新疆野生樺褐孔菌生物學(xué)特性及化學(xué)成分分析

華蘭蘭,林 青,時(shí)紅玲,王 娜,婁 愷,李金玉,霍向東

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830054;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是一種白腐真菌,屬于擔(dān)子菌綱銹革孔菌科,主要生長(zhǎng)于樺樹(shù)的樹(shù)干上[1],可耐受 -40℃的低溫,主要分布于N 45～50°的寒冷地帶,包括北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯(西西伯利亞、東部、堪察加半島),以及中國(guó)東北部(黑龍江省的小興安嶺和吉林省的長(zhǎng)白山)和日本(北海道)[2-3]。作為一種藥用真菌,樺褐孔菌含有多種生物活性成分,其提取物具有降血糖[2-4]、抗病毒[5]、抑菌[6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、保肝[11-12]等作用。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)前,關(guān)于樺褐孔菌菌核、菌絲體和發(fā)酵液活性物質(zhì)的成分報(bào)道雖多,如樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸等[3],但對(duì)樺褐孔菌總體化合物種類(lèi)的研究甚少。真菌所含有的大量有機(jī)化合物,不僅有藥用價(jià)值,對(duì)真菌自身也起著重要的生態(tài)和生理作用[13]。液體發(fā)酵是一種快速、可行的替代方法,可以獲得質(zhì)量一致的樺褐孔菌菌絲體[14]。【本研究切入點(diǎn)】樺褐孔菌資源稀少,藥用價(jià)值高,為加強(qiáng)該菌株的資源利用及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā),需對(duì)樺褐孔菌的生物學(xué)特性及化學(xué)成分進(jìn)行分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)新疆阿勒泰野生樺褐孔菌菌核進(jìn)行培養(yǎng)物分離、純化及鑒定,使用Biolog FF微孔板對(duì)菌絲體進(jìn)行碳源利用分析,經(jīng)液體培養(yǎng),獲得樺褐孔菌菌絲體和發(fā)酵液,采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法確定樺褐孔菌菌核、發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液的化學(xué)成分組成。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材 料

樺褐孔菌菌核采自新疆阿勒泰小東溝林場(chǎng)(47°56′N(xiāo), 88°07′E) ,實(shí)驗(yàn)室分離獲得純菌株,菌株編號(hào)為HS819;植物凝膠和吐溫40均購(gòu)自索萊寶(Solarbio)公司,其余試劑均為國(guó)藥分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

HVA-85高壓滅菌鍋(日本);SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司);Thermo Presco17臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó));DS-Ri2 Nikon顯微鏡(日本);GP306C-120-500電動(dòng)組織研磨器(生工生物工程股份有限公司);Biostack Ready濁度儀 (美國(guó));Microplate Reader讀數(shù)儀(美國(guó));SONICS VC130超聲波破碎儀(美國(guó));SHIMADZU SH-Rtx-Wax色譜柱(30 m*0.25 mm*0.25 μm),TQ8040NX三重四極桿型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(BA):樺樹(shù)皮粉末15 g/L,瓊脂20 g/L,水1 000 mL,121℃ 高壓滅菌20 min,使用前加入氨芐青霉素0.1 g;斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;PDA加富培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖25.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、酵母粉3.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、瓊脂25.0 g/L;種子培養(yǎng)液:葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,MgSO40.5 g/L,KH2PO42 g/L,pH 自然;發(fā)酵培養(yǎng)液:葡萄糖20.0 g/L,蛋白胨4.0 g/L,MgSO41.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,pH 自然;FF-IF 接種液:植物凝膠0.25%,吐溫40 0.03%,121℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 分離純化

選取新鮮的樺褐孔菌菌核,去除表面雜質(zhì),75%酒精清洗其外表面3次。采用組織分離法進(jìn)行分離。在無(wú)菌條件下,切取5 mm × 5 mm的菌核組織塊接入分離培養(yǎng)基, 置于28℃ 恒溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)5 d;挑取菌落邊緣,在PDA加富平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)10 d,并將分離、純化的菌株接種于PDA斜面,30℃遮光培養(yǎng),待菌株長(zhǎng)滿(mǎn)斜面后,放置4℃保存。

