死皮橡膠樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中樹皮結(jié)構(gòu)及膠乳生理動(dòng)態(tài)分析

袁 坤何 晶馮成天胡義鈺劉 輝何其光王真輝

（1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570100）

天然橡膠作為世界四大工業(yè)原料之一，因其彈性好、可塑性和耐磨性佳等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于國(guó)防建設(shè)中。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來(lái)源[1-2]，生產(chǎn)上通過(guò)周期性切割樹干樹皮來(lái)獲取膠乳，膠乳的主要成分即為天然橡膠。目前，橡膠樹死皮（TPD）已成為制約天然橡膠生產(chǎn)的關(guān)鍵因子之一，橡膠樹發(fā)生死皮后，割線上的膠乳表現(xiàn)為斷斷續(xù)續(xù)，嚴(yán)重時(shí)割線上完全沒(méi)有膠乳。死皮即指橡膠樹割線排膠減少甚至完全停止排膠，乳管喪失部分或全部產(chǎn)膠能力的現(xiàn)象，死皮的發(fā)生極大降低了膠乳產(chǎn)量，帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[3-5]。生產(chǎn)上通過(guò)乙烯利刺激來(lái)提高橡膠樹產(chǎn)量，而過(guò)度的乙烯利刺激則會(huì)導(dǎo)致死皮發(fā)生，此外，強(qiáng)度割膠及其他逆境環(huán)境條件的影響也可能導(dǎo)致死皮發(fā)生。目前，死皮發(fā)生的機(jī)制仍不清楚，也無(wú)高效的死皮防治劑預(yù)防和控制橡膠樹死皮。

乳管是合成和貯存天然橡膠的組織，其主要分布于橡膠樹樹皮中。當(dāng)死皮發(fā)生后，乳管排列發(fā)生紊亂，膨大乳管、石細(xì)胞、單寧細(xì)胞的數(shù)量明顯增加[6]。膠乳是橡膠樹乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，膠乳生理參數(shù)反映了乳管系統(tǒng)的生理狀況[7-8]，橡膠樹膠乳生理狀況受不同品種遺傳特性、割膠強(qiáng)度、樹齡、季節(jié)以及乙烯利刺激等多種外界環(huán)境條件的影響[9-15]。橡膠樹熱研7-33-97、熱研8-79和PR107 在膠乳蔗糖、無(wú)機(jī)磷、硫醇含量以及蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性上顯示了較大的差異，說(shuō)明3 個(gè)品種在產(chǎn)排膠特性上具有明顯差異[9]；強(qiáng)割對(duì)橡膠樹不同品系的膠乳產(chǎn)量、排膠時(shí)間等生理參數(shù)具有明顯的影響[11]；乙烯利刺激導(dǎo)致了熱研8-79和PR107 的膠乳黃色體破裂指數(shù)增加，堵塞指數(shù)和排膠初速度則下降[12]。已有研究顯示，橡膠樹死皮發(fā)生對(duì)膠乳生理參數(shù)也具有重要影響。死皮樹中膠乳硫醇含量的下降可能導(dǎo)致了有毒氧的累積，進(jìn)而發(fā)生死皮[16-17]；除硫醇外，死皮植株中膠乳無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量也明顯低于健康樹，暗示了死皮發(fā)生后乳管系統(tǒng)的代謝能力減弱，膠乳合成的能力下降[17]；嚴(yán)重死皮樹的膠乳黃色體破裂指數(shù)顯著增大[18]，且隨著死皮程度的增加，黃色體破裂指數(shù)也明顯增加[19]；高濃度乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹發(fā)生死皮過(guò)程中，膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷、蔗糖等生理指標(biāo)呈先上升后下降趨勢(shì)，而黃色體破裂指數(shù)則呈先下降后上升趨勢(shì)[20]。盡管關(guān)于橡膠樹死皮發(fā)生后膠乳生理變化有一定研究，但死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中膠乳生理變化的研究卻鮮有報(bào)道。

