胡楊超氧化物歧化酶基因家族耐逆境的分子機(jī)理研究

魯松松 白麗霞 姚耀源 張曉瑋

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

逆境脅迫條件下，植物體主要依賴抗氧化系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)節(jié)來清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧（ROS）自由基，使細(xì)胞和組織免受氧化損傷[1-4]。植物體內(nèi)含有廣泛的酶和非酶的抗氧化系統(tǒng)，它們具有特殊的能力來避免ROS 的潛在負(fù)面影響，同時(shí)也能抑制其在多種情況下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[5]。目前，模式植物抗氧化系統(tǒng)的組成及其功能的研究已有大量報(bào)道，該系統(tǒng)的干擾或改變成為研究植物耐脅迫中ROS 信號(hào)通路的熱點(diǎn)之一。

超氧化物歧化酶（SOD）作為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和植物抗氧化反應(yīng)中起著重要的作用。SOD 催化超氧自由基（O2-）生成氧氣（O2）和H2O2。SOD 屬金屬酶家族，根據(jù)其活性部位金屬類型的不同可將植物SOD 分為Cu, Zn-SOD（CSD）、Mn-SOD（MSD）、Fe-SOD（FSD）3 個(gè)亞家族[6]。植物體內(nèi)超氧自由基主要來源于質(zhì)膜NADPH 氧化酶，以及葉綠體、線粒體和過氧化物酶體中的氧化和電子傳遞反應(yīng)[7-8]。亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明，SOD 主要在上述產(chǎn)生超氧自由基的細(xì)胞器中表達(dá)[9]。SOD 在產(chǎn)生超氧化物的細(xì)胞器中特異性表達(dá)和其被誘導(dǎo)表達(dá)的能力對(duì)植物抵抗非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程至關(guān)重要[10-11]。大量研究結(jié)果表明，非生物脅迫處理后植物耐逆性的升高均與SOD 活性的升高有關(guān)[10-11]。在NaCl脅迫條件下，與NaCl 敏感品種相比，豌豆（Pisum sativum）和番茄（Lycopersicon pennellii）NaCl 耐受品種的線粒體中MSD 活性均顯著升高[12-13]。此外長(zhǎng)時(shí)間NaCl 脅迫條件下，NaCl 耐受品種葉綠體中CSD 和FSD 活性顯著升高[14]。分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl 脅迫條件下，NaCl 耐受品種線粒體MSD，葉綠體CSD和FSD等抗氧化酶基因表達(dá)均顯著升高，而NaCl 敏感品種無顯著改變。

胡 楊（Populus euphratica） 隸 屬 于 柳 科（Salicaceae）楊屬，主要分布于我國(guó)西北干旱鹽堿的荒漠和戈壁地帶，是這些地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)中的主要高大喬木樹種[15]。經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇，胡楊具有較其他楊屬樹種更高的抗逆能力（抗鹽堿、抗高溫和抗干旱等），是研究植物耐逆性分子機(jī)制極好的天然材料[16]。關(guān)于SOD 酶活性對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)已有大量報(bào)道[6,17-22]，但截至目前，研究?jī)?nèi)容大多僅涉及鹽脅迫條件下SOD 酶活性的改變，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是在基因組及其轉(zhuǎn)錄物組學(xué)尺度的應(yīng)用為植物抗逆分子機(jī)理的研究提供了極大便利。本研究選擇已有基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的胡楊（P. euphratica）為對(duì)象，毛果楊（P. trichocarpa）、灰楊（P. pruinosa）、銀白楊（P. alba）、小葉楊（P. simonii）、美洲黑楊（P. deltoides）和紅皮柳（Salix purpurea）6 個(gè)楊柳科樹種為對(duì)照物種，結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄物組、蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)及同源建模等方法的比較分析，探索了胡楊SOD基因家族及蛋白質(zhì)對(duì)鹽脅迫條件響應(yīng)的分子生物學(xué)特征，以期為植物耐逆境的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SOD基因鑒定和DNA 序列獲取

