不同產(chǎn)地、年限及加工方式的白及質(zhì)量評價

劉佳微, 曹國璠, 吳明開, 韓 雪, 劉 筱, 黃安林

(1.貴州大學農(nóng)學院, 貴陽 550025; 2.貴州省現(xiàn)代中藥材研究所/農(nóng)作物品種資源研究所, 貴陽 550025;3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院科技信息研究所, 貴陽 550025)

白及(BletillastriataL.)是蘭科(Orchidaceae)白及屬宿根草本植物,白及具有收斂、補血、止血、消腫等功效,外敷能治創(chuàng)傷出血,癰腫,燙傷,疔瘡等。白及中豐富的代謝產(chǎn)物具有多種藥用價值,如甘露聚糖、菲類化合物、多糖等具有抗流感病毒活性和抗腫瘤活性、抗菌鎮(zhèn)痛作用[1],而白及中主要成分就是白及多糖。姚李祥等[2]研究表明,盡管多糖含量與淀粉含量之間的正相關(guān)性較弱,但是由于其具有一定的統(tǒng)計學意義,因此可以考慮將淀粉含量作為白及質(zhì)量評價的候選指標。

白及主產(chǎn)于貴州、安徽、云南等地,因地理環(huán)境的不同,各地所產(chǎn)的白及品質(zhì)及化學成分會有所不同,張新秦等[3]對貴州產(chǎn)區(qū)的白及藥材進行多糖、浸出物和總酚含量的測定,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地間的白及品質(zhì)差異較大。除此之外,不同生長年限和加工方式對藥材質(zhì)量也會有影響[4-7]。因此,本研究比較不同產(chǎn)地、不同生長年限和不同加工方式的白及多糖、淀粉含量和抗氧化能力,為白及藥材的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

UV-1800 PC型紫外可見分光光度計(翱藝儀器有限公司)、電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、粉碎機、離心機、水浴鍋、濃硫酸、無水乙醇、總多糖含量測定試劑盒、植物淀粉含量試劑盒、總抗氧化能力(DPPH法)試劑盒、羥自由基清除能力測定試劑盒(試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)、蒸餾水、實驗所用白及樣品分別為來自桐梓、普安、天柱、湄潭、安龍的一年生、多年生白及。

2 實驗方法

2.1 白及樣品處理

將各產(chǎn)地各生長年限的白及剪須根、洗凈,開水煮至無白心后,取出冷卻,各樣品一半置于電熱鼓風干燥箱內(nèi)65 ℃烘干,另一半于自然光下曬干,待完全干燥,將其粉碎后備用。

2.2 多糖含量測定

2.2.1總多糖提取

取各白及粉末樣品0.05 g,加入1 mL蒸餾水,充分勻漿。100 ℃水浴2 h(防止水分流失),冷卻后10 000 g離心10 min,取上清0.2 mL,加入0.8 mL的無水乙醇混勻后4 ℃靜置過夜,10 000 g離心10 min,棄上清,沉淀中加入1 mL蒸餾水,充分混勻溶解沉淀。

2.2.2測定步驟

(1)分光光度計預熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至490 nm,用蒸餾水調(diào)零;

(2)冷卻。于490 nm下測定吸光值A。

2.2.3總多糖含量的計算

以葡萄糖為對照,標準條件下測定回歸方程為y=15.962x-0.003 7,R2=0.997 3,x為葡萄糖含量(mg/mL),y為吸光值。

總多糖含量=(A+0.003 7)÷15.962×V1÷V2×V3÷W×1 000

V1:醇沉后重新溶解后的體積;V2:進行醇沉的體積;V3:提取時加入水的體積;W:樣本質(zhì)量;1 000毫克到微克的換算系數(shù)。

2.3 淀粉含量測定

2.3.1淀粉提取

淀粉含量測定使用植物淀粉含量試劑盒。

(1)稱取0.1～0.2 g新鮮樣本于研缽中研碎,加入1 mL試劑一,充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中,80 ℃水浴30 min,3 000 g,25 ℃離心5 min,棄上清。

(2)沉淀中加入0.5 mL蒸餾水,95 ℃水浴15 min(以防止水分散失)。

(3)冷卻后,加入0.35 mL試劑二,25 ℃提取15 min,震蕩3～5次。

(4)加入0.85 mL蒸餾水,混勻,3 000 g,25 ℃離心10 min,取上清液待測。

注:如樣本為淀粉含量較高的干樣,為保證充分提取,可適當減小取樣量,如稱取0.01～0.02 g干樣。

2.3.2測定步驟

(1)分光光度計預熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至620 nm,蒸餾水調(diào)零。

(2)工作液的配置:臨用前在試劑三中加入7.5 mL蒸餾水后,緩慢加入42.5 mL濃硫酸,不斷攪拌,充分溶解,4 ℃保存?zhèn)溆?