解析橡膠樹死皮恢復(fù)的生理機(jī)制是開發(fā)高效死皮防治劑的前提之一。前期研究表明，由高濃度乙烯利刺激產(chǎn)生的死皮樹，經(jīng)1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理后，能誘導(dǎo)這些死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠。本研究利用這一恢復(fù)系統(tǒng)，分析了1-MCP在促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中樹皮結(jié)構(gòu)及膠乳各生理參數(shù)的變化，為揭示橡膠樹死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠的生理機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)高效死皮防治劑提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所使用的試驗(yàn)材料為橡膠樹無(wú)性系熱研7-33-97，2006 年定植于海南省儋州市西慶民營(yíng)膠園（109°49′E，19°51′N），2016 年開割。2017年（11 齡），選擇割線產(chǎn)生部分死皮的植株（這些死皮植株由高濃度乙烯利誘導(dǎo)后產(chǎn)生，割線出現(xiàn)部分不排膠癥狀，其中不排膠的長(zhǎng)度，即死皮長(zhǎng)度占割線長(zhǎng)度的70% 以上）作為本研究的試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的處理

采用1-MCP 對(duì)由高濃度乙烯利刺激所產(chǎn)生的死皮樹進(jìn)行處理，誘導(dǎo)這些死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠。1-MCP 具體施用方法[21]如下：用刮刀清理割線中點(diǎn)下方20 cm 處的粗皮，將內(nèi)腔約20 mL 大小的橡膠氣囊安裝在清理面，保證氣囊和樹干粘貼牢固，不漏氣；定期通過(guò)橡膠氣囊的開口施入1-MCP 及所需的去離子水，然后用膠塞封堵開口；處理植株施用1-MCP 進(jìn)行處理，用藥量為0.1 g/（株·次）、去離子水用量1.5 mL/（株·次）；施藥頻率為每10 天1 次。

割面施用1-MCP 16 周后，割線癥狀由部分不排膠（死皮）（圖1a）逐漸恢復(fù)為排膠線內(nèi)縮（指割面上排膠線的寬度比正常樹明顯變窄的現(xiàn)象，圖1b）。施用1-MCP 22 周后，割線逐漸恢復(fù)全線排膠（圖1c），割膠后馬上對(duì)割線進(jìn)行拍照。以1-MCP 處理前的死皮樹作為對(duì)照，分別在對(duì)照死皮樹（R0）、恢復(fù)處理16 周（排膠線內(nèi)縮，R16）和22 周（全線排膠，R22）植株的割線下方用打孔器取直徑為1.5 cm、從形成層到周皮完整的圓柱體樹皮材料，用80%乙醇固定。分別采集對(duì)照死皮樹、恢復(fù)處理16 周和22 周植株（各9 株，每3 株作為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的膠乳，用于膠乳生理參數(shù)的測(cè)定。

圖 1 死皮恢復(fù)過(guò)程中割線癥狀的變化Fig. 1 The change of tapping panel syndrome during the TPD recovery

1.2.2 樹皮顯微結(jié)構(gòu)觀察

采用石蠟切片技術(shù)[22]，樹皮用80%乙醇固定后，經(jīng)碘-溴染色、乙醇梯度脫水、正丁醇透明和石蠟包埋，固綠染色后中性樹脂封片，之后進(jìn)行光學(xué)顯微觀察。

1.2.3 膠乳生理參數(shù)的測(cè)定

采用郭秀麗等[19]的方法對(duì)干膠含量、膠乳產(chǎn)量和膠乳pH 值進(jìn)行測(cè)定；采用DTNB 試劑法測(cè)定膠乳中硫醇含量[23]；采用鉬酸銨比色法測(cè)定膠乳中無(wú)機(jī)磷含量[24]；采用蒽銅試劑法測(cè)定膠乳中的蔗糖含量[25]；參照袁坤等[26]的方法測(cè)定膠乳中粗酶液蛋白質(zhì)含量；參照程成等[27]的方法測(cè)定膠乳黃色體破裂指數(shù)。

