耐鹽解磷菌篩選鑒定及生理特性研究

王宏燕，韓凱鑫，馮麗榮，于志鵬，王 露，范金霞，章圣龍，孫 巖

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江國宏節(jié)能環(huán)保有限公司，哈爾濱 150000；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生豬養(yǎng)殖設(shè)施工程重點實驗室，哈爾濱 150030）

我國農(nóng)耕土壤鹽堿化面積逐步升高[1]。隨著人口增長和土壤退化，人均耕地面積減少，鹽堿地改良至關(guān)重要?？屯粮牧?、灌溉排水和添加改良劑等傳統(tǒng)的改良鹽堿地方式成本較高，實效性低，易造成土壤二次污染，破壞生態(tài)環(huán)境。微生物改良鹽堿地節(jié)約能源、改良效果佳、持久性較強，保護土壤環(huán)境。在鹽堿土壤中，高濃度鹽基離子通過吸附作用降低土壤有效磷活性，導(dǎo)致磷元素脅迫性，作物對磷肥利用率僅為5%~25%[2]。解磷菌代謝產(chǎn)物通常包含較多有機酸，其分泌降低植物根際土壤pH，將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷供植物吸收利用，促進植物生長，改善土壤環(huán)境。

國內(nèi)外關(guān)于微生物菌劑改良鹽堿土，促進植物生長已有大量研究。目前，篩選耐鹽堿解磷菌主要有單胞菌屬、假單胞菌屬及芽孢桿菌屬等。逄煥成等研究表明，施加微生物菌劑降低鹽堿土含鹽量和pH，增加土壤速效氮、速效磷、速效鉀含量，表明微生物改良鹽堿土具有可行性[3]。Wang等研究表明，在NaCl 脅迫下，接種芽孢桿菌（Ba?cillussp.）明顯增加作物產(chǎn)量[4]。Sahay 等在鹽堿土中，使用3株耐鹽堿解磷菌接種萬壽菊，均不同程度促進萬壽菊生長，促進萬壽菊對磷的吸收，增加土壤酶活性，改善鹽堿土土壤性質(zhì)[5]。Tripathi等研究表明，土壤鹽堿度在較大程度上影響微生物群落及其活性[6]。Naz 等從巴基斯坦凱沃拉鹽場分離3 株具有解磷能力的假單胞菌（Pseudomonas），3株菌均具有分泌生長素（IAA）、赤霉素（GA）、反式玉米蛋白核苷（t-zr）和脫落酸（ABA）能力[7]。Nautiyal 等從鹽堿土中分離出10% NaCl 濃度，pH 12 條件下可生長的解磷細(xì)菌，表明產(chǎn)酸促進磷酸鹽增溶[8]。我國鹽堿土壤中分離得到多種解磷菌。張巍等從松嫩平原地區(qū)鹽堿土中分離出2株耐鹽堿解磷菌[9]。胡山等從河西走廊鹽堿土中篩選得到一株高效解磷菌，研究發(fā)現(xiàn)菌株容磷量和pH呈顯著負(fù)相關(guān)[10]。李學(xué)平等從黃河三角洲鹽堿土中分離篩選出一株解磷菌[11]。趙飛等從濱海鹽堿土中篩選到具有溶磷能力的鱗質(zhì)霉菌（Apophysomycessp.）[12]。劉長霞等從濱海鹽堿土壤中分離得到一株在10%NaCl鹽分濃度條件下仍有較好解磷能力的真菌[13]。Zhu等從中國黃海岸大橋鹽場分離得到嗜鹽解磷細(xì)菌（Kushneriasp.），在20% NaCl 鹽分濃度，pH 4~10條件下仍正常生長[14]。鹽堿環(huán)境中可存活微生物可提高鹽堿土壤中難溶性磷利用率，促進植物生長。目前，東北地區(qū)蘇打鹽堿土主要通過物理灌溉、石膏和生物炭改良，對耐鹽堿解磷菌研究和應(yīng)用較少。

