大豆疫霉菌氧化固醇結(jié)合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及活性鑒定

丁 鮮, 劉西莉, 張 峰*,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193)

卵菌是一類形態(tài)上類似于絲狀真菌，但是在系統(tǒng)發(fā)育上與原生藻菌中的硅藻和褐藻相關(guān)的真核生物[1]。其中已知60% 的卵菌是植物病原菌，對農(nóng)業(yè)、林業(yè)和觀賞植被等造成了毀滅性的危害。疫霉屬是卵菌中危害最嚴(yán)重的種屬，包含了對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會經(jīng)濟具有毀滅性破壞作用的植物病原菌，例如導(dǎo)致愛爾蘭馬鈴薯饑荒的馬鈴薯晚疫病病原致病疫霉Phytophthora infestans[2]、引起的賈拉森林枯死的樟疫霉P.cinnamomzhib及引起櫟樹猝死的櫟樹猝死病菌P.ramorum[3]。

大豆疫霉菌 (Phytophthora sojae, Ps) 也屬于疫霉屬，是一種危害嚴(yán)重且較難防治的土傳病原菌，在大豆整個發(fā)育和生長期均可為害，如在大豆出苗前后可引起猝倒病，后期可引起大豆根腐病[4]。該病害通常在地下發(fā)生，先破壞大豆根部組織，后期向上傳播并危害植物莖干，每年在全球可造成10 億至20 億美元的經(jīng)濟損失[5]。目前對于大豆猝倒病和根腐病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，最常見的是苯基酰胺類及羧酸酰胺類殺菌劑[6]。

氟噻唑吡乙酮 (oxathiapiprolin) 是杜邦公司于2007 年開發(fā)的一款新型哌啶基噻唑異唑啉類卵菌殺菌劑，兼具保護(hù)和治療作用[7]，對植物卵菌病害，如晚疫病、霜霉病、根腐病和莖腐病等具有極高的生物活性[8]。氟噻唑吡乙酮不僅可以抑制病原菌菌絲的生長，還能抑制孢子囊的形成和游動孢子的萌發(fā)[7,9]。目前認(rèn)為氟噻唑吡乙酮的作用靶點為氧化固醇結(jié)合蛋白 (oxysterol-binding protein, OSBP)，由于OSBP 是一個全新的殺菌劑靶標(biāo)，因此氟噻唑吡乙酮與其他殺卵菌劑沒有交互抗藥性[10]。

OSBP 及OSBP 相關(guān)蛋白 (OSBP-related protein,ORPs) 是真核生物中非常保守的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，也是一種重要的非囊泡運輸?shù)鞍住Ｔ诩?xì)胞的生長和代謝中，特別是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器如高爾基體、質(zhì)膜等形成的膜接觸反應(yīng)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11-12]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)可將ORPs 家族分為兩類：一類是短鏈ORPs，只含有氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域 (OSBP-related domain, ORD)；另一類是長鏈ORPs，其除了在羧基端有ORD 外，還含有Pleckstrin homology (PH) 結(jié)構(gòu)域、Golgi dynamics (GOLD) 結(jié)構(gòu)域、Helical region (跨膜域)及Phenylalanines in an acidic tract (FFAT) 序列[13-15]。所有ORPs 的共同特征是都含有ORD 結(jié)構(gòu)域。第1 個ORD 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)來源于2005 年解析的酵母的Osh4[16]，后續(xù)解析的ORD 晶體結(jié)構(gòu)均來源于酵母和人源。根據(jù)已知的三維結(jié)構(gòu)，ORD 可形成β-桶狀結(jié)構(gòu)并作為天然配體甾醇類和磷脂酰肌醇類的容器和運輸工具，從而維持脂質(zhì)的動態(tài)平衡[17-19]。大豆疫霉菌含兩個ORPs 蛋白，分別是長鏈OSBP 和短鏈OSBP，兩者的蛋白質(zhì)序列同源性為36.8%。長鏈OSBP 基因的突變顯著影響了菌體對氟噻唑吡乙酮的敏感性，而短鏈OSBP 基因的缺失表現(xiàn)出與野生型相似的敏感性，即與菌體的藥敏性無關(guān)[20]，因此長鏈OSBP 蛋白被認(rèn)為是氟噻唑吡乙酮的靶標(biāo)。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉菌的長鏈OSBP (Psosbp) 與人源及酵母OSBP 的蛋白同源性均較低，僅10%到20%，因此利用其他物種來源的OSBP 三維結(jié)構(gòu)分析Psosbp 與氟噻唑吡乙酮的分子互作特征，其結(jié)果很可能不是非常準(zhǔn)確。另外，目前尚未見卵菌OSBP 蛋白的內(nèi)源或外源表達(dá)及純化的報道，從而限制了對其結(jié)構(gòu)藥理學(xué)的深入研究。鑒于此，本研究對Psosbp 蛋白進(jìn)行了異源表達(dá)，利用親和層析、凝膠過濾層析、Western blot、蛋白穩(wěn)定性分析及微量熱泳動技術(shù)得到了具有生物活性的Psosbp 單體融合蛋白，直接證實了氟噻唑吡乙酮可結(jié)合氧化固醇結(jié)合蛋白，結(jié)果為后續(xù)在結(jié)構(gòu)層面揭示藥-靶互作的機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和載體 供試菌株大腸桿菌Escherichia coliDH5α 和BL21(DE3)，以及大豆疫霉菌P.sojaecDNA 和載體pET28a，均保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實驗室。

