超聲輔助酶解法提取杏鮑菇多糖工藝研究

孫法林，肖慧慧，侯笑林，張玉豪

（青島工學(xué)院食品工程學(xué)院，山東青島 266300）

杏鮑菇富有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及鈣、銅、鎂等礦物質(zhì)，可增強(qiáng)人體免疫力，對(duì)人體具有抗癌、降血脂及美容養(yǎng)顏?zhàn)饔肹1]。天然多糖根據(jù)來(lái)源分為微生物多糖、動(dòng)物多糖和植物多糖，廣泛存在動(dòng)植物體內(nèi)和微生物細(xì)胞壁中[2]，其作用幾乎涉及到機(jī)體免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面，具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎癥等多種功效[3]。獲得多糖的方法常用的有熱水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法等，其中酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)生物技術(shù)，加速多糖的釋放或提取[4]。

杏鮑菇多糖是杏鮑菇的主要活性成分之一，具有較高的藥用價(jià)值，并且對(duì)人體有保健功能。目前，食用菌多糖的酶法提取、超聲輔助提取等技術(shù)均已有報(bào)道，但酶法和超聲輔助聯(lián)合提取杏鮑菇多糖研究報(bào)道較少。在基于超聲處理作為基礎(chǔ)，采用纖維素酶法提取杏鮑菇多糖，進(jìn)一步改善了提取工藝，為杏鮑菇下一步利用提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 原材料

杏鮑菇，當(dāng)?shù)爻胁少?gòu)，要求新鮮、無(wú)腐爛。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、纖維素酶、氫氧化鈉（GB/T 629—1997）、鹽酸（GB/T 622—2006），上海埃彼化學(xué)試劑有限公司提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DHG-9240A 型BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（60 目篩），上?？德穬x器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；80-2 型電動(dòng)離心機(jī)、HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司產(chǎn)品；JM-B5102 型分析天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；多功能粉碎機(jī)，鉑歐五金廠產(chǎn)品；722 型分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

選用新鮮、無(wú)蟲(chóng)害的杏鮑菇，用清水洗凈，切片，60 ℃下烘干，用粉碎機(jī)將其研磨成粉末狀，過(guò)60 目篩，放于瓶中，干燥保存。

1.2.2 杏鮑菇多糖的提取

將去核的杏鮑菇置于恒溫干燥箱中，經(jīng)烘干、粉碎，過(guò)60 目篩備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末于錐形瓶中，pH 值6.00 條件下，以料液比1∶30（g∶mL） 加入蒸餾水，超聲提取20 min，離心過(guò)濾后取上清液。向?yàn)V液中加入0.8%的纖維素酶，在酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間90 min 條件下進(jìn)行酶解提取。將酶解液置于沸水浴中加熱10 min 滅酶，冷卻至室溫，離心過(guò)濾，得到杏鮑菇多糖提取液，用苯酚- 硫酸法測(cè)定提取液中多糖含量。

1.2.3 杏鮑菇多糖含量的測(cè)定及計(jì)算方法

采用苯酚- 硫酸分光光度法測(cè)定多糖含量。精確稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖100 mg 于500 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別量取0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 試管中，加蒸餾水至2.0 mL并搖勻。分別加入新配制的苯酚試劑1.0 mL，濃硫酸5 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min后于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。

取杏鮑菇多糖提取液，按上述方法測(cè)吸光度，代入方程，求多糖含量，從而求多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

（1） 料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末，在pH 值6.0 條件下，分別以料液比為1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL） 加入蒸餾水，超聲時(shí)間20 min，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖含量。

（2） pH 值對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g杏鮑菇粉末，在最佳料液比條件下，分別調(diào)節(jié)pH 值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，超聲時(shí)間20 min，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖含量。

（3） 超聲提取時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末，在最佳料液比及pH 值條件下，分別以超聲時(shí)間10，15，20，25，30 min進(jìn)行提取，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，于60 ℃條件下酶解90 min，經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖含量。

（4） 酶添加量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。將超聲提取所得濾液中分別加入添加量為0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖提取率。

（5） 酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶，分別采用酶解溫度為50，55，60，65，70 ℃，酶解90 min。經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖含量。

（6） 酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶，在最佳酶解溫度條件下，分別設(shè)置酶解時(shí)間為70，80，90，100，110 min 進(jìn)行酶解提取。經(jīng)滅酶、冷卻，測(cè)定多糖提取率。

1.2.5 酶解過(guò)程的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別對(duì)3 個(gè)因素設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，優(yōu)化杏鮑菇多糖提取工藝條件。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)與傳統(tǒng)水提法的比較

準(zhǔn)確稱取1.00 g 杏鮑菇，按照試驗(yàn)得出的最佳提取工藝條件提取杏鮑菇多糖，重復(fù)3 次取平均值，并與傳統(tǒng)水提法提取杏鮑菇多糖比較提取效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖1 可知，提取率隨著料液比的增大而慢慢增大，當(dāng)料液比為1∶30 時(shí)達(dá)到最高，隨著溶劑的繼續(xù)增加，多糖的提取率變化不大。溶劑量的增加，使得超聲波介質(zhì)的液體增加，細(xì)胞內(nèi)外部濃度差距變大，多糖提取率的上升是根據(jù)多糖類物質(zhì)向外擴(kuò)大的速度。當(dāng)料液比達(dá)到1∶30 時(shí)，其提取量達(dá)到了極限，提取率不再提高。為了不讓隨后的工藝負(fù)荷壓力太大，提取劑的添加量不應(yīng)過(guò)多，因此多糖提取效果最好的料液比為1∶30。