1.2.2 液體發(fā)酵

生長(zhǎng)于PDA加富平板上的菌落用打孔器打取直徑1 cm的菌餅4塊轉(zhuǎn)置50 mL離心管中,研磨后,加入5 mL無(wú)菌水混勻,接入500 mL錐形瓶中(100 mL種子培養(yǎng)基),在30℃,150 r/min 條件下培養(yǎng)3.5 d后將種子液轉(zhuǎn)置250 mL錐形瓶(100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基),接種量為10%,150 r/min,28℃培養(yǎng)10 d。

1.2.3 形態(tài)學(xué)

觀(guān)察菌株在固體平板上的生長(zhǎng)特征,包括菌落形態(tài)、菌絲顏色、滲出物顏色。以30～45°斜插入無(wú)菌的蓋玻片,28℃避光培養(yǎng),待菌絲體蔓上載玻片后,取出載玻片用尼康顯微鏡對(duì)菌絲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)拍照。

1.2.4 基于ITS序列的樺褐孔菌進(jìn)化

上海生工生物工程股份有限公司利用真菌ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’)擴(kuò)增并測(cè)序。ITS rDNA 序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為 OK586158;BLAST在線(xiàn)比對(duì)分析,利用MEGA 11.0軟件、以Neighbor-joining法(1000 bootstrap)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析同源關(guān)系。

1.2.5 碳源譜

制備Biolog FF板接種液[15],采用95種碳源Biolog FF微孔板分析樺褐孔菌菌株碳源利用情況。從PDA平板生長(zhǎng)菌落刮取菌絲體,轉(zhuǎn)置于含有500 μL FF-IF接種液的無(wú)菌EP管中,電動(dòng)手持式研磨機(jī)破碎,收集的菌絲體10 000 r/min離心10 min,棄上清,再次加入FF-IF接種液,離心去上清,重復(fù)該步驟兩次,將最終獲取的菌絲體沉淀懸浮于裝有4 mL接種液離心管中,靜置去除菌絲團(tuán)。用濁度儀將裝有10 mL FF-IF接種液的Biolog FF標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濁度調(diào)至100%后,加入菌絲體懸浮液將其濁度范圍調(diào)至75%T左右,將此懸浮液倒入V型加樣槽,迅速接種至Biolog FF板(每孔100 μL),28℃培養(yǎng)。

碳源利用活性:菌株利用碳源的能力,可用平均吸光值(AWCD)表示,通過(guò)計(jì)算和繪制菌株的AWCD值隨時(shí)間的變化,得到菌株利用碳源的平均活性[16]。菌株代謝活性用590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值表示,其中數(shù)值小于0時(shí)按0處理,計(jì)算方法:AWCD=Σ(C-R)/n,C為每個(gè)碳源孔的兩波段吸光度差值,R為對(duì)照孔的吸光度值,n為培養(yǎng)基碳源種類(lèi)數(shù),研究中為95[17]。 碳源的平均吸光值(AWCD)能反映微生物代謝活性,是利用單一碳源的重要指標(biāo),能衡量菌株對(duì)于不同碳源的總體利用能力[18]。繪制AWCD隨時(shí)間變化的曲線(xiàn),并通過(guò)方差分析不同時(shí)間點(diǎn)樣本間AWCD的差異。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 24軟件,繪圖應(yīng)用Origin 8.0軟件。

1.2.6 GC-MS

樣品前處理:取5 g樣品,加入50 mL石油醚(沸點(diǎn)30～60℃),振蕩混勻,超聲處理15 min,8000 rpm離心3 min,收集上清液,減壓濃縮至干,再加入1 mL石油醚溶解沉淀,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析。

GC條件:分流進(jìn)樣,分流比10∶1;進(jìn)樣口溫度為250℃,程序升溫:初始溫度為30℃,保持1 min,以5℃/min升至220℃,保持3 min,再以10℃/min升至250℃,保持5 min。

MS條件:EI電離源;載氣為He;吹掃流量3 mL/min;電子能量70 eV;離子源溫度200℃,接口溫度250℃。全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍為 50～600 amu;溶劑延遲2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HS819的形態(tài)學(xué)特征