1.1.2 主要試劑 同源重組酶2 × Ezmax-single CloneMix Plus、FastPfu Premix 酶和DNA 膠回收試劑盒，均購于上海吐露港生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ，購于大連TaKaRa公司；組氨酸抗體，購于上海愛必信生物有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光液，購于上海天能生命科學(xué)有限公司；甘油 (glycerol)，購于上海滬試實驗室器材股份有限公司；脫脂奶粉和Ni-NTA 瓊脂糖樹脂，購于BBI 生命科學(xué)有限公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，購于BioLeaders 公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和咪唑 (imidazole)，購于上海源葉生物科技有限公司；Tris、NaCl 和卡那霉素 (kanamycin,簡稱kana)，均購于上海生工生物工程股份有限公司；TEV 蛋白酶、胰蛋白胨 (tryptone)、酵母提取物 (yeast extract)、瓊脂粉 (agar powder)、二硫蘇糖醇 (DTT) 和乙二胺四乙酸 (EDTA)，購于北京索萊寶科技有限公司；RED-tris-NTA 蛋白標(biāo)記試劑盒、MO 標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管和Tycho NT.6 毛細(xì)管，均購于德國NanoTemoper 科技有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。NdeⅠ-ps600-F 序列：GAAAACCTGTATTTCCAGGGTCATATGGCGAT CTTCCACCCGAAGA，XhoⅠ-ps967-R 序列：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTGG CCGGCAGCTGCGC。測序由安徽通用生物科技公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB (Luria-Bertani) 固體培養(yǎng)基：10 g 氯化鈉、10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、瓊脂粉16 g，蒸餾水定容至1 L，高溫高壓121 ℃滅菌20 min。LB 液體培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中去除瓊脂粉。

1.1.4 主要儀器 Trident960 基因擴增儀，Heal Force 公司；Centrifuge 5424 高速離心機，Eppendorf 公司；Avanti J-26S XP 高速離心機，BECKMAN 公司；APV1000 高壓均質(zhì)機，SPX 公司；AKTA Pure25 蛋白純化儀和凝膠過濾層析柱SuperdexTM200 Increase 10/300GL，Cytiva 公司；JY-SCZ2 垂直電泳槽、JY-SPCT 水平電泳槽和JY-ZY5 轉(zhuǎn)移電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)置有限公司；Tycho? NT.6 和微量熱泳動分析儀，德國NanoTemoper 科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 序列分析 使用Clustalx 和ESPript 3.0 軟件對Psosbp (XP_009522569) 進(jìn)行蛋白序列比對。使用Expasy (https://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)。使用TMHMM Server,v.2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 基因擴增及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 為克隆Psosbp-ORD 保守區(qū)域的基因序列，選取Psosbp(600-967)作為ORD 結(jié)構(gòu)域，并在其氮端添加麥芽糖結(jié)合蛋白 (maltose binding protein，MBP) 增加蛋白的可溶性，使用NdeⅠ-ps600-F 和XhoⅠ-ps967-R 為上下游引物，以大豆疫霉菌cDNA 為模板擴增目的片段。50 μL 擴增體系：2 × FastPfu Premix 25 μL、上下游引物各2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 20 μL。PCR 程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。對pET28a 載體進(jìn)行NdeⅠ及XhoⅠ 雙酶切，50 μL 酶切體系：1 μg DNA、1 μL NdeⅠ、1 μL XhoⅠ、5 μL 10 × Universal Buffer，補水至50 μL，37 ℃過夜酶切。用DNA 膠回收試劑盒對酶切的載體和片段進(jìn)行回收，2 × Ezmaxsingle CloneMix Plus 連接酶連接載體和片段，50 ℃反應(yīng)20 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)化子測序。