從NCBI、Phytozome 和GigaScience 等數(shù)據(jù)庫(kù)下載胡楊（PopEup_1.0，NCBI）、毛果楊（Pop_tri_v3，NCBI）、灰楊（01.Ppr_genome，GigaScience）、銀白楊（ASM523922v1，NCBI）、小葉楊（Populus_simonii_2.0，NCBI）、美洲黑楊（Pde_NFU_2_2，NCBI）和紅皮柳（v1.0，Phytozome）全基因組組裝和注解文件，并構(gòu)建本地Blast 索引[23]。直接下載已注解基因組（胡楊、毛果楊、銀白楊和紅皮柳）中SOD基因DNA 序列及其預(yù)測(cè)的編碼區(qū)序列（CDS）和蛋白質(zhì)序列。利用NCBI 在線服務(wù)（Blastn 和Blastp）將CDS 和蛋白質(zhì)序列分別比對(duì)到非冗余核酸（NT）和蛋白質(zhì)庫(kù)（NR）以評(píng)估注解文件中對(duì)SOD基因注解的準(zhǔn)確性，Blast 參數(shù)evalue 設(shè)置為10-5。對(duì)于尚未注解基因組（小葉楊、美洲黑楊和灰楊），使用Blast 軟件將上述準(zhǔn)確注解的CDS 序列分別比對(duì)到基因組序列以確定各樹種包含SOD基因的基因組片段，提取基因片段然后使用GENSCAN 在線服務(wù)（http://hollywood.mit.edu/GEN SCAN.html）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)（設(shè)置擬南芥基因?yàn)閰?shù)文件）和注解[24]。當(dāng)比對(duì)文件中CDS 序列對(duì)齊的基因區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)提前終止密碼子時(shí)，認(rèn)定該基因?yàn)榧倩?。本研究還選用擬南芥（Arabidopsis thaliana）SOD基因作為進(jìn)化分析的外類群。

1.2 轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)獲取和基因表達(dá)量分析

為了分析SOD基因在耐鹽和非耐鹽楊屬樹種組織中的表達(dá)及對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的差別，本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了胡楊（耐鹽樹種，根組織：SRR5984052、SRR5984065 和SRR5984066；葉組織：SRR5983971、SRR5983972 和SRR5983973；愈傷組織：0 h SRR952753、6 h SRR952754、12 h SRR952725、24 h SRR952700～SRR952709 和48 h SRR952726）和對(duì)照樹種毛果楊（非耐鹽樹種，根組織：ERR1864412、ERR1864413 和ERR1864439；葉組織：ERR1864440、ERX1925298 和ERX1925 325；愈傷組織200 mmol/L NaCl 處理：0 h SRR 2029745、6 h SRR2029746、12 h SRR2029776、24 h SRR2029777 和48 h SRR2029778）轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序原始數(shù)據(jù)。使用自編Perl 語言腳本對(duì)原始數(shù)據(jù)中測(cè)序質(zhì)量值不高的Reads 進(jìn)行剔除，條件如下：未知堿基（N）超過總讀長(zhǎng)5%；低質(zhì)量堿基（＜7）超過總讀長(zhǎng)65%。

過濾后的數(shù)據(jù)使用Tophat 軟件（2.1.1 版本）比對(duì)到基因組序列，并用Samtools 軟件（1.10 版本）對(duì)輸出結(jié)果進(jìn)行排序，參數(shù)默認(rèn)設(shè)置[25-26]。使用Cufflinks 軟件（2.2.1 版本）分別組裝各樣本的轉(zhuǎn)錄本后，用Cuffmerge 套件將各樣品的轉(zhuǎn)錄本融合為單一轉(zhuǎn)錄組。最后使用Cuffdiff 套件計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量并分析不同組織/處理組間基因表達(dá)量的差異[27]。基因表達(dá)量表示為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments（FPKM）。在根和葉組織的比較分析中，本研究使用FDR 方法矯正后的P值作為評(píng)估差異顯著的依據(jù)，但由于愈傷組織鹽脅迫處理樣品沒有生物學(xué)重復(fù)，因此本研究所使用軟件是基于泊松分布簡(jiǎn)單模型給出的原始P值作為評(píng)估差異顯著的依據(jù)，當(dāng)P＜0.05 且樣本間FPKM 差異倍數(shù)大于2 時(shí)，認(rèn)為差異顯著。此外，F(xiàn)PKM ＜1 時(shí)，則認(rèn)為是不表達(dá)基因。