1.3 分析方法

采用Adobe Photoshop CS6 對(duì)顯微切片圖像進(jìn)行處理。用SAS 9.0 軟件對(duì)所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 死皮植株恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中樹皮結(jié)構(gòu)的變化

正常乳管細(xì)胞經(jīng)碘-溴染色后呈棕黑色，異常膨大乳管細(xì)胞則呈黃褐色。1-MCP 處理前，死皮植株水囊皮中的乳管稀疏分布不能成列，黃皮內(nèi)乳管基本為膨大乳管，石細(xì)胞面積大（圖2 a）?；謴?fù)處理16 周時(shí)，割線恢復(fù)部分排膠，此時(shí)黃皮內(nèi)有效乳管列數(shù)增加，石細(xì)胞團(tuán)占黃皮面積比例降低，有輸導(dǎo)功能韌皮部變厚，膨大乳管占黃皮面積的比例明顯降低（圖2 b）。恢復(fù)處理22 周時(shí)，割線基本恢復(fù)正常排膠，黃皮內(nèi)有效乳管列數(shù)進(jìn)一步增加，此時(shí)石細(xì)胞團(tuán)占黃皮面積的比例明顯降低，與部分排膠時(shí)相比，射線排列平行，黃皮內(nèi)乳管排列連續(xù)，膨大乳管占黃皮面積的比例降低（圖2 c）。

圖 2 死皮恢復(fù)過(guò)程中樹皮（橫切面）結(jié)構(gòu)的變化Fig. 2 The bark structure(cross section) change during the TPD recovery

2.2 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中平均單株膠乳產(chǎn)量及干膠含量的變化

從圖3 可以看出，1-MCP 處理死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，平均單株膠乳產(chǎn)量顯著增加。1-MCP處理前，死皮樹平均單株膠乳產(chǎn)量?jī)H為19.89 mL。1-MCP 處理16 周后，割線出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀，平均單株膠乳產(chǎn)量顯著增加至109.63 mL, 為處理前的5 倍多。隨著1-MCP 的進(jìn)一步處理，平均單株膠乳產(chǎn)量繼續(xù)顯著增加（P＜0.05），當(dāng)處理22 周后，割線全部恢復(fù)產(chǎn)膠時(shí)，平均單株膠乳產(chǎn)量達(dá)到151.17 mL，分別為處理前和處理16 周時(shí)平均單株膠乳產(chǎn)量的7.6 倍和1.4 倍左右；1-MCP 處理死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，干膠含量的變化呈先上升后下降趨勢(shì)。1-MCP 處理前，干膠含量為41.49%。處理16 周后，干膠含量上升至42.38%。隨著1-MCP的處理，當(dāng)割線全部恢復(fù)產(chǎn)膠時(shí)（1-MCP 處理22 周）干膠含量顯著下降至33.61%（P＜0.05），為對(duì)照死皮樹干膠含量的81%左右。

圖 3 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中膠乳產(chǎn)量和干膠含量的變化Fig. 3 The change of latex yield and dry rubber content during the recovery of the latex production of TPD trees

2.3 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷等生理參數(shù)的變化

由圖4 可知，1-MCP 處理死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，除粗酶液蛋白含量無(wú)明顯變化外，其他各生理參數(shù)均發(fā)生顯著變化。1-MCP 處理前死皮樹膠乳pH 值為最低值6.71。1-MCP 處理16 周后，膠乳pH 值顯著增加至7.20。1-MCP 處理16～22 周，膠乳pH 值無(wú)明顯改變。

1-MCP 處理死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量具有相同的變化趨勢(shì)，均呈先下降后上升趨勢(shì)。1-MCP 處理前，死皮樹硫醇和無(wú)機(jī)磷含量分別為0.64 mmol/L 和11.26 mmol/L。1-MCP處理16 周，割線出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀時(shí)，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量均顯著下降至最低值，分別為0.51 mmol/L 和3.96 mmol/L。當(dāng)1-MCP 處理22 周，割線完全恢復(fù)排膠后，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量均顯著增加至最大值，分別為1.19 mmol/L 和14.56 mmol/L，分別為16 周時(shí)硫醇和無(wú)機(jī)磷含量的2.3 倍和3.7 倍左右。