本試驗從鹽堿土中篩選高效解磷菌株，觀察篩選菌株菌落形態(tài)，研究菌株生理特性并對菌種作分子生物學(xué)鑒定，測定菌株溶磷能力、培養(yǎng)液pH 及菌株生長量變化，分析菌株解磷能力與溶液pH 和菌株生長量之間相關(guān)性，測定菌株分泌IAA、胞外多糖和產(chǎn)酸能力及菌株對種子萌發(fā)的促生效果，測定菌株耐鹽堿能力，以期為耐鹽堿解磷微生物菌肥研發(fā)提供菌種資源，克服外源菌劑在鹽堿土壤中存活率低的現(xiàn)狀，為鹽堿土地改良作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品取自黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣雙河農(nóng)場鹽堿土壤（含鹽量：1.54 g·kg-1；pH：9.23），采樣深度15~20 cm，將采集土壤樣品立即放入無菌塑料袋中，封口，放于實驗室內(nèi)4 ℃冰箱保存，用于篩選解無機磷細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

①蒙金娜無機磷培養(yǎng)基（Pikovskaya's medi?um，以下簡稱“PVK 培養(yǎng)基”）：葡萄糖10.00 g，（NH4）2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.00 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。

②LB 培養(yǎng)基：溶菌肉湯培養(yǎng)基（Luria-Ber?tani；以下簡稱“LB培養(yǎng)基”）：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。

培養(yǎng)基配方為液體培養(yǎng)基，在以上配方內(nèi)加入20 g瓊脂即為固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌初篩

稱取10 g采集土壤，放入含有90 mL無菌水滅菌三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)20 min后靜置30 min，其上清液即為10-1g·mL-1土壤稀釋液，采用10 倍系列稀釋，分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8g·mL-1土壤懸液，吸取0.1 mL 懸液涂布至PVK 固體平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d。用已滅菌接種環(huán)挑取固態(tài)平板中有明顯透明圈的單菌落，在PVK 固體平板培養(yǎng)基上劃線作純化培養(yǎng)，依次重復(fù)此操作5 次以上，直至固體平板上生長為單菌落，結(jié)束純化。將已純化菌株接種于LB 斜面培養(yǎng)基中，放于4 ℃冰箱保存。

將已分離純化單株解磷菌接種于PVK液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，無菌水調(diào)節(jié)所有菌株菌懸液一致（均為1×108CFU·mL-1），吸取20 μL 菌懸液，接種于PVK 固體平板培養(yǎng)基中央，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每個菌株進行3次重復(fù)處理。5 d后，測定菌株菌落直徑（D）及其形成的溶磷圈直徑（d），計算溶磷指數(shù)（Phosphate solubilizing index，PSI）[15]。

式中，PSI-溶磷指數(shù)；D-菌落直徑（cm）；d-溶磷菌圈直徑（cm）。

1.2.2 解磷菌株復(fù)篩

挑取初篩得到菌株，將其接種于已滅菌有LB液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h獲得接種液，稀釋菌株OD600為1.0；按照1%接種量接種至PVK 液體培養(yǎng)基（調(diào)節(jié)pH 為7.0）中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d，采用鉬銻抗比色法測定菌株溶磷量[16]，最終確定高效穩(wěn)定的解磷菌株。

1.2.3 解磷菌株鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中試驗方法對菌株進行葡萄糖、蔗糖利用、氧化酶試驗、VP 試驗、MR 試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸雙水解酶試驗和賴氨酸脫羧酶試驗[17]。通過透視電鏡和16S rRNA 序列分析法進行菌株形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。

1.2.4 解磷菌解磷能力、pH、菌體生長量測定

將分離菌株接入LB 培養(yǎng)基中進行活化，無菌水稀釋菌株OD600為1.0，按1%接種量接入PVK 液體培養(yǎng)基中，對照組接入等量無菌水，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)168 h。從培養(yǎng)開始每間隔24 h 取樣一次，分別測定菌株生長量（OD600）和溶磷量及培養(yǎng)液pH。采用鉬銻抗比色法測定菌株溶磷量。

1.2.5 解磷菌株分泌生長因子特性

①IAA 含量測定：采用Sackowski 比色法測定菌株分泌IAA 能力[18]。將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基（含L-色氨酸）中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d，3次重復(fù)試驗，無菌水調(diào)節(jié)菌懸液OD600為1.0。取菌株懸液置于離心管中，之后于高速離心機4 000 r·min-1離心10 min。吸取2 mL上清液于試管中，加入等量Sackowski 顯色劑，搖勻，避光靜置30 min，測定OD530分光光度值計算菌株分泌IAA含量。