1.3 SOD基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建和結(jié)構(gòu)分析

SOD基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系構(gòu)建選用CDS 序列，序列對(duì)齊使用Mega 軟件（7.0）完成[28]，其中因CDS 區(qū)出現(xiàn)提前終止密碼子導(dǎo)致的假基因，使用與其他樹種CDS 序列對(duì)齊的基因區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系推斷使用MrBayes 軟件（3.2.7a）完成[29]；基因結(jié)構(gòu)繪制使用GSDS2.0 在線服務(wù)完成（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/），其 中Output（Phylogenetic Tree/Order）選項(xiàng)中選擇Tree 文件為上述貝葉斯法構(gòu)建的基因樹。

1.4 SOD 蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)序列物理化學(xué)性質(zhì)使用Expasy 在線服務(wù)（https://www.expasy.org）完成，主要包括分子質(zhì)量（MW）、等電點(diǎn)（pI）、總平均親水性（GRAVY）、氨 基酸 親水性（Hphob. / Kyte &Doolittle）和 極 性（Polarity / Grantham）。MSD蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用ESPript3.0 在線服務(wù)完成（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）。MSD 蛋白質(zhì)同源建模使用Modeller 軟件（9.24 版本）完成，模板選擇擬南芥MSD1 的X 射線晶體衍射結(jié)構(gòu)（Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)：4C7U）。設(shè)置a. ending model = 100，對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)建100個(gè)同源模型，采用GA341 和DOPE 方法對(duì)同源模型進(jìn)行評(píng)估并選擇最優(yōu)模型。蛋白質(zhì)同源模型結(jié)構(gòu)比較分析和可視化使用VMD 軟件（1.9.4a43版本）完成[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊柳科樹種SOD基因家族成員基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基因鑒定結(jié)果表明（表1），楊柳科樹種SOD家族包含CSD、MSD和FSD3 個(gè)亞家族，但在不同譜系中各亞家族成員經(jīng)歷不同的基因復(fù)制、刪除和假基因化事件。擬南芥基因組中包含9 個(gè)SOD基因，包括3 個(gè)CSD、4 個(gè)FSD和2 個(gè)MSD基因，分布于1～5 號(hào)染色體的不同區(qū)域。楊柳科7 個(gè)樹種基因組中至少包含12 個(gè)SOD基因，其中胡楊、毛果楊、灰楊、銀白楊和紅皮柳基因組中均包含12 個(gè)SOD基因，小葉楊和美洲黑楊基因組中均包含15 個(gè)SOD基因。為了便于描述，本研究將3 個(gè)亞家族成員用阿拉伯?dāng)?shù)字和大寫英文字母進(jìn)行了依次編號(hào)。

