黑麥GIF基因家族全基因組鑒定及其表達分析

楊赟杰,苗 涵,魏 萊,楊燕萍,車永和

(河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室/河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院,河北秦皇島 066600)

生長調(diào)節(jié)互作因子(GRF-interacting factor,GIF)屬于SSXT超家族的一類轉(zhuǎn)錄共激活因子[1],生長調(diào)節(jié)因子(growth-regulated factor,GRF)蛋白N端的QLQ結(jié)構(gòu)域特異識別GIF,并結(jié)合形成互作復(fù)合物,通過調(diào)控細胞周期來控制細胞的增殖,在莖尖分生組織發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[2-5]。

GIF基因家族最先在擬南芥中被鑒定出來,隨后在水稻[6-7]、小麥[8-9]等植物中也相繼被鑒定出來。擬南芥GIF家族由AtGIF1、AtGIF2和AtGIF3三個成員構(gòu)成,主要通過促進或維持細胞的分裂能力來調(diào)節(jié)擬南芥植物器官的大小[3],并且在生殖器官發(fā)育和配子細胞生成中有重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn),AtGIF1基因缺失后會導(dǎo)致葉片細胞數(shù)目減少,葉片變小,相反過表達AtGIF1則使葉片變大;AtGIF2和AtGIF3基因與AtGIF1基因的生物學(xué)功能類似,在細胞增殖和側(cè)生器官形成中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。水稻中OsGIF1基因?qū)Χ鄠€主要器官(葉、莖和籽粒)也具有正向調(diào)控作用[6-7,11-13]。

黑麥(SecaleL., 2n=2x=14)屬于禾本科小麥族,可適應(yīng)極端氣候與環(huán)境,在小麥品種改良中應(yīng)用廣泛,擁有雜交育種所需的全部基因庫[14]。黑麥基因組測序的完成[14-15],有助于在全基因組水平上對黑麥基因資源進行挖掘并利用。本研究利用最新發(fā)布的威寧黑麥基因組數(shù)據(jù)[15],對黑麥GIF基因家族成員進行鑒定,并對黑麥等6種禾本科植物及模式植物擬南芥GIF基因的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化以及共線性關(guān)系等方面進行分析,同時探討GIF基因家族成員在黑麥不同組織中的時空表達模式,以期為后續(xù)分析黑麥GIF基因的潛在功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 GIF基因家族成員的鑒定

從TAIR 數(shù)據(jù)庫 (http://www.arabidopsis.org) 下載擬南芥GIF基因家族成員的蛋白序列,從RAP數(shù)據(jù)庫 (http://rapdb.dna.affrc.go.jp/) 下載水稻GIF基因家族成員的蛋白序列,通過Ensembl Plants網(wǎng)站 (http://plants.ensembl.org/index.html) 獲取小麥、大麥、谷子、高粱和玉米的基因組注釋文件(GFF格式),從NGDC數(shù)據(jù)庫 (https://ngdc.cncb.ac.cn/) 下載黑麥 (威寧) 基因組數(shù)據(jù)。通過Pfam 網(wǎng)站(http://pfam.sanger.ac.uk/) 下載GIF家族蛋白SSXT (PF05030) 結(jié)構(gòu)域的HMM模型,利用HMMER v3.0軟件搜索GIF蛋白 (e-value<1e-5)。同時,將擬南芥GIF蛋白作為參考序列,采用NCBI網(wǎng)站的BLASTP進行比對,檢索同源蛋白。綜合HMMER和BLASTP的結(jié)果,用NCBI Conserve Domain 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)[16]和SMART用 (http://smart.embl.de/)[17]對篩選到的GIF蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域驗證,刪除不含SSXT結(jié)構(gòu)域的蛋白。用ExPASy 網(wǎng)站(https://www.expasy.org/)[18]分析黑麥GIF蛋白的分子量、等電點等理化性質(zhì)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0軟件內(nèi)置的Clustal_W工具[19]對黑麥、水稻、小麥、大麥、谷子、高粱、玉米及擬南芥的GIF蛋白序列進行比對分析,并采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000,用iTOL網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)對進化樹進行美化。

1.3 基因結(jié)構(gòu)分析

從基因組注釋文件中獲得黑麥GIF基因家族成員的內(nèi)含子、外顯子等信息,用GENE Structure Display Serve 2.0網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[20]將外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)可視化。用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)[21]分析黑麥GIF基因家族成員編碼蛋白的保守基序,采用默認參數(shù),最大基序數(shù)量設(shè)置為10。