1.2.3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，37 ℃倒置培養(yǎng)，挑取單菌落在添加終濃度為50 mg/L 卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，并作為母液。取100 μL 菌液留存作Western blot 實驗備用，其余菌液按體積比1:100 將其添加到終濃度為50 mg/L 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行大量搖培至OD600為1.0 左右，加入終濃度為10-4mol/L 的IPTG，16 ℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)20 h，取100 μL 菌液留存作Western blot 實驗備用，其余菌液離心棄上清，收集菌體。

1.2.4 Western blot 實驗 取上述留存的IPTG 誘導(dǎo)前、后的100 μL 菌液離心，加入菌體裂解液(0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、pH 7.5)，充分裂解后，取10 μL 誘導(dǎo)前、后的菌液，在120 V 電壓下進(jìn)行SDS-PAGE 電泳2 h，200 mA 電流轉(zhuǎn)膜2 h。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，按比例稀釋組氨酸一抗，孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次5 min；加入按比例稀釋的組氨酸二抗，孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次5 min；之后加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.5 親和層析純化 收集經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用重懸緩沖液 (0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、2.5 × 10-4mol/L 咪唑、10% 甘油、pH 7.5)進(jìn)行重懸，使用高壓均質(zhì)機破碎，之后在4 ℃、18 000 r/min 條件下離心45 min，取上清液。使用5 倍柱體積重懸緩沖液平衡Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱，之后向Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱中加入蛋白上清液，同時收集流穿液；使用5 倍柱體積重懸緩沖液沖洗Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱；最后使用洗脫緩沖液 (0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、0.25 mol/L 咪唑、10%甘油、pH 7.5) 洗脫目的蛋白并收集洗脫液。

1.2.6 凝膠過濾層析純化 將SuperdexTM200 Increase 10/300GL 凝膠過濾層析柱與AKTA Pure25 蛋白純化儀連接，使用含0.02 mol/L Tris-HCl、0.2 mol/L NaCl、10%甘油、1 × 10-3mol/L DTT、1 × 10-3mol/L EDTA、pH 7.5 的緩沖液平衡層析柱，通過上樣環(huán)進(jìn)行蛋白上樣，設(shè)置程序洗脫并收集樣品。

1.2.7 蛋白穩(wěn)定性分析 調(diào)整蛋白的質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL，用Tycho NT.6 毛細(xì)管吸取凝膠過濾層析收集的單體蛋白，使用MBP-TEV-His6 蛋白作為對照，將樣品置于Tycho? NT.6 樣品槽中，選擇程序。儀器在加熱過程中，用280 nm 去激發(fā)色氨酸和酪氨酸，然后測定330 nm 和350 nm 的發(fā)射光以及它們的比值，來評估蛋白熱穩(wěn)定性。

1.2.8 蛋白生物活性分析 調(diào)整蛋白終濃度為50 nmol/L，藥劑濃度為40 μmol/L，按照REDtris-NTA 蛋白標(biāo)記試劑盒對蛋白進(jìn)行標(biāo)記。選擇Binding check 程序，通過MO 標(biāo)準(zhǔn)型毛細(xì)管上樣，通過信噪比數(shù)值評估MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 以及對照MBP-TEV-His6 與氟噻唑吡乙酮結(jié)合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Psosbp 結(jié)構(gòu)域預(yù)測及生物信息學(xué)分析