表 1 8 種植物的SOD 基因信息Table 1 Sources of SODgenes from 8 plant species

系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建結(jié)果如圖1 所示，CSD、FSD和MSD3 個(gè)亞家族成員分別聚為基因樹的3 個(gè)主要分支，Bootstrap 支持率分別為1.00、0.84 和0.99。在CSD基因分支中，楊柳科樹種CSD1/2、CSD3/6/7和CSD4/5基因分別與擬南芥CSD1、CSD2和CSD3基因聚為一支，表明在擬南芥和楊柳科樹種共同祖先中至少存在3 種類型的原CSD基因。楊屬樹種CSD3/4/5/6/7分支中均只包含單拷貝基因分支，為1∶1 的直系同源基因。楊柳科樹種CSD1和CSD22 個(gè)分支，在特定譜系中均出現(xiàn)較高頻率的旁系同源分支，說明這2 個(gè)基因在楊柳科樹種中較高頻率地發(fā)生過譜系特異性基因復(fù)制事件。在FSD基因分支中，楊柳科樹種FSD1/3和FSD2基因分別與擬南芥FSD1/3/3A和FSD2基 因 聚 為2 個(gè) 主 要 分 支（Bootstrap 值分別為0.92 和0.99），為1∶1 直系同源關(guān)系。楊柳科樹種FSD1基因分支中，小葉楊雙拷貝的FSD1基因（FSD1和FSD1A）聚為一支后，與其他科樹種的單拷貝FSD1基因呈現(xiàn)出姊妹分支關(guān)系，說明小葉楊2 個(gè)旁系同源FSD1基因是一次近期基因復(fù)制事件的產(chǎn)物。楊屬FSD3分支呈現(xiàn)出1∶1 直系同源關(guān)系，但紅皮柳FSD3基因分支丟失，丟失可能源于一次譜系特異性基因刪除事件，因?yàn)闂顚贅浞NFSD3基因分支起源早于紅皮柳FSD1基因?；诨蚪M注解文件結(jié)果，楊柳科樹種FSD3基因產(chǎn)生后在后代譜系中迅速被無功能化，甚至被徹底刪除，這符合復(fù)制基因的假基因化進(jìn)化命運(yùn)假說[31]。在MSD基因分支中，楊柳科樹種明顯聚為MSD1和MSD2基因2 個(gè)分支，但Bootstrap 值都較低分別為0.47 和0.40。其中，楊柳科樹種MSD1基因分支中各基因?yàn)?∶1 直系同源關(guān)系，該分支與擬南芥MSD1/2形成姊妹分支關(guān)系。在楊柳科樹種MSD2基因分支中，除小葉楊MSD2基因出現(xiàn)雙拷貝外，其他楊柳科樹種的MSD2基因均為1∶1 直系同源關(guān)系。

續(xù)表 1

圖 1 楊柳科植物SOD基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig. 1 Gene structure and phylogenetic relationship reconstruction of SODgenes in Salicaceae trees

2.2 胡楊和毛果楊根和葉組織中SOD基因的表達(dá)量

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載并分析胡楊和毛果楊（SOD家族基因個(gè)數(shù)均為12 個(gè)，且為1∶1 直系同源基因）根和葉組織的轉(zhuǎn)錄物組原始數(shù)據(jù)，以驗(yàn)證胡楊SOD基因的組織表達(dá)特征和推測(cè)的假基因化事件。表達(dá)量分析結(jié)果如表2 所示，SOD 家族各基因在胡楊和毛果楊根和葉組織中展現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在胡楊中，有7 個(gè)基因（CSD3、CSD4、CSD5、CSD6、CSD7、FSD1和FSD2）在根和葉組織中的表達(dá)差異顯著（log2leaf/root ＞ 1或 ＜-1 且P＜0.05），且與根組織相比，葉組織中的表達(dá)水平均被顯著下調(diào)。根和葉組織表達(dá)量處于前4 位的SOD 家族基因均為MSD2、MSD1、CSD7和CSD3（根組織中的FPKM 分別為178.94、105.67、29.87 和11.01；葉組織中的FPKM 分別為156.39、192.17、67.09 和51.33）。

表 2 SOD基因家族在胡楊和毛果楊根、葉組織的表達(dá)量差異分析Table 2 Expression level of SODgenes in root and leaf tissues of P. trichocarpaand P. euphratica

2.3 胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD基因?qū)aCl脅迫的響應(yīng)