1.4 染色體定位和共線性分析

根據(jù)下載的基因組和基因注釋文件信息,通過共線性掃描工具MCScan X對黑麥及其他7種植物進行基因重復(fù)事件分析,用TBtools軟件[22]將黑麥GIF家族成員定位到染色體上,使用該軟件內(nèi)置的Dual Synteny Plot 程序繪制物種間共線圖。用KaKs Calculator 2.0軟件[23]計算同源基因?qū)Φ腒a/Ks比值(Ka為非同義替換率,Ks為同義替換率)。

1.5 黑麥GIF基因順式作用元件分析

從黑麥基因組中獲取每個GIF基因CDS序列5’端上游2 000 bp的DNA序列,用PlantCARE數(shù)據(jù)庫 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[24]分析黑麥GIF基因的順式作用元件,手動整理,用GENE Structure Display Serve 2.0進行可視化。

1.6 黑麥GIF基因的表達模式分析

從小麥多組學(xué)網(wǎng)站 WheatOmics數(shù)據(jù)庫 (http://wheatomics.sdau.edu.cn/)[25]下載黑麥不同組織在不同發(fā)育時期的表達量數(shù)據(jù),以TPM (transcript per million)為表達水平單位,利用Graphpad Prism 9軟件繪制黑麥GIF基因的表達熱圖。

1.7 黑麥GIF蛋白的潛在磷酸化位點分析

用NetPhos 3.1 Server軟件 (http://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)[26-27]預(yù)測黑麥GIF蛋白潛在的磷酸化位點,參數(shù)設(shè)置均為默認。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑麥和其他7個代表性植物GIF基因家族成員的鑒定結(jié)果

根據(jù)擬南芥GIF蛋白序列,結(jié)合HMMER和BLASTP方法,結(jié)果共鑒定出3個黑麥GIF基因(表1),分布在4號和5號染色體上。根據(jù)這3個基因在基因座上的位置,分別命名為ScGIF1、ScGIF2和ScGIF3。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),3個黑麥GIF蛋白的氨基酸序列長度為184～226 aa,分子量為19 337.76～24 032.56 Da,等電點為4.83～5.22。

表1 黑麥GIF基因及其編碼蛋白的理化特征Table 1 Characteristics of ScGIF genes and their encoded proteins

在水稻、擬南芥、大麥、谷子、高粱和黑麥中均鑒定到3個GIF基因家族成員,而在玉米中鑒定到4個,在小麥中鑒定到8個。

2.2 黑麥和其他7個代表性植物GIF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建黑麥和其他7個代表性植物GIF蛋白的系統(tǒng)進化樹(圖1)。根據(jù)黑麥GIF家族成員在系統(tǒng)進化樹中的分布,將30個GIF基因家族成員劃分為Group A、Group B和Group C三大類,分別包含8、10和12個家族成員。在三個大類中均包含黑麥、小麥、水稻、玉米、高粱、大麥和谷子GIF基因,且黑麥、小麥和大麥的GIF基因聚在一個小分支中,說明黑麥與小麥、大麥的GIF基因家族親緣關(guān)系更近。擬南芥的GIF基因只存在于Group C中,說明GIF基因的分化是在雙子葉植物和單子葉植物分化之后。

At:擬南芥;Os:水稻;Ta:小麥;Hv:大麥;Si:谷子;Sb:高粱;Zm:玉米;Sc:黑麥。At: Arabidopsis thaliana; Os: Oryza sativa L.; Ta:Triticum aestivum L.; Hv: Hordeum vulgare L.; Si: Setaria italica L.; Sb: Sorghum bicolor L.; Zm:Zea mays L.; Sc: Secale cereale L..圖1 黑麥和其他7個代表性植物GIF蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of GIF proteins in rye and other seven representative plants

2.3 GIF基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

用MEME工具分析黑麥和其他7個代表性植物GIF蛋白的保守基序,結(jié)果(圖2)表明,30個GIF家族成員均包含基序1,Group A中的GIF蛋白均包含基序1、2、3、4和6,Group B中均包含基序1、2、3、4和7,而Group C中均只包含基序1。說明同類GIF蛋白含有的基序相對保守,推測不同類GIF蛋白基序種類的差異是物種進化的結(jié)果。