②菌株分泌胞外多糖能力測定：采用苯酚-硫酸法[19]。將菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d，之后用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液OD600為1.0，于高速離心機中4 500 r·min-1離心15 min，加入80%三氯乙酸于上清液中使其濃度為4%，4 ℃靜置24 h，于高速離心機中10 000 r·min-1離心20 min，用等量去離子水溶解收集紅色沉淀，透析得到粗多糖。吸取粗多糖溶液1 mL，之后加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，混合均勻，20 min 后于波長490 nm 處測定吸光度值，計算菌株分泌多糖含量。

③菌株產(chǎn)酸能力測定：采用高效液相色譜法測定菌株產(chǎn)有機酸能力[20]。將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d，無菌水調(diào)節(jié)菌懸液OD600為1.0。將其置于高速離心機中10 000 r·min-1離心10 min，之后吸取上清液過0.22 μm 濾膜后上機。液相色譜柱為SVEA AQ 柱；檢測器為DAD；柱溫設(shè)置為40 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.5 mL·min-1；波長設(shè)置為210 nm；流動相使用10 mmol·L-1K2HPO4（pH=2.55）。測定菌株產(chǎn)甲酸、丙酸、丁酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸含量。

④植株出芽率及芽長測定方法

菌株菌懸液配制：將菌株接種到LB 液體培養(yǎng)液中，30 ℃，180 r·min-1，恒溫?fù)u床培育3 d；菌懸液在4 000 r·min-1下離心15 min。取離心前發(fā)酵液（無菌水稀釋活菌密度為1×109CFU·mL-1），離心后上清液及用無菌水稀釋底部菌體（無菌水稀釋活菌密度為1×109CFU·mL-1），備用。

供試白菜型油菜種子處理：篩選大小相同種子若干粒，乙醇浸泡1 min消毒后，繼續(xù)將其浸泡于5%次氯酸鈉溶液中2 min作消毒處理，無菌水沖洗3~4次，將沖洗的種子置于滅菌濾紙上作干燥處理（所有操作保持無菌處理）。

發(fā)芽試驗：將經(jīng)消毒處理的白菜型油菜種子分別用上述發(fā)酵液、上清液和菌液浸泡6 h，以無菌水處理作為對照（CK）。將浸泡的白菜型油菜種子放在置于底部鋪有雙層滅菌濾紙培養(yǎng)皿中，每皿隨機放入20 粒種子，重復(fù)3 次，并在種子上覆蓋一層濾紙，用無菌水潤濕濾紙，置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天澆適量水（每皿水量保持一致），在4 d 后測定種子發(fā)芽勢，7 d 后，測定種子芽長，統(tǒng)計種子發(fā)芽率。

1.2.6 解磷菌株耐鹽堿試驗

耐鹽試驗：按照沈萍等方法測定耐鹽性[21]。將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子液，無菌水調(diào)節(jié)菌液OD600值為1.0，然后按1%接種量接種到含有不同NaCl濃度梯度（5%、8%、10%）PVK液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測定菌株OD600及其溶磷量。

耐堿試驗：按照潘媛媛等方法測定耐堿性[22]。將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子液，使用無菌水調(diào)節(jié)菌液OD600值為1.0，然后按1%接種量接種到含有不同pH（pH=8、9、10）PVK 培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測定菌株OD600及其溶磷量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

利 用SPSS 21.0、Microsoft Office 2016 和ORI?GIN2019對數(shù)據(jù)進行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌分離篩選

經(jīng)初步分離純化，得到53 株可在PVK 固體平板上生長菌株。溶磷指數(shù)（PSI）是判斷菌株溶磷能力的指標(biāo)，PSI值越大，其溶磷能力越強。根據(jù)平板法，將分離純化的菌株單菌落培養(yǎng)，篩選出4株溶磷能力較好菌株。根據(jù)公式計算初篩4 株菌的PSI，結(jié)果見表1。其中PSI最大菌株是P-W13，為2.06，P-K21、P-X24 和P-H10 的PSI 分 別 為1.68、1.62、1.56。測定這4 株菌在發(fā)酵上清液中的溶磷量進行復(fù)篩，結(jié)果如表1所示，解磷能力較強的是P-W13，溶磷量為86.23 mg·L-1；其余處理溶磷量分別為84.87、62.29、81.99 mg·L-1（均小于86.23 mg·L-1）。