為探索NaCl 脅迫對(duì)耐逆和不耐逆境楊屬樹種SOD基因表達(dá)的影響，本研究使用實(shí)驗(yàn)條件一致（愈傷組織，NaCl（200 mmol/L）處理48 h，采樣時(shí)間為0 、6 、12、24、48 h）的胡楊和毛果楊轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因表達(dá)量分析，結(jié)果見圖2。在0 h（對(duì)照組）時(shí)，與上述根和葉組織中的表達(dá)量分析結(jié)果相符，MSD1和MSD2基因仍是胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD家族的高表達(dá)基因（圖2c，毛果楊FPKM 分別為122.23 和77.28；圖2f，胡楊FPKM 分別為178.35 和51.35），而CSD和FSD兩個(gè)亞家族的主要表達(dá)基因與相應(yīng)樹種的根和葉組織相比明顯不同，胡楊CSD1和CSD2基因、毛果楊CSD2和FSD1基因的表達(dá)量處于前4 位，F(xiàn)PKM 分別為130.11、85.56、24.37和17.91（圖2a、d）。與根和葉組織相似，F(xiàn)SD亞家族基因在毛果楊和胡楊愈傷組織中的表達(dá)水平均相對(duì)較低（僅毛果楊FSD1基因的FPKM 超過10，圖2b），該結(jié)果表明FSD亞家族在楊屬樹種抗氧化酶系統(tǒng)中的功能可能處于次要地位。另外，在胡楊和毛果楊的根和葉組織中FSD3甚至不表達(dá)（表2，F(xiàn)PKM 值極低，范圍為0.11～1.85），該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)胡楊FSD3基因已被假基因化。

圖 2 毛果楊（a、b、c）和胡楊（d、e、f）愈傷組織中SOD基因表達(dá)對(duì)短期NaCl 脅迫的響應(yīng)Fig. 2 The expression of SODgenes in response to short-term NaCl stress from callus ofP. trichocarpa(a, b, c) and P. euphratica(d, e, f)

胡楊和毛果楊愈傷組織中SOD基因在短期鹽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)差異較為明顯。在CSD亞家族中，毛果楊（圖2a）多數(shù)基因均展現(xiàn)出上調(diào)（0～6 h）、下調(diào)（6～12 h，12～24 h）和再上調(diào)（24～48 h）的模式，而胡楊（圖2d）多數(shù)基因則展現(xiàn)出較為單一的調(diào)節(jié)模式，經(jīng)急性下調(diào)（0～6 h）后保持穩(wěn)定（6～48 h）。種內(nèi)各采樣時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較結(jié)果顯示（表3），毛果楊各基因的表達(dá)差異均不顯著，胡楊CSD1（0 h vs. 6/24/48 h）、CSD2（0 h vs. 12 h）和CSD7（0 h vs. 12 h）3 個(gè)基因被顯著下調(diào)，P＜0.05 且 log2FC ＞1 或 ＜-1（FC 為 差 異 倍 數(shù)）。在MSD亞 家 族中，毛果楊（圖2c）MSD1基因與CSD亞家族基因的表達(dá)模式一致，展現(xiàn)出上調(diào)（0～6 h）、下調(diào)（6～12 h）和再上調(diào)（12～48 h）的模式（兩兩比較差異不顯著），而胡楊（圖2f）MSD1基因則表現(xiàn)出連續(xù)上調(diào)的模式（0 h vs. 48 h 差異顯著）。此外，2 個(gè)樹種MSD2基因?qū)}脅迫條件響應(yīng)的敏感度均明顯低于MSD1基因。在FSD亞家族中，毛果楊FSD1基因的表達(dá)被連續(xù)抑制，兩兩比較結(jié)果顯示，0 h vs. 12/24/48 h 時(shí)差異均顯著（圖2b 和表3）。

表 3 NaCl 脅迫處理不同時(shí)間下胡楊和毛果楊SOD基因表達(dá)的種內(nèi)差異分析Table 3 Pairwise comparison analysis of SODgene expression levels in different periods of NaCl stress within species