(3)樣本測定:取0.2 mL樣本和1 mL工作液至EP管中,95 ℃水浴10 min(防止水分散失),冷卻至室溫,在620 nm波長下測定吸光度值A。

2.3.3淀粉含量的計算

標準條件下測定的回歸方程為y=5.872x-0.029 5;x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。

(1)按照蛋白濃度計算

淀粉含量=[(A+0.029 5)×V1]÷5.872÷(V1×Cpr)

(2)按樣本鮮重計算

淀粉含量=[(A+0.029 5)×V1]÷5.872÷(W×V1÷V2)

V1為加入反應體系中樣本體積;V2為加入提取液體積;Cpr為樣本蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);W為樣本質(zhì)量(g)。

注意:若吸光值大于2,請將樣本用提取液稀釋后再測定,計算公式中乘以相應的稀釋倍數(shù)。

提取液的配置:0.35 mL試劑一+1.35 mL水。

2.4 多糖總抗氧化能力(DPPH法)的測定

2.4.1總多糖提取

提取步驟見2.2.1。

2.4.2測定步驟

(1)分光光度計預熱30 min,調(diào)節(jié)波長至515 nm。

(2)DPPH自由基清除能力體系見表1。

表1 DPPH自由基清除能力反應體系

表2 羥自由基清除能力反應體系

充分混勻,室溫避光反應20 min,測定515 nm吸光值,ΔA=A空白-A測定

注:若A測定小于0.2,需用提取液稀釋后檢測。

2.4.3總抗氧化能力的計算

(1)以自由基清除率表示

DPPH自由基清除率/%=[(A空白-A測定)/A空白]×100%

(2)以標準曲線上獲得的抗氧化劑Trolox的量來表示樣本的DPPH自由基清除能力。

標準曲線:y=1.414 4x-0.008 1,R2=0.997 7,x:Trolox濃度(μmol/ml),y:吸光值差值ΔA。

單位定義:用從標準曲線上獲得的抗氧化劑Trolox的量來表示樣本的DPPH自由基清除能力。

a.按樣本質(zhì)量計算:

總抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

b.按樣本蛋白濃度計算

總抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V樣÷(V樣÷V樣總×Cpr)

c.按細胞計算

總抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量(萬個))

d.按液體體積計算

總抗氧化能力=(ΔA+0.008 1)÷1.414 4

V樣總為加入提取液體積;V樣為反應中樣品體積;W為樣品質(zhì)量(g);Cpr為樣本蛋白濃度(mg/mL)。

2.5 羥自由基清除能力的測定

2.5.1總多糖提取

提取步驟見2.2.1。

2.5.2測定步驟

(1)分光光度計預熱30 min,調(diào)節(jié)波長至510 nm,蒸餾水調(diào)零

(2)操作表(在EP管中進行)

混勻,37 ℃保溫20 min,測定510 nm處吸光值,對照管、空白管和測定管的吸光值分別記為A對、A空和A測。

注:空白管和對照管只需測定一次。

2.5.3羥自由基清除能力的計算

羥自由基清除率/%=[(A對-A測)/(A對-A空)]×100%

2.5.4數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010、SPSS 22.0和origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)的處理分析和繪制圖表

3 結(jié)果與討論

由圖1可知,各產(chǎn)地白及塊莖的總多糖含量和淀粉含量不同,5個產(chǎn)地的總多糖含量由大到小依次為桐梓、安龍、普安、天柱、湄潭,其中,桐梓和安龍白及塊莖總多糖含量差異不顯著且相較其他產(chǎn)地具有一定優(yōu)勢,分別為708.02 mg/g和632.09 mg/g。此外,普安和天柱白及塊莖中總多糖含量也較高,而湄潭的白及塊莖中總多糖含量最低,為331.46 mg/g。

圖1 不同產(chǎn)地白及總多糖和淀粉含量

通過對比各產(chǎn)地的淀粉含量,從大到小依次為安龍、桐梓、天柱、普安、湄潭,發(fā)現(xiàn)安龍的白及塊莖中淀粉含量為498.77 mg/g,顯著高于其他產(chǎn)地,湄潭的淀粉含量最低,為199.75 mg/g。