以已經(jīng)解析晶體結(jié)構(gòu) (PDB 號：5ZM5) 的人源OSBP 蛋白序列與Psosbp (XP_009522569) 進(jìn)行序列比對 (圖1)，在不破壞二級結(jié)構(gòu)的前提下，選取Psosbp 第600 位至967 位氨基酸，即Psosbp (600-967) 為ORD 結(jié)構(gòu)域，用于后續(xù)蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。Psosbp(600-967) 基因序列編碼368 個氨基酸，無跨膜區(qū)。經(jīng)Expasy 預(yù)測，Psosbp(600-967)蛋白分子質(zhì)量為40.96 kDa，理論等電點PI 為8.26。重組蛋白MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白分子質(zhì)量為83.7 kDa，理論等電點PI 為6.18。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒圖譜見圖2A。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證測序，使用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ 和XhoⅠ對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒酶切驗證。如圖2B 所示，酶切后分別產(chǎn)生6353 bp 和1131 bp 的產(chǎn)物，與預(yù)期相符。將重組表達(dá)質(zhì)粒測序，證實質(zhì)粒無堿基移位和突變，符合下一步蛋白表達(dá)的要求。

2.3 Psosbp 蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件

對包含pET28a-MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 質(zhì)粒的BL21(DE3) 大腸桿菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，如圖3A 所示，受IPTG 誘導(dǎo)后，BL21(DE3)可成功特異性表達(dá)目的蛋白。同時通過組氨酸抗體對IPTG 誘導(dǎo)前后菌液進(jìn)行了Western blot 實驗，確定表達(dá)出來的蛋白是預(yù)先設(shè)計的蛋白 (圖3B)。

圖3 pET28a-MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 在BL21(DE3) 中的誘導(dǎo)表達(dá)前后電泳結(jié)果(A) 和Western blot 結(jié)果(B)Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blot analysis (B) of induced expression of pET28a-MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 in BL21 (DE3)

2.4 重組蛋白的親和層析純化

將含有重組蛋白的上清液用Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱進(jìn)行親和層析純化。結(jié)果顯示，洗脫液中含有含量及純度均較高的重組蛋白 (圖4)。

圖4 MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白純化電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 protein purification samples

2.5 重組蛋白的凝膠過濾層析純化

MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重組蛋白經(jīng)凝膠過濾層析 (圖5A)，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE(圖5B)。參考標(biāo)準(zhǔn)蛋白層析Marker 以及SDSPAGE 測定結(jié)果，表明MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重組蛋白得到較好的分離，并主要以單體蛋白狀態(tài)存在。將TEV 蛋白酶與融合蛋白以質(zhì)量比1：50 孵育以期望切除MBP 標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)Psosbp(600-967) 蛋白出現(xiàn)大量沉淀。以上結(jié)果說明，MBP 可以增加Psosbp(600-967) 蛋白的可溶性，并具有穩(wěn)定蛋白性質(zhì)的作用，故后續(xù)均使用重組蛋白來開展實驗。

圖5 MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白凝膠過濾層析純化電泳結(jié)果Fig.5 Purification of MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 protein by gel filtration chromatography

2.6 重組蛋白穩(wěn)定性分析

Tycho? NT.6 分析MBP-TEV-His6 曲線 (圖6A)與NanoTemper 官網(wǎng)MBP 曲線對照圖吻合，MBPTEV-Psosbp(600-967)-His6 曲線呈“S”形 (圖6B)，蛋白在拐點處的溫度發(fā)生去折疊，溫度Ti為61.5 ℃。結(jié)果表明，重組蛋白MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 較為穩(wěn)定，具有完整的蛋白高級結(jié)構(gòu)，且MBP 的存在未破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu)。

圖6 MBP-TEV-His6 (A) 和MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 (B) 蛋白穩(wěn)定性分析曲線Fig.6 Protein stability analysis of MBP-TEV-His6(A) and MBP-TEV-Psosbp (600-967) -His6(B)

2.7 重組蛋白活性分析

使用微量熱泳動中Binding check 程序分別測試了MBP-TEV-His6 和MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 與藥劑氟噻唑吡乙酮是否存在結(jié)合。信噪比用于評估結(jié)合數(shù)據(jù)的質(zhì)量，信噪比大于5 可定義為靶標(biāo)與配體有結(jié)合。MBP-TEV-His6 在添加氟噻唑吡乙酮后，信噪比為1.2，明顯小于5，故兩者無結(jié)合活性 (圖7A)；而MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 添加氟噻唑吡乙酮后，信噪比為14.3，遠(yuǎn)大于5 (圖7B)，因此判斷MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白具有與抑制劑結(jié)合的活性。