2.4 MSD 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

截至目前，高等植物中僅擬南芥MSD 已有蛋白質(zhì)X 射線晶體衍射結(jié)構(gòu)（4C7U）。結(jié)構(gòu)文件顯示，擬南芥MSD 蛋白質(zhì)為同源四聚體結(jié)構(gòu)，每條多肽鏈活性中心有一個(gè)Mn2+。序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖3），基因預(yù)測(cè)多肽序列N 端的21～22個(gè)氨基酸殘基在結(jié)構(gòu)文件中丟失。與其他類群MSD 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件比較分析發(fā)現(xiàn)，人類（1N0J）和秀麗隱桿線蟲（3DC6）等也存在相似的現(xiàn)象，說明MSD 在體內(nèi)組裝成成熟蛋白質(zhì)的過程中存在加工修飾。楊屬樹種MSD2 與MSD1預(yù)測(cè)多肽序列的差異主要是N 端前12～15 4 個(gè)氨基酸殘基的缺失，因此2 種類型的MSD 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能差別不大。如果2 種MSD 蛋白質(zhì)在生物學(xué)功能上存在差異，那么功能的差異可能主要來自20 位以后氨基酸殘基的突變。

圖 3 楊屬6 種植物的MSD1 和MSD2 氨基酸序列分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment of MSD1 and MSD2 from 6 Populusspecies

胡楊和毛果楊MSD 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明（表4），2 個(gè)樹種的2 種MSD（MSD1 和MSD2）均為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，但穩(wěn)定性較差（不穩(wěn)定系數(shù)略小于40），其中胡楊2 種MSD（MSD1和MSD2 的不穩(wěn)定系數(shù)分別為36.12 和38.98）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性均高于毛果楊（MSD1 和MSD2 的不穩(wěn)定系數(shù)分別為37.86 和39.39）。與MSD2 相比，2 個(gè)樹種的MSD1 蛋白質(zhì)理論pI 均明顯降低（胡楊MSD1 和MSD2 分別為5.97 和5.77；毛果楊MSD1 和MSD2 分別為6.17 和5.91），蛋白質(zhì)堿性增強(qiáng)；GRAVY 數(shù)值均明顯降低（胡楊MSD1 和MSD2 分別為-0.465 和-0.514；毛果楊MSD1 和MSD2 分別為-0.476 和-0.519），蛋白質(zhì)親水性增強(qiáng)。蛋白質(zhì)氨基酸序列極性和親水性分析結(jié)果表明（圖4），2 個(gè)樹種MSD2 蛋白理論pI 和GRAVY 的降低與極性氨基酸（堿性）突變密切相關(guān)。

表 4 胡楊、毛果楊MSD1 和MSD2 的物理化學(xué)性質(zhì)比較Table 4 The physicochemical properties of MSD1 and MSD2 in P. trichocarpaand P. euphratica

圖 4 胡楊、毛果楊MSD1 和MSD2 多肽氨基酸殘基的親水性和極性分析Fig. 4 The hydrophilicity and polarity of amino acid residues in MSD1 and MSD2 polypeptides ofP. trichocarpaand P. euphratica