圖 4 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷等生理參數(shù)的變化Fig. 4 Changes of physiological parameters such as latex thiol content and inorganic phosphorus content during the recovery of the latex production of TPD trees

1-MCP 處理死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，蔗糖含量的變化趨勢(shì)與膠乳產(chǎn)量的變化趨勢(shì)一致，均呈顯著上升趨勢(shì)。1-MCP 處理前，蔗糖含量?jī)H為5.45 mmol/L。處理16 周后，蔗糖含量顯著上升至18.46 mmol/L，為處理前的3.4 倍左右。處理22 周后，蔗糖含量顯著上升至28.48 mmol/L，為處理前的5.2 倍左右。

黃色體破裂指數(shù)在1-MCP 處理前期（0～16周）無(wú)明顯改變。1-MCP 處理22 周后，黃色體破裂指數(shù)顯著下降至最低值，為13.47 %，僅為處理前黃色體破裂指數(shù)的30 %左右。

3 結(jié)論與討論

橡膠樹樹皮從外至內(nèi)分別為粗皮、砂皮外層、砂皮內(nèi)層、黃皮和水囊皮，正常產(chǎn)膠乳管主要分布于砂皮內(nèi)層和黃皮，其中黃皮中含有大量的成熟乳管，是樹皮的主要產(chǎn)膠部位。從割線癥狀的變化來(lái)看，1-MCP 處理由高濃度乙烯利刺激產(chǎn)生的死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，割線由內(nèi)向外逐漸恢復(fù)排膠；從樹皮顯微結(jié)構(gòu)的變化來(lái)看，恢復(fù)處理過(guò)程中黃皮有效乳管列數(shù)明顯增加，而石細(xì)胞和膨大乳管面積則明顯減少。割線癥狀和樹皮結(jié)構(gòu)的變化說(shuō)明死皮恢復(fù)過(guò)程中先是內(nèi)層乳管恢復(fù)排膠功能，然后逐漸向外層擴(kuò)展，外層乳管也逐漸恢復(fù)排膠功能，進(jìn)一步證實(shí)了1-MCP 能促進(jìn)死皮樹乳管系統(tǒng)恢復(fù)產(chǎn)膠功能[21]。

從總體來(lái)看，1-MCP 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，除膠乳pH 值、干膠含量和粗酶液蛋白含量外，其他各生理指標(biāo)變化趨勢(shì)均與高濃度乙烯利誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中的相應(yīng)生理指標(biāo)變化趨勢(shì)相反[20]。1-MCP 處理死皮植株恢復(fù)后，膠乳產(chǎn)量、硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量總體均呈上升趨勢(shì)，而干膠含量和黃色體破裂指數(shù)則顯著下降。劉輝等[28]采用死皮康復(fù)營(yíng)養(yǎng)劑（一種復(fù)合配方）處理膠園中自然死皮植株（非高濃度乙烯利刺激產(chǎn)生的死皮植株），結(jié)果顯示，該營(yíng)養(yǎng)劑能促進(jìn)死皮植株不同程度恢復(fù)產(chǎn)膠，且在死皮植株恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，膠乳產(chǎn)量、硫醇和無(wú)機(jī)磷含量也逐漸增加，干膠含量和黃色體破裂指數(shù)則逐漸降低，這與本研究的結(jié)果類似。說(shuō)明死皮恢復(fù)過(guò)程中各生理指標(biāo)逐步趨于正常值。