研究表明,菌株HS819菌核無(wú)柄,表面有不規(guī)則溝痕,內(nèi)部黃色至黃褐色;經(jīng)組織分離,在BA板上菌絲呈白色,匍匐在培養(yǎng)基上;菌落初期白色,后逐漸變?yōu)闇\黃至黃褐色,而邊緣保持白色;菌絲在加富PDA平板上生長(zhǎng)較緩慢,28℃培養(yǎng)15 d直徑8.3 cm左右;背面有環(huán)橫紋出現(xiàn);在微分干涉學(xué)顯微鏡下(×400),菌絲粗壯,無(wú)可見(jiàn)孢子。圖1

注:A:菌核;B:BA生長(zhǎng)菌落;C:PDA加富平板生長(zhǎng)菌落(正面);D:PDA加富平板生長(zhǎng)菌落(背面);E:菌絲體(標(biāo)尺=20 μm)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

研究表明,菌株HS819的測(cè)序 ITS rDNA長(zhǎng)度為778 bp,在 NCBI 上BLAST的比對(duì)結(jié)果顯示與GenBank 中OP019327、OP019325、KC312697、MZ484606等樺褐孔菌菌株的序列相似度達(dá)99% 以上,且系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也表明該菌株與以上四株菌聚為一類(lèi)。確認(rèn)菌株HS819為樺褐孔菌。圖2

圖2 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育

2.3 樺褐孔菌菌株HS819碳源譜特征

2.3.1 樺褐孔菌菌株HS819代謝碳源平均活性

研究表明,前7 d樺褐孔菌對(duì)碳源利用率低,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),呈逐漸增加趨勢(shì),在第15 d利用率達(dá)到最高。圖3

圖3 樺褐孔菌菌株HS819利用 碳源平均吸光值變化

2.3.2 樺褐孔菌菌株HS819對(duì)碳源種類(lèi)利用

研究表明,菌株HS819能代謝95種測(cè)試碳源中的33種,其中7種碳源能夠被有效利用,17種碳源適度利用;其余碳源完全不能代謝,包括環(huán)式糊精(B1孔)、α-D-葡萄糖-1-磷酸(C1孔)和D-甘露醇(D1孔),赤蘚糖醇(B4)等,孔內(nèi)均無(wú)菌絲生長(zhǎng)。表1

表1 樺褐孔菌菌株HS819在Biolog FF微孔板中的碳底物利用

2.4 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819發(fā)酵液及菌絲體化學(xué)成分(表2)

2.4.1 野生樺褐孔菌菌核中化學(xué)成分及分析

研究表明,樺褐孔菌菌核43種化學(xué)成分中含有酸類(lèi)8種,烴類(lèi)21種、酯類(lèi)2種、醛類(lèi)2種、醇類(lèi)5種、其它5種。酸類(lèi)化合物占整體化合物的比例最大,達(dá)到66.07%;其次是烴類(lèi)占21.69%;醇類(lèi),醛類(lèi),酯類(lèi),分別占3.82%,2.03%,1.53%。酸類(lèi)化合物主要有亞油酸(24.39%)、反油酸(21.15%)、棕櫚酸(7.4%)等;角鯊烯(4.53%)是烴類(lèi)的主要化合物;醇類(lèi)化合物主要有二十七烷醇(1.55%)、葉綠醇(1.32%);醛類(lèi)化合物僅有順-7-十四烯醛和硬酯烷醛;脂類(lèi)化合物主要為乙酸二十八脂(1.06%)和鄰苯二甲酸異丁基環(huán)己基甲酯(0.47%)。其它化合物中二十烷基壬基醚(2.7%)、2,4-二叔丁基-苯酚(0.85%)等含量相對(duì)較高。