與毛果楊相比，胡楊MSD1 和MSD2 氨基酸序列分別有5 個(gè)（37I-V、97S-N、118T-A、187K-T和202H-N）和2 個(gè)（5S-T 和97R-N）位點(diǎn)突變，其中MSD1 的118T-A 為親水氨基酸到疏水氨基酸的突變，MSD1 的187K-T 和202H-N 以及MSD2 的97R-N 為堿性氨基酸到中性氨基酸的突變。蛋白同源模型比較分析結(jié)果（圖5）顯示，上述所有突變均位于蛋白質(zhì)亞基單體的表面，且遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)活性中心（Mn2+附近區(qū)域），推測(cè)胡楊2 種MSD 蛋白質(zhì)的氨基酸突變對(duì)酶活性的影響較小。值得注意的是，MSD1 靠近C 末端的187 和202 位以及MSD2 的97 位3 個(gè)突變位于四聚體的接觸面。其中MSD1（187K-T）和MSD2（97R-N）突變分別在AB/CD 和BD 亞基接觸面區(qū)域引入了1 個(gè)額外的氧原子，該氧原子可能通過與相鄰亞基區(qū)域形成額外的氫鍵穩(wěn)固亞基間的相互作用，但對(duì)亞基間的距離影響不大（毛果楊MSD1 的AB、CD 亞基中187Lys:Cα 和30Gln:Cα 的距離分別為7.54 和7.26 ?，MSD2 的BD 亞基97Arg:Cα 和2Gln:Cα 的距離分別為7.28和6.29 ?；胡楊MSD1 的AB、CD 亞基187Thr:Cα和30Gln:Cα的距離分別為7.55 和7.30?，MSD2的BD 亞基97Asn:Cα 和2Gln:Cα 的距離分別為7.64 和6.31 ?）。MSD2 的202H-N 突變?cè)贐D 亞基接觸面引入了2 個(gè)額外的氧原子，額外的與氧原子可能在該區(qū)域至少形成2 個(gè)額外的氫鍵，使該區(qū)域內(nèi)亞基相互作用增強(qiáng)。這種區(qū)域內(nèi)相互作用的增強(qiáng)最終拉近了B 和D 亞基間的距離（毛果楊BD 亞基202位2 個(gè)His:Cα 的距離為6.30，胡楊BD 亞基202位2 個(gè)Asn:Cα 的距離為5.54）使得BD 亞基間的剛性增強(qiáng)。

圖 5 胡楊和毛果楊MSD1 和MSD2 同源模型比較分析Fig. 5 Comparative analysis of MSD1 and MSD2 homology modeling from P. trichocarpaand P. euphratica

3 結(jié)論與討論

Scioli 等[32]對(duì)豌豆SOD基因cDNA 的成功克隆和鑒定標(biāo)志著植物SOD家族的研究進(jìn)入到基因水平。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用，逐步加深了人們對(duì)SOD在分子水平的認(rèn)識(shí)。在植物基因組中，盡管SOD基因家族均由CSD、FSD和MSD3 個(gè)基因亞家族組成，但各亞家族成員的數(shù)量存在較大差別，如番茄、高粱（Sorghum bicolor）、香蕉（Musa acuminata）和葡萄（Vitis vinifera）基因組中3 個(gè)亞家族成員組成模式分別為4-4-1、5-2-1、6-2-4和6-2-2[32-36]。與Molina-Rueda等[37]的研究結(jié)果相符，本研究在胡楊基因組中鑒定到12 個(gè)SOD基因家族成員，由7 個(gè)CSD、3 個(gè)FSD和2 個(gè)MSD基因組成，其中FSD3基因已假基因化。在另外5 種楊屬樹種中，毛果楊、灰楊和銀白楊3 個(gè)樹種基因組中SOD基因家族的數(shù)量與胡楊一致，灰楊和銀白楊（分別為CSD3和FSD3基因）中也有1 個(gè)基因被假基因化；小葉楊（CSD1和FSD1基因）和美洲黑楊（CSD1和CSD2基因）基因組中均有2 個(gè)基因發(fā)生過至少1 次基因復(fù)制事件。在基因樹中，楊柳科CSD1與CSD2、CSD3與CSD6/7、FSD1與FSD2、MSD1與MSD2分支互為旁系同源關(guān)系，這可能與楊柳科樹種在進(jìn)化歷史上發(fā)生過1 次全基因組復(fù)制事件密切相關(guān)[38]?；蚪M復(fù)制事件后，絕大多數(shù)SOD基因的旁系同源基因在后代譜系中保留（除FSD2和CSD4/5分支外）。值得注意的是，擬南芥在進(jìn)化歷史上發(fā)生過2 次全基因組復(fù)制事件（α 和β），理論上SOD基因家族應(yīng)成4 拷貝形式出現(xiàn)，但現(xiàn)存物種基因組中多數(shù)基因卻僅保留1～2 個(gè)拷貝。楊屬樹種中SOD這種優(yōu)先保留模式和通過單基因復(fù)制的擴(kuò)張模式可能暗示了它們?cè)诙嗄晟颈局参镏袑?duì)氧化脅迫響應(yīng)的重要性。