圖7 MBP-TEV-His6(A)與MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6(B)與氟噻唑吡乙酮微量熱泳動曲線Fig.7 MST analysis of MBP-TEV-His6 (A) and MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 (B) with oxathiapiprolin

3 結(jié)論與討論

氧化固醇結(jié)合蛋白 (OSBP) 及其相關(guān)蛋白 (ORPs)涉及許多細(xì)胞過程，包括信號傳導(dǎo)、囊泡運輸、脂質(zhì)代謝和非囊泡運輸?shù)龋热缭诮湍负腿祟惣?xì)胞中，ORPs 可促進(jìn)甾醇和其他磷脂在細(xì)胞內(nèi)膜之間的運輸。質(zhì)膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 (PI(4,5)P2)的平衡被打破時，會導(dǎo)致代謝紊亂以及誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，因此人源ORPs 和其他ORPs 與細(xì)胞信號調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生可能有關(guān)聯(lián)[21-22]。植物病原菌中的OSBP 作為一種新型的卵菌?；蜌⒕鷦┌袠?biāo)，其抑制劑氟噻唑吡乙酮具有超高活性及反抗性等特點[7]。然而，目前室內(nèi)試驗已分離出馬鈴薯晚疫病菌P.infestans、辣椒疫霉病菌P.capsici和寄生疫霉病菌P.parasitica對氟噻唑吡乙酮的抗藥性菌株[23]，并通過CRISPR-Cas9 證明了幾個關(guān)鍵氨基酸位點突變后其突變體菌株的抗性指數(shù)超過1000，說明疫霉菌對氟噻唑吡乙酮具有中、高水平抗性風(fēng)險[24]。因此，對氟噻唑吡乙酮與靶標(biāo)OSBP 蛋白互作機制的研究，將為設(shè)計對氟噻唑吡乙酮反抗性的新型OSBP 抑制劑奠定重要的基礎(chǔ)。

已知OSBP 與配體的三維結(jié)構(gòu)的解析僅限酵母和人源，而植物病原菌的OSBP 三維結(jié)構(gòu)尚未報道。鑒于不同物種之間蛋白質(zhì)序列同源性較低，利用結(jié)構(gòu)預(yù)測的方式模建植物病原菌的OSBP 三維結(jié)構(gòu)可能不準(zhǔn)確。得到均一的及純度較高的蛋白質(zhì)是解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和研究蛋白質(zhì)生物化學(xué)的基礎(chǔ)，然而目前尚未見關(guān)于植物病原菌OSBP 蛋白異源表達(dá)及純化的報道。已有研究結(jié)果表明，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)酵母氧化固醇結(jié)合蛋白Osh1 的ORD，蛋白折疊錯誤形成高聚，但在蛋白表達(dá)過程中加入Osh1 配體麥角甾醇，蛋白存在狀態(tài)由高聚變?yōu)閱误w[18]。因此本研究前期也嘗試在大豆疫霉菌Psosbp(600-967)-His6表達(dá)過程中加入配體麥角甾醇，但Psosbp(600-967)-His6 蛋白仍出現(xiàn)錯誤折疊，存在狀態(tài)為包涵體，因此需要重新建立新的適于卵菌OSBP 表達(dá)及純化的方法。我們曾嘗試添加其他促溶標(biāo)簽，但Psosbp(600-967) 蛋白的存在狀態(tài)未發(fā)生改變，只有麥芽糖結(jié)合蛋白MBP 標(biāo)簽顯著提高了蛋白Psosbp(600-967) 的可溶性，且經(jīng)親和層析和凝膠過濾層析分離后，MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重組蛋白純度較高。之后我們利用Tycho?NT.6 測試發(fā)現(xiàn)蛋白具有穩(wěn)定的、完整的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，最后利用微量熱泳動證明了蛋白具有與藥劑結(jié)合的生物活性。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了大豆疫霉菌氧化固醇結(jié)合蛋白Psosbp 大腸桿菌異源表達(dá)、純化及活性鑒定體系，獲得了足量的、純度較高且具有生物活性的重組蛋白，直接證實了氟噻唑吡乙酮可結(jié)合氧化固醇結(jié)合蛋白，為后續(xù)藥-靶三維結(jié)構(gòu)的解析了奠定基礎(chǔ)，同時為以O(shè)SBP 為靶標(biāo)的新型卵菌抑制劑的開發(fā)提供了依據(jù)。