2.2 pH 值對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

pH 值對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH 值對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著pH 值的增大，多糖提取率逐漸升高。當(dāng)pH 值為6.0 時(shí)，多糖提取率最高；繼續(xù)增大pH 值，溶液酸堿性影響了酶和底物的空間結(jié)構(gòu)，使得兩者的結(jié)合受到一定影響，同時(shí)加劇了杏鮑菇多糖的分解，導(dǎo)致多糖提取率的降低，因此多糖提取的最佳pH 值為6.0。

2.3 超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，20 min 時(shí)達(dá)到最大。超聲處理提高了顆粒內(nèi)部的溫度和壓力，擴(kuò)散速率加快；同時(shí)，由于超聲處理使細(xì)胞壁受到破碎而孔徑增大，利于細(xì)胞內(nèi)多糖溶出；時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率呈下降趨勢(shì)，可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，降低了某些反應(yīng)的活化能，從而導(dǎo)致糖結(jié)構(gòu)的變化和破壞，也可能是由于蛋白質(zhì)變性沉積在顆粒表面，導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，超聲時(shí)間控制在20 min 為宜。

2.4 酶添加量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

酶添加量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶添加量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖4 可知，杏鮑菇多糖提取率會(huì)根據(jù)纖維素酶添加量的提高而上升，主要是底物與酶接觸面增大，使得酶對(duì)多糖提取效率大大提高。當(dāng)纖維素酶添加量提高到0.8%時(shí)，纖維素酶與底物的接觸面積達(dá)到飽和狀態(tài)，接觸面積不再擴(kuò)大，杏鮑菇多糖提取率會(huì)隨著酶添加量的增加不再上升，逐漸趨于于穩(wěn)定。此時(shí)，杏鮑菇中多糖到提取率到達(dá)最高水平。因此，確定纖維素酶添加量為0.8%比較合理。

2.5 酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖5 可知，杏鮑菇多糖提取率根據(jù)酶解溫度的提高而上升，當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí)多糖提取率最高。繼續(xù)提高酶解溫度，則會(huì)使得多糖提取率逐漸下降，因?yàn)樵诿复俜磻?yīng)中，反應(yīng)物能量提高是根據(jù)溫度上升，加速酶的反應(yīng)，若試驗(yàn)溫度超過(guò)酶可接受最高溫度范圍，將會(huì)造成酶蛋白質(zhì)變性或者失去活性，直接使得多糖提取率快速下降。因此，選擇60 ℃為最適宜的酶解溫度。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖6 可知，杏鮑菇多糖提取率會(huì)隨著酶解時(shí)間的不斷增加而上升，當(dāng)酶解時(shí)間為90 min 時(shí)，杏鮑菇多糖提取率上升且趨于穩(wěn)定；當(dāng)時(shí)間到100 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高水平；而在90～100 min 時(shí)多糖提取率增加并不顯著，主要是因?yàn)槊附獬掷m(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖在底物中含量過(guò)低，細(xì)胞內(nèi)外的濃度差逐步減小，同時(shí)也加大了雜質(zhì)在提取液中的溶解量，多糖提取率上升不明顯。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率變化不大。因此，選擇90 min 為最佳酶解時(shí)間。

2.7 酶解過(guò)程的正交試驗(yàn)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 極差分析，試驗(yàn)中3 個(gè)因素的影響力大小順序?yàn)锳＞C＞B，對(duì)應(yīng)影響酶解杏鮑菇多糖提取率效果因素的強(qiáng)弱順序?yàn)槊柑砑恿浚久附鈺r(shí)間＞酶解溫度，且杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝為A2B3C3，即酶添加量0.8%，酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間100 min。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)與傳統(tǒng)水提法的比較

由于計(jì)算出的最優(yōu)組合不包含在正交表中，因而按最優(yōu)組合配方進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，得出杏鮑菇多糖提取率為28.06%，因此確定A2B3C3為杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝條件。

在不加纖維素酶及超聲的條件下，按照傳統(tǒng)水提法，即料液比1∶30，pH 值6.0，提取時(shí)間20 min，提取溫度60 ℃進(jìn)行杏鮑菇多糖的提取，可得杏鮑菇多糖提取率為18.32%。由此可知，超聲輔助酶解法可以明顯提高杏鮑菇多糖的提取率，原因可能是超聲配合纖維素酶能夠破壞植物細(xì)胞壁中的纖維素結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖從杏鮑菇細(xì)胞中溶解出來(lái)。

3 結(jié)論

（1） 超聲輔助酶解法提取杏鮑菇多糖的最佳提取條件為料液比1∶30，pH 值6.0，超聲時(shí)間20 min，酶添加量0.8%，酶解時(shí)間100 min，酶解溫度66 ℃。在此工藝條件下杏鮑菇多糖提取率最高，為28.06%。

（2） 纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，性質(zhì)穩(wěn)定，在傳統(tǒng)水提法的條件下不易水解。試驗(yàn)采用超聲輔助纖維素酶法提取杏鮑菇多糖，能有效提高杏鮑菇多糖提取率，其多糖提取率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水提法，同時(shí)提取溫度較低，反應(yīng)條件溫和、快速、高效。