圖2 黑麥和其他7個代表性植物GIF蛋白的保守基序分析Fig.2 Conserved motif analysis of GIF proteins in rye and other seven representative plants

基因結(jié)構(gòu)是決定基因功能的重要因素[28]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,禾本科植物中GIF基因家族成員的外顯子數(shù)目相對穩(wěn)定,均含有4個;而擬南芥中AtGIF1、AtGIF2和AtGIF3基因分別含有4、6和5個(圖3)。擬南芥中AtGIF1與禾本科植物聚為一類,而AtGIF2和AtGIF3則單獨聚為一類,推測AtGIF1可能與禾本科植物中GIF基因家族成員在功能上具有相似性。

圖3 黑麥和其他7個代表性植物GIF基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene structure analysis of GIF gene family members in rye and other seven representative plants

2.4 黑麥和其他7個代表性植株的共線性分析

對黑麥和其他7個代表性植物進行共線性分析,結(jié)果(圖4)表明,黑麥和擬南芥GIF基因不存在共線性關(guān)系,但和小麥有6個共線性基因?qū)?和大麥有2個共線性基因?qū)?和水稻、玉米、高粱和谷子均只有1個共線性基因?qū)Α?/p>

灰色線條為兩個物種間所有的共線基因?qū)?紅色線條為黑麥GIF和對應(yīng)物種的共線基因?qū)?。Gray lines indicate the collinear gene pairs between two species, and red lines indicate the collinear gene pairs of GIF between rye and other species.圖4 黑麥和其他7個代表性植物GIF因家族成員的共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of GIF genes between rye and other seven representative plants

根據(jù)黑麥和其他物種GIF基因的共線性分析結(jié)果,共發(fā)現(xiàn)12個黑麥GIF基因的直系同源基因。Ka/Ks分析結(jié)果(表2)表明,這些GIF基因的Ka/Ks值均小于0.5,說明GIF基因在進化過程中經(jīng)歷了強烈的純化選擇,在功能上較為保守。

表2 黑麥與其他7個代表性植物間GIF基因的Ka、Ks和Ka/Ks值Table 2 Ka, Ks and Ka/Ks values of GIF genes between rye and other seven representative plants

2.5 黑麥GIF基因順式作用元件分析

用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析3個黑麥GIF基因上游2 000 bp啟動子區(qū)的順式作用元件。結(jié)果(圖5)共發(fā)現(xiàn)53個與激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,其中與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件有8種,包括ABRE、TGA-element、ERE、GARE-motif、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif和TCA-element;與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件有5種,包括TC-rich repeats、MBS、W box、ARE和WUN-motif。在3個黑麥GIF基因中,檢測到的ABA響應(yīng)元件ABRE的數(shù)目最多,ScGIF1、ScGIF2和ScGIF3基因中分別含有3、8和4個,推測黑麥GIF基因可能參與ABA代謝調(diào)控過程。

圖5 黑麥GIF基因啟動子區(qū)域順式作用元件的分布Fig.5 Distribution of cis-acting elements in the promoters of rye GIF genes

2.6 黑麥GIF基因在不同組織中的表達模式

為了解GIF基因在調(diào)節(jié)黑麥生長發(fā)育中的作用,通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析這些基因在不同組織中的表達模式,以log2(TPM+1)值作圖(圖6),可以看出,ScGIF1基因在穗中表達量較高(TPM>40),而在根、莖、葉和籽粒中表達量較低(TPM<10)或不表達;ScGIF2基因在莖中表達量最高,其次是根和莖,均達到了高表達水平(TPM>40),而在其他組織中為中表達水平(40>TPM>10);ScGIF3基因只在穗中達到了高表達水平(TPM>40),在其他組織中為中表達水平(40>TPM>10)。這表明黑麥GIF基因在不同組織中均有表達,其中ScGIF1基因表達表現(xiàn)出明顯的組織特異性,推測3個基因可能具有不同的功能。