1-MCP 處理死皮植株后膠乳產(chǎn)量顯著增加，這說(shuō)明膠乳合成和再生能力提高，暗示了1-MCP對(duì)死皮植株具有良好的康復(fù)效果。李言等[13]發(fā)現(xiàn)，一種新型排膠調(diào)節(jié)劑能明顯提高膠樹的膠乳產(chǎn)量，且割面涂抹茶樹油也能增加膠乳產(chǎn)量[14]。這些結(jié)果與本研究的結(jié)果有類似之處。1-MCP 處理死皮植株16 周后，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量均顯著下降。隨后硫醇和無(wú)機(jī)磷含量又迅速增加，且顯著高于處理前的水平。硫醇是乳管系統(tǒng)有毒氧的清除劑，能保護(hù)細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)膠乳的穩(wěn)定性和排膠。硫醇含量在恢復(fù)1-MCP 處理22周后顯著上升至最大值，硫醇含量的增加可能大大提升了對(duì)乳管細(xì)胞過(guò)多有毒氧的清除，降低了有毒氧對(duì)乳管細(xì)胞的傷害，從而增強(qiáng)了乳管細(xì)胞的產(chǎn)膠能力[23]；無(wú)機(jī)磷含量的高低反映了乳管系統(tǒng)能量代謝的強(qiáng)弱。無(wú)機(jī)磷含量在1-MCP 處理22 周后顯著增加，暗示乳管系統(tǒng)的代謝能力增強(qiáng)，這可能進(jìn)一步促進(jìn)了膠乳的合成[29]。從當(dāng)前結(jié)果可以看出，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量均在1-MCP 處理22 周后達(dá)到最大值，而此時(shí)膠乳產(chǎn)量也為最高值，硫醇和無(wú)機(jī)磷含量的變化和膠乳產(chǎn)量的變化呈正相關(guān)。袁坤等[26]發(fā)現(xiàn)，死皮樹噴施INS 寶卡有機(jī)液肥后提高了膠乳中硫醇和無(wú)機(jī)磷的含量，這與本研究的結(jié)果一致。

蔗糖是合成橡膠的原料。蔗糖含量在1-MCP處理16 周和22 周后均顯著增加，暗示了死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中用于合成橡膠的前體不斷增加，膠乳的合成和再生能力不斷增強(qiáng)[9]，相應(yīng)的膠乳產(chǎn)量也在不斷增加，蔗糖含量的變化與膠乳產(chǎn)量的變化也呈正相關(guān)。覃懷德等[15]的研究表明，在橡膠樹割面上涂抹硫酸銅也能提高膠乳中蔗糖的含量；黃色體破裂指數(shù)是反映黃色體穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)，一般與膠乳產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)[8]。黃色體破裂指數(shù)增加，說(shuō)明膠乳穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致乳管堵塞而停止排膠[27]。死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠后，黃色體破裂指數(shù)顯著下降，暗示1-MCP 處理提高了黃色體的穩(wěn)定性和完整性，減少了黃色體破裂而導(dǎo)致的膠乳凝固，從而提高了膠乳產(chǎn)量。

從上述研究結(jié)果可以看出，1-MCP 促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中，除粗酶液蛋白含量無(wú)明顯變化外，其他各生理指標(biāo)均發(fā)生顯著變化。總體來(lái)看，在死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠前后，硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量的變化與膠乳產(chǎn)量的變化呈正相關(guān)，而黃色體破裂指數(shù)的變化則與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。因此，硫醇、無(wú)機(jī)磷、蔗糖和黃色體破裂指數(shù)等生理參數(shù)與死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程密切相關(guān)，在促進(jìn)死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。

死皮恢復(fù)過(guò)程中，從樹皮結(jié)構(gòu)的變化來(lái)看，黃皮有效乳管列數(shù)增加，石細(xì)胞和膨大乳管面積減少；從膠乳生理參數(shù)的變化來(lái)看，膠乳產(chǎn)量、硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量上升，黃色體破裂指數(shù)下降。這些結(jié)果說(shuō)明死皮恢復(fù)過(guò)程中樹皮結(jié)構(gòu)和膠乳生理逐步恢復(fù)正常，從解剖和生理學(xué)角度證實(shí)了1-MCP 能促進(jìn)高濃度乙烯利刺激產(chǎn)生的死皮樹恢復(fù)產(chǎn)膠。本研究結(jié)果不僅能為橡膠樹死皮恢復(fù)生理機(jī)制的闡明提供理論基礎(chǔ)，也能為開發(fā)高效死皮防治劑提供參考依據(jù)。