2.4.2 樺褐孔菌菌株HS819菌絲體中化學(xué)成分及分析

研究表明,發(fā)酵菌絲體39種化合物中含有酯類(lèi)6類(lèi),烴類(lèi)18種,酸類(lèi)6種,醇類(lèi)2種。酸類(lèi)化合物占整體化合物的比例最大,達(dá)到60.03%,其次是酯類(lèi)占30.72%,烴類(lèi)、醇類(lèi)分別占4.59%、1.04%。酸類(lèi)中含量較高的是油酸(28.76%)、棕櫚酸(18.51%)、反油酸(7.4%)等;脂類(lèi)主要有 (Z)-十八碳-9-烯內(nèi)酯(27.12%)、油酸乙酯(1.13%)、乙酸二十八烷基酯(1.06%)等;烴類(lèi)主要有1-十九烯(0.42%)、α-衣蘭油烯(0.2%)、正二十四烷(0.41%)、1,2-環(huán)氧十六烷(0.77%)等;醇類(lèi)有二十七烷醇(0.72%)、1-二十三烷醇(0.32%);其它化合物中依蘭酚(1.55%)的含量最高。

2.4.3 樺褐孔菌菌株HS819發(fā)酵液中化學(xué)成分及分析

研究表明,菌株HS819發(fā)酵液中38中化合物中含有烴類(lèi)20種、醇類(lèi)5種,酸類(lèi)3種、酯類(lèi)4種。烴類(lèi)化合物占整體化合物的比例最大,達(dá)到54.01%;其次是醇類(lèi)占8.24%,酯類(lèi)與酸類(lèi)分別占12.89%,7.72%。烴類(lèi)中含量較高的是11-甲基二十烷(7.11%)、三十五烷(7.44%)、正三十六烷(6.58%)、正二十四烷(4.89%)等;醇類(lèi)主要有二十七烷醇(3.05%)、葉綠醇(1.87%)、鯨蠟醇(0.78%)等;酯類(lèi)有四十三烷基七氟丁酸酯(2.36%)、十八碳酸乙烯基酯(5.04%)、4-甲氧基乙酸十三烷基酯(4.43%);酸類(lèi)主要有肉豆寇酸(3.06%)、棕櫚酸(3.3%)、油酸(1.36%)等;其他化合物中依蘭酚(8.39%)、2,4-二叔丁基-苯酚(2.16%)、十二烷基七聚乙二醇醚(2.57%)、肉豆蔻酰胺(2.1%)含量相對(duì)較高。

3 討 論

樺褐孔菌菌株HS819的碳代謝指紋圖譜表明,95種碳源中只有少量種類(lèi)能被代謝,且這些碳源基本參與了生命體的三個(gè)重要的碳代謝途徑。琥珀酸、琥珀酸甲基酯、α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸參與三羧酸循環(huán)(TCA);戊糖磷酸途徑(PPP)相關(guān)的一些碳源樺褐孔菌也可以使用,包括D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和D-木糖;其余的碳源(D-葡萄糖醛酸、α-D-乳糖、麥芽糖醇、肝糖、D-果糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、α-D-葡萄糖等)主要參與糖酵解途徑。

碳源是微生物營(yíng)養(yǎng)的基本組分,特定菌株同化某些碳源的能力可能與其在特定營(yíng)養(yǎng)條件下的競(jìng)爭(zhēng)力有關(guān)[17],例如與許多植物相關(guān)的真菌能分解并利用主要由纖維素和半纖維素組成的底物[19]。大型真菌的底物使用和代謝可表明其潛在的生態(tài)功能,了解菌株在自然界不同生態(tài)位條件下的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性有助于選擇培養(yǎng)基成分,以?xún)?yōu)化次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),例如為提高金針菇菌株的漆酶活性,利用 Biolog FF微孔板來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)條件[20]。樺褐孔菌可利用碳源中的α-D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸是纖維素或半纖維素的主要成分[21],這與樺褐孔菌主要生長(zhǎng)于樺樹(shù)上相一致。