表1 解磷菌篩選結(jié)果Table 1 Screening results of phosphate solubilizing bacteria

2.2 菌種形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

解磷細(xì)菌P-W13 菌落形態(tài)及透射電鏡圖片如圖1 所示。觀察其形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)-W13 在平板上呈圓形、光滑、半透明、白色、邊緣整齊的菌落（見圖1A）。圖1B為菌株電鏡圖，觀察發(fā)現(xiàn)，PW13 菌體細(xì)胞多呈桿狀、末端較方；成短鏈；無莢膜、菌落大、扁平。

圖1 解磷菌株P(guān)-W13菌落形態(tài)及其透射電鏡圖Fig.1 Colony morphology and transmission electron microscopy of strain P-W13

菌株可利用葡萄糖、蔗糖為碳源。甲基紅、明膠液化、硝酸鹽還原及精氨酸雙水解酶試驗均為陽性，氧化酶、V-P、硫化氫產(chǎn)生及賴氨酸脫羧酶試驗均為陰性。

解磷細(xì)菌P-W13 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，提取P-W13 基因序列與GenBank 中近緣種序列進行同源性比對，選取相似度最高的幾株菌序列利用MEGA 進行同源性對比并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2 所示。菌株P(guān)-W13 基因序列與LC415612（En?terobacter asbburiaeM4-VN）、MW429195（Entero?bactersp. strainLAM2022）和MH169128（Enterobac?ter cloacaestrain NP07）親緣關(guān)系最近，可確定菌株P(guān)-W13為腸桿菌屬（Enterobactersp.）。

圖2 解磷菌株P(guān)-W13同源性分析Fig.2 Homological analysis of phosphate-solubilizing strain P-W13

2.3 解磷細(xì)菌P-W13解磷能力分析

解磷細(xì)菌P-W13 在解磷液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)168 h，結(jié)果如圖3A 所示，對照組溶磷量變化較小，保持在0.67~0.68 mg·L-1，解磷細(xì)菌P-W13有較好解磷能力，P-W13 溶磷量隨培養(yǎng)時間增加，溶磷量增加，在72~120 h 溶磷量增加較為明顯，隨時間增加，在第144 h表現(xiàn)出最大溶磷量89.86 mg·L-1，之后，溶磷量開始下降。解磷細(xì)菌P-W13結(jié)果表明，該菌株在144 h時達到最優(yōu)解磷能力。

圖3 解磷細(xì)菌P-W13在168 h內(nèi)溶磷量、pH和OD600變化Fig.3 Changes of dissolved phosphorus amount,pH and OD600 of P-W13 in 168 h

如圖3B 所示，培養(yǎng)168 h 內(nèi)，對照組pH 保持在7.0左右，無明顯變化；解磷細(xì)菌P-W13培養(yǎng)液pH 呈逐漸下降趨勢，解磷細(xì)菌P-W13 培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液pH已降至6.15，培養(yǎng)液pH和培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)，培養(yǎng)168 h后，培養(yǎng)液pH降至4.80。隨培養(yǎng)時間增加，解磷細(xì)菌P-W13 生長量呈上升趨勢，在144 h時增至最大值（OD600為2.23），之后隨培養(yǎng)時間增加，解磷細(xì)菌P-W13 生長量逐步降低。解磷細(xì)菌P-W13 解磷能力在第144 h 達到最強，表明解磷細(xì)菌P-W13 解磷能力與其生長狀況一致。

2.4 解磷過程中溶液pH、菌體生長量變化

如圖4A所示，將解磷細(xì)菌P-W13溶磷量與培養(yǎng)液pH 進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者存在極顯著負(fù)相關(guān)（R2=0.776，P<0.01）。如圖4B所示，將解磷細(xì)菌P-W13溶磷量與其生長量OD600進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者存在極顯著正相關(guān)（R2=0.918，P<0.01）。

圖4 菌株溶磷量和培養(yǎng)液pH、菌株OD600相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of dissolved phosphorus amount with pH of medium and OD600 of strain