亞細(xì)胞定位研究結(jié)果顯示，擬南芥MSD主要在線粒體中表達(dá)，F(xiàn)SD主要在葉綠體中表達(dá)，CSD主要表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)（CSD1）和葉綠體（CSD2和CSD3）[39]。線粒體是機(jī)體有氧代謝的活性中心，為產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)之一，MSD在線粒體中的高表達(dá)對(duì)維持線粒體內(nèi)氧自由基平衡起到關(guān)鍵作用。與實(shí)時(shí)定量PCR 的研究結(jié)果相符[37]，MSD亞家族的2 個(gè)基因在胡楊根和葉組織中的表達(dá)均占優(yōu)勢(shì)，說明MSD可能作為胡楊SOD家族的組成型表達(dá)基因在各組織線粒體中均起到抗氧化的主導(dǎo)作用。在CSD基因亞家族中，毛果楊CSD2和CSD6基因在根和葉組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于胡楊（40.59 倍和4.30 倍）。該結(jié)果與對(duì)豌豆[14]的研究結(jié)果相符，長(zhǎng)期逆境脅迫引起CSD2酶活性的升高。毛果楊作為生長(zhǎng)最迅速的楊屬樹種，在適宜條件下根、葉組織中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主動(dòng)運(yùn)輸和光合速率可能遠(yuǎn)高于胡楊[40]，由此推測(cè)CSD2和CSD6可能在速生楊品種的主動(dòng)運(yùn)輸和合成代謝活躍的特定組織中長(zhǎng)期發(fā)揮功能，這符合CSD基因功能的進(jìn)化起源假說[41]。在FSD基因亞家族中，F(xiàn)SD1基因在胡楊葉組織中的表達(dá)量較高（FPKM 為22.64），約為毛果楊的3.14 倍；大量的研究結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)SD高表達(dá)可以有效保護(hù)葉綠體免受逆境脅迫引起的氧化損傷[42]，說明胡楊FSD1基因的高表達(dá)是其適應(yīng)逆境環(huán)境的特征之一。此外，在NaCl 短期脅迫條件下，胡楊愈傷組織中大部分基因呈現(xiàn)出波動(dòng)或下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，僅MSD1基因的表達(dá)被持續(xù)上調(diào)，說明在胡楊SOD基因家族中MSD1可能響應(yīng)鹽脅迫最敏感，是胡楊具有較強(qiáng)耐鹽脅迫能力的主要因素之一。上述結(jié)果與對(duì)鹽敏感和耐受的番茄和豌豆品種的比較分析結(jié)果高度相符[12-14]，說明MSD 酶活性的升高可能是鹽耐受品種普遍的適應(yīng)策略。

在胡楊和毛果楊中，MSD1 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性明顯高于MSD2，且胡楊的2 種MSD 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性均高于毛果楊。2 種MSD 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高具有相似的分子機(jī)制，均是通過發(fā)生在亞基間接觸位置的氨基酸突變引發(fā)的（不同的突變，相似的結(jié)果）。與毛果楊相比，胡楊MSD1（187K-T和202H-N）和MSD2（97R-N）3 個(gè)氨基酸突變均在亞基間接觸位置引入了額外的氧原子，這些額外的氧原子可能通過氫鍵相互作用使四聚體蛋白質(zhì)變得更穩(wěn)定。穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有利于2 種MSD 在有氧代謝活躍的線粒體中積累到更高的濃度，從而增加其在逆境條件下清除過量自由基的能力。因此，本研究推測(cè)胡楊MSD1 對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)涉及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的共同進(jìn)化，上述推測(cè)以及氨基酸突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。