研究發(fā)現(xiàn),野生樺褐孔菌菌核、菌絲體及其發(fā)酵液在化學(xué)成分種類(lèi)和含量上的差異明顯,這可能是樺褐孔菌基因在自然環(huán)境下和液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中差異性表達(dá)的結(jié)果[22]。例如1-碘-二十烷、1-碘癸烷及1,14-二溴十四烷僅存在于菌核中,其角鯊烯的含量是發(fā)酵液的1.1倍,而發(fā)酵液中的烴類(lèi)相對(duì)含量遠(yuǎn)多于菌核和菌絲體,α-衣蘭油烯則只在菌絲體中檢測(cè)到;菌絲體中的酯質(zhì)含量分別是菌核的20倍,發(fā)酵液的2.4倍,油酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸三十烷酯、鄰苯二甲酸二丁酯、(Z)-十八碳-9-烯內(nèi)酯僅存在于菌絲體中,而十八碳酸乙烯基酯、四十三烷基七氟丁酸酯,4-甲氧基乙酸十三烷基酯則只存在于發(fā)酵液中;菌核中有機(jī)酸的種類(lèi)多于菌絲體及發(fā)酵液,亞油酸和亞麻酸是菌核特有成分,油酸在菌絲體中的含量高達(dá)28.76%;順-7-十四烯醛和硬脂烷醛則只在菌核中存在。

表2 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819 菌絲體、發(fā)酵液中化學(xué)成分的定性 和定量變化

續(xù)表2 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819 菌絲體、發(fā)酵液中化學(xué)成分的定性 和定量變化

擔(dān)子菌胞外酶酶解木質(zhì)素所釋放的低聚物是真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)的合適底物,為獲取更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),真菌會(huì)抑制周?chē)?xì)菌的生長(zhǎng)[23],該現(xiàn)象也可能在樺褐孔菌中存在。例如:菌核中所特有的有機(jī)鹵素(1-碘二十烷、1,14-二溴十四烷及1-碘癸烷),有可能在木質(zhì)素的降解中起到中介作用[24],也可能抑制相互競(jìng)爭(zhēng)的真菌和細(xì)菌[23];菌核中所特有的醛類(lèi)物質(zhì)及其酸含量多于菌絲體,而這2類(lèi)物質(zhì)均有一定的抑菌活性[25],有研究表明高含量的油酸、亞油酸、棕櫚酸還能夠有效抑制腐生線(xiàn)蟲(chóng)[26]。在未來(lái)可嘗試挖掘這些化合物的生態(tài)功能,為樺褐孔菌的生長(zhǎng)和保護(hù)提供策略的同時(shí)也可開(kāi)發(fā)新的化學(xué)植物保護(hù)劑[27]。

真菌在自然環(huán)境和液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中基因的差異性表達(dá)可能與生物脅迫、生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)[28],如溫度會(huì)影響真菌的脂肪酸組成[29-30]。本研究結(jié)果顯示,野生菌核中不飽和脂肪的含量為49.6%,其中多不飽和脂肪酸的含量(亞麻酸、亞油酸)及單不飽和脂肪酸(油酸、棕櫚油酸)的含量分別占總不飽和脂肪酸含量的52.7%,47.29%;菌絲體及其發(fā)酵液中不飽和脂肪酸均為單不飽和脂肪酸,含量分別為36.64%,1.36%。樺褐孔菌菌核生長(zhǎng)在低溫環(huán)境,菌絲發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃,這與隨著培養(yǎng)溫度的降低,脂肪酸的不飽和度增加的觀(guān)點(diǎn)相一致[31-32],這些不飽和脂肪酸也可能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在降解木質(zhì)素的過(guò)程中發(fā)揮作用[33]。此外,本研究菌核中反油酸的相對(duì)含量高達(dá)21.15%,是菌絲體的2.9倍,反式脂肪酸的增多與自然環(huán)境中菌株的營(yíng)養(yǎng)缺乏有關(guān)[34]。在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中,菌絲體主要以菌塊、菌球形態(tài)存在,易于傳氧、傳質(zhì),菌絲體為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,酶系活躍。菌核直接長(zhǎng)于大氣中,靠菌托傳遞營(yíng)養(yǎng),為生殖生長(zhǎng)階段,酶系相對(duì)單一[28]。

4 結(jié) 論

新疆樺褐孔菌菌株HS819對(duì)D-核糖、水楊苷、D-纖維二糖等7種碳源的代謝能力最強(qiáng);酸類(lèi)是野生菌核及菌絲體的主要成分,分別占總成分的66.07% 和60.03%,在發(fā)酵液中,烴類(lèi)為主要成分,占54.01%。