圖2可知,通過測定白及塊莖中多糖的總抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的抗氧化能力也不相同,DPPH自由基清除率從大到小依次是桐梓、安龍、普安、天柱、湄潭,安龍、普安、桐梓這幾個地方差異不顯著,與其他幾個地方差異顯著,而羥自由基清除率從大到小為普安、桐梓、安龍、天柱、湄潭,其中,普安和桐梓這兩個地方差異不明顯。

圖2 不同產(chǎn)地白及的抗氧化能力

白及由于受到不同產(chǎn)地溫度、濕度、氣候、地域等因子的影響,在總多糖、淀粉含量和抗氧化能力方面存在一定的差異性。桐梓地處亞熱帶季風濕潤氣候區(qū),四季分明,氣候溫和濕潤,雨量充沛,日照充足,無霜期長,推測基于桐梓特殊的地理位置和氣候條件等,其白及的品質(zhì)較優(yōu)。

從圖3可以看出,一年生和多年生白及的各物質(zhì)含量差異顯著,總多糖含量和淀粉含量隨種植年限的增加整體呈降低的趨勢,一年生白及塊莖的總多糖和淀粉含量較高,分別為596.81 mg/g、409.28 mg/g。

圖3 不同年限白及總多糖和淀粉含量

圖4 不同年限白及的抗氧化能力

從抗氧化能力看來,一年生白及和多年生白及的抗氧化能力差異并不顯著,但一年生白及的抗氧化性較多年生較高。

綜合看來,一年生白及無論是在物質(zhì)含量上還是在抗氧化能力上都比多年生白及好。白及作為多年生草本植物,推測其隨著種植年限的增加,土壤中的理化性質(zhì)在發(fā)生變化,導致白及塊莖中有效成分的含量會受到一定的影響。

由圖5可知,烘干和曬干后的白及塊莖總多糖含量差異顯著,且曬干后的白及總多糖含量較高,為605.18 mg/g,而這兩種加工方式對其淀粉含量影響不大。

圖5 不同加工方式白及各物質(zhì)含量

由圖6可知,烘干和曬干后的白及的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率之間差異不顯著。

圖6 不同加工方式白及抗氧化能力

4 小 結(jié)

白及藥材分布較為廣泛,相關(guān)文獻報道,植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累受產(chǎn)地、品種、基因等多個因素的影響[8],通過本研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地白及的多糖、淀粉含量不同,說明白及中有效成分的積累與產(chǎn)地有著較大的關(guān)系。同時,5個不同產(chǎn)地的白及塊莖中的總多糖均表現(xiàn)出不同的抗氧化活性,但其抗氧化能力都比較低,推測多糖可能不是白及中主要的抗氧化物質(zhì)。

白及作為多年生草本植物,不同種植年限影響著中藥材的藥用價值[9]。實驗結(jié)果表明,隨著種植年限的增加,白及的多糖和淀粉含量逐漸降低,其抗氧化活性也在降低,可能是隨著生長年限的增加,植物光合作用的速率下降,如氣孔和非氣孔限制(葉片衰老),使得單糖合成減少[10]。同時,隨著種植年限的增加,土壤肥力下降,導致白及的營養(yǎng)吸收減少,從而影響了白及的物質(zhì)積累。白及從種植到采收周期較長,而選擇最佳種植年限的白及可以更加充分地利用該資源,發(fā)揮更好的藥效,顯著提高白及藥材的質(zhì)量,對白及多糖的質(zhì)量控制及其臨床應用提供保障。

白及在生產(chǎn)中常用加工方式為采收洗凈煮至無白心后烘干、貯藏,不同加工方式對藥材有效成分的積累也有影響[11],實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)烘干和曬干后的白及多糖含量存在差異,曬干后的白及多糖含量較高,曬干成本低且耗能小,綜合考慮白及的有效成分含量和抗氧化能力的差異,自然曬干后的白及塊莖品質(zhì)較好,烘干后的白及塊莖總多糖含量降低,可能是由于長時間的低溫烘干,導致多糖中的糖苷鍵發(fā)生斷裂。本著節(jié)約資源的原則,在白及的初加工過程中,若量較少應選擇曬干的方式,若量較多烘干時的溫度不宜太高,且在烘干過程中應適時翻動,保證白及能夠及時干燥。