xué)功能,在腦缺血模型中應(yīng)用GSK3β抑制劑處理可達到保護神經(jīng)細胞功能、減輕缺血缺氧損傷的目的[16]。劉遠玲[17]在MCAO腦缺血模型中抑制GSK3β活性后,總Nrf2和核內(nèi)Nrf2的表達量均明顯增加,同時升高了其下游抗氧化物HO-1和醌氧化還原酶1的表達水平,減輕了MCAO氧化應(yīng)激損傷,證實了GSK3β在腦缺血中對Nrf2活性的負性調(diào)控作用。

肉蓯蓉苯乙醇苷是從肉蓯蓉中提取分離的一類苯乙醇苷類化合物?，F(xiàn)代藥理研究[18]表明,苯乙醇苷類化合物普遍具有抗氧化活性和神經(jīng)保護功能,可用于氧化應(yīng)激所致神經(jīng)退行性疾病的防治。李剛等[19]研究發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)可減輕大鼠精子膜脂質(zhì)過氧化損傷,保護其結(jié)構(gòu)和功能。駱新等[20]報道,肉蓯蓉苯乙醇苷可有效改善低氧引起的大鼠腦組織水腫,減輕組織氧化損傷,提示肉蓯蓉苯乙醇苷對腦組織損傷的修復(fù)作用可能與其抗氧化能力相關(guān)。本實驗采用SD大鼠制備MCAO模型,給予肉蓯蓉苯乙醇苷連續(xù)灌胃治療14 d,考察肉蓯蓉苯乙醇苷對腦缺血的神經(jīng)保護作用。結(jié)果表明,肉蓯蓉苯乙醇苷灌胃14 d后能夠有效恢復(fù)MCAO大鼠神經(jīng)功能,降低腦組織含水量,減輕腦組織梗死后海馬神經(jīng)元的損傷,提示肉蓯蓉苯乙醇苷對MCAO大鼠具有明顯良好的神經(jīng)保護作用。

SOD和GSH-Px水平可反映機體清除自由基能力[21]。MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化程度[22]。通過ELISA檢測大鼠血清SOD、GSH-Px和MDA的水平可見,模型組血清SOD、GSH-Px水平較假手術(shù)組顯著降低,MDA含量明顯升高,肉蓯蓉苯乙醇苷灌胃治療后明顯升高了SOD、GSH-Px水平,降低了MDA含量,提示MCAO大鼠存在自由基過剩現(xiàn)象,而應(yīng)用肉蓯蓉苯乙醇苷可改善MCAO造成的自由基過剩和脂質(zhì)過氧化。進一步探究其對GSK3β/Nrf2/ARE通路的作用發(fā)現(xiàn),模型組海馬組織GSK3β蛋白和mRNA表達量較假手術(shù)組明顯增多,Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達明顯減少,肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)后明顯下調(diào)了海馬組織GSK3β表達水平,同時上調(diào)了Nrf2、HO-1表達。通過以上結(jié)果可初步得出,肉蓯蓉苯乙醇苷對MCAO大鼠的抗氧化損傷作用可能與調(diào)節(jié)GSK3β/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的表達相關(guān)。

綜上所述,肉蓯蓉苯乙醇苷可有效保護MCAO大鼠腦組織損傷,提高神經(jīng)功能及抗氧化能力,其機制可能與調(diào)節(jié)GSK3β/Nrf2/ARE信號通路活化、激活抗氧化系統(tǒng)相關(guān)。