Root:根;Leaf :葉片;Stem:莖;Spikelet:穗;Leaf.5DAS:播種后5 d的葉片;Leaf.10DAS:播種后10 d的葉片;Leaf.15DAS:播種后15 d的葉片;Seed.10DAF:花后10 d的籽粒;Seed.20DAF:花后20 d的籽粒;Seed.30DAF:花后30 d的籽粒;Seed.40DAF:花后40 d的籽粒。Leaf.5DAS: Leaf at 5 d after sowing; Leaf.10DAS: Leaf at 10 d after sowing; Leaf.15DAS: Leaf at 15 d after sowing; Seed.10DAF: Seed at 10 d after flowering; Seed.20DAF: Seed at 20 d after flowering; Seed.30DAF: Seed at 30 d after flowering; Seed.40DAF: Seed at 40 d after flowering.圖6 基于RNA-seq對黑麥不同組織GIF基因的表達譜分析Fig.6 Expression pattern analysis of GIF genes in different tissues of rye based on RNA-seq

2.7 黑麥GIF蛋白磷酸化位點分析

對黑麥GIF蛋白潛在的磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn),黑麥所有GIF蛋白中均含有磷酸化位點,其中磷酸化位點為絲氨酸數(shù)目最多,蘇氨酸次之,酪氨酸最少,且酪氨酸僅存在于ScGIF1和ScGIF3蛋白中。總體來看,ScGIF1蛋白含有的磷酸化位點最多,達29個;ScGIF2最少,僅有12個(表3)。

表3 黑麥GIF蛋白潛在的磷酸化位點數(shù)目Table 3 Number of potential phosphorylation sites in GIF proteins of rye

3 討論

測序技術(shù)的發(fā)展促進了在基因組水平上對植物基因家族的研究[28-30]。GIF基因家族已經(jīng)在多個物種中被鑒定出來,本研究首次在黑麥全基因組范圍內(nèi)搜索到3個GIF基因,在數(shù)量上與水稻、高粱、大麥、擬南芥和谷子大致相同,而在普通小麥中鑒定到8個,原因可能是普通小麥在形成異源六倍體基因組過程中,GIF基因經(jīng)歷了更長的進化時間。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中,同一分支中大部分GIF基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序,表明這些GIF基因的功能相似[31-32]。共線性分析發(fā)現(xiàn),黑麥GIF基因和擬南芥基因組中未發(fā)現(xiàn)共線性對,而與禾本科作物中均存在共線性基因?qū)?說明禾本科作物之間親緣關(guān)系更近,GIF基因的分化開始于單子葉植物和雙子葉植物分化完成之后。共線性基因?qū)Φ腒a/Ks分析發(fā)現(xiàn),GIF基因在進化過程中經(jīng)歷了強烈的純化選擇,推測其在功能上具有相似性。

位于基因上游的順式作用元件可以響應(yīng)不同的外部環(huán)境信號,進而在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達,影響植物的生長發(fā)育[28,33]。本研究發(fā)現(xiàn),在黑麥GIF基因上游啟動子區(qū)域有53個順式作用元件,與激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件分別有8種和5種。其中,ABA響應(yīng)元件ABRE數(shù)目最多,推測GIF基因在調(diào)節(jié)植物組織生長和發(fā)育過程中受ABA代謝的影響。

黑麥GIF基因在不同組織中廣泛表達,說明它們可能參與多種生理反應(yīng)。其中,ScGIF1的基因表達表現(xiàn)出組織特異性,其在穗中的表達量遠高于其他組織。系統(tǒng)進化分析表明,ScGIF1與水稻OsGIF1均屬于Group C,推測ScGIF1的功能與OsGIF1相似。He等[11]研究發(fā)現(xiàn),水稻OsGIF1與OsGRF4相互作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,調(diào)節(jié)下游基因表達來影響水稻的粒型。推測黑麥ScGIF1基因也可能通過調(diào)控穗的發(fā)育來影響粒型,可作為進一步研究黑麥穗發(fā)育和影響粒型的候選基因。Lu等[7]研究也發(fā)現(xiàn),水稻OsGIF1與OsGRF1協(xié)同作用,共同調(diào)節(jié)水稻葉的生長。而本研究中黑麥ScGIF1在葉中不表達,推測GIF1基因在不同物種中功能有所差異。

蛋白質(zhì)可以通過磷酸化調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和功能[34]。本研究發(fā)現(xiàn),黑麥GIF蛋白存在潛在的磷酸化位點,且在ScGIF1蛋白中磷酸化位點最多,推測ScGIF1蛋白可能通過磷酸化來調(diào)節(jié)生物學(xué)功能。下一步將對ScGIF1蛋白進行脫磷酸化試驗,來驗證其對黑麥穗發(fā)育和粒型的影響。黑麥GIF基因家族的具體功能及作用機制還需要進一步的研究。