2.5 解磷菌株分泌生長因子

如表2所示，解磷細(xì)菌P-W13分泌IAA含量和胞外多糖，含量分別為42.01 和72.55 mg·L-1。同時，細(xì)菌P-W13 能產(chǎn)生富馬酸、丁二酸和丙酸，其分泌丙酸含量最高，為1518.2 mg·L-1，分泌富馬酸和丁二酸含量分別為386.2 和94.2 mg·L-1。菌株P(guān)-W13 具有分泌胞外多糖的能力，研究發(fā)現(xiàn)，具有分泌胞外多糖的菌株分泌的有些多糖類物質(zhì)具有吸收無機鹽作用，對鹽堿地改良促進作用明顯[23]。不同解磷細(xì)菌同時分泌多種有機酸降低土壤pH，提高磷利用率，但不同菌株分泌有機酸的種類和含量之間存在差異。解磷細(xì)菌P-W13 具有分泌富馬酸、丁二酸和丙酸能力，其他研究中產(chǎn)生這些有機酸的報道較少。初步判斷菌株P(guān)-W13 通過分泌有機酸降低pH從而溶解無機磷，提高溶磷量。

表2 解磷細(xì)菌P-W13分泌生長因子含量Table 2 Growth factors content secreted by P-W13

解磷細(xì)菌P-W13 不同處理下對白菜型油菜種子促生長能力如表3 所示。與CK 相比，經(jīng)菌株P(guān)-W13 發(fā)酵液、上清液和菌體處理后的白菜型油菜種子其發(fā)芽率、根長、芽長均比未經(jīng)處理的白菜型油菜種子高，其中菌株P(guān)-W13 上清液可顯著提高種子發(fā)芽率、芽長和根長，上清液相比對照發(fā)芽率、芽長和根長分別提高6.06%、35.97%和28.52%；P-W13 菌體也可促進種子萌發(fā)，菌體處理組與對照相比發(fā)芽率、芽長和根長分別提高18.18%、17.99%和28.52%；經(jīng)菌株P(guān)-W13發(fā)酵液處理的種子發(fā)芽率、芽長、根長相比對照分別提高5.68%、68.35%、94.10%。菌株P(guān)-W13 發(fā)酵液對番茄種子促生作用顯著。

表3 解磷細(xì)菌P-W13對白菜型油菜發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根長的影響Table 3 Effects of phosphorus solution-bacteria P-W13 on germination potential,germination rate,bud length and root length of Brassica napus L.

2.6 解磷菌株耐鹽堿性能試驗

將解磷細(xì)菌P-W13 分別接種于不同含鹽量PVK液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，在5%、8%和10%NaCl鹽分濃度下，解磷細(xì)菌P-W13生長正常，菌株生長良好。如圖5所示，隨鹽分濃度升高，菌株生長量逐漸降低。在5%、8%和10%NaCl鹽分濃度下，解磷細(xì)菌P-W13溶磷量呈現(xiàn)下降趨勢，其溶磷量分別為74.84、66.32 和57.09 mg·L-1。解磷細(xì)菌P-W13在5%NaCl鹽分濃度下生長量和溶磷量均最高。

圖5 解磷菌株P(guān)-W13在不同鹽度下溶磷量和光密度變化Fig.5 Changes of dissolved phosphorus amount and OD600 of P-W13 strain at different salinities

根據(jù)對NaCl 耐受能力，微生物可分為：非嗜鹽微生物（NaCl 濃度<0.2 mol·L-1）、輕度嗜鹽微生物（NaCl 濃度為0.2~0.5 mol·L-1）、中度嗜鹽微生物（NaCl 濃度為0.2~2.5 mol·L-1）和極端嗜鹽微生物（NaCl 濃度為2.5~5.2 mol·L-1）[24]。解磷細(xì)菌P-W13在10%（1.7 mol·L-1）NaCl鹽分濃度下正常生長。在濃度為0.5~2.5 mol·L-1NaCl溶液中菌株統(tǒng)稱為耐鹽菌標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌P-W13屬于耐鹽解磷菌。

將解磷細(xì)菌P-W13分別接種于不同pH的PVK液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，在pH 為8、9 和10 時，解磷細(xì)菌P-W13 正常生長，菌株生長良好。如圖6所示，隨pH 升高，菌株生長量逐漸降低。pH 為8、9和10時，解磷細(xì)菌P-W13溶磷量下降，其溶磷量分別為86.47、74.94 和61.42 mg·L-1。pH 為8時，解磷細(xì)菌P-W13生長量和溶磷量均最高。

圖6 解磷菌株P(guān)-W13在不同pH下溶磷量和光密度OD600變化Fig.6 Changes of dissolved phosphorus amount and OD600 of P-W13 strain at different pH

根據(jù)對pH 耐受能力，微生物可分為：耐堿微生物（pH 7~9 生長，pH>9.5 不能生長）和嗜堿微生物（pH 10~12 生長）[24]。解磷細(xì)菌P-W13 在pH達到10時生長。根據(jù)在pH 7~12條件下生長的菌株統(tǒng)稱為耐堿菌的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌P-W13 屬于耐堿解磷菌。

3 討 論

研究表明，細(xì)菌P-W13在培養(yǎng)第144 h達到最大溶磷量，之后溶磷量開始下降，賀夢醒等研究解磷菌株B25在第96 h解磷能力達到最大值，之后下降并趨于穩(wěn)定，與本試驗結(jié)果一致[25]。這可能因碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗及菌體本身生長繁殖受抑制等，導(dǎo)致菌株溶磷量降低。

目前研究中解磷菌數(shù)量眾多，解磷過程復(fù)雜，解磷機理具有多樣性。目前解磷菌通過直接氧化或者氧化呼吸作用分泌代謝產(chǎn)物或者分泌檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等小分子有機酸降低pH 溶解無機磷是比較常見的途徑[26]。研究表明，在東北黑土和暗黑棕土壤中，細(xì)菌分泌草酸、蘋果酸和檸檬酸可使土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的有效磷，提高磷利用效率[24]。Lee 等篩選出分泌乳酸、乙酸和檸檬酸的解磷細(xì)菌提高磷的利用效率[27]。Yang等研究表明，菌株分泌草酸顯著溶解難溶性磷[28]。研究發(fā)現(xiàn)，菌株分泌葡萄糖酸也提高磷利用效率。檸檬酸在鹽堿化土壤上與土壤表面金屬離子絡(luò)合，有效降低離子濃度及其活性，緩解土壤鹽害，為作物提供良好土壤環(huán)境；葡萄糖酸與鈣、鋅等金屬離子合成可溶性鹽；草酸可結(jié)合堿土金屬元素，降低其溶解性[29-31]。本研究中解磷細(xì)菌P-W13具有分泌富馬酸、丁二酸和丙酸的能力，富馬酸有強緩沖作用，降低土壤溶液pH；丁二酸促進植物生長，調(diào)節(jié)養(yǎng)分、增加抗旱、抗病、抗凍能力；丙酸對黃曲霉、某些好氣性芽孢桿菌、沙門氏菌及酵母菌均有較好抑制作用，可合成酯類及其衍生的中間體，丙酸酯可廣泛用于農(nóng)藥除草劑、樹脂改性劑、滅菌劑等[32-34]，其他研究中解磷菌產(chǎn)生有機酸的報道較少。初步判斷通過產(chǎn)生有機酸降低pH，隨培養(yǎng)時間增加，解磷細(xì)菌P-W13溶磷量和pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)，姜煥煥研究耐鹽堿解磷菌改良鹽堿土效果時發(fā)現(xiàn)以磷酸三鈣為磷源的培養(yǎng)基中可溶性磷含量與pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)，分析其原因可能是無機磷溶解作用機制主要是因釋放低分子質(zhì)量有機酸，降低培養(yǎng)液pH[24]。這與本研究解磷細(xì)菌P-W13溶磷量與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)一致。培養(yǎng)液介質(zhì)pH 降低是溶解無機磷的重要條件，但不是必須有酸產(chǎn)生才溶解無機磷。賀夢醒等研究發(fā)現(xiàn)具有解磷功能芽孢桿菌的解磷能力與培養(yǎng)液pH 之間存在相關(guān)性[25]，但并未達到顯著水平，可能在培養(yǎng)過程中解磷菌除分泌低分子有機酸降低pH 溶解難溶性磷之外，還存在其他解磷機理，有待深入研究。

胞外多糖屬于微生物次級代謝產(chǎn)物，對作物根際具有保護作用。李文謙等研究菌株分泌胞外多糖含量是54.2 mg·L-1[35]。本文研究解磷菌株P(guān)-W13 分泌胞外多糖含量為72.55 mg·L-1，其分泌胞外多糖能力較優(yōu)。Rojas-Tapias 等研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿土壤中，接種菌劑后玉米與對照相比，接種菌劑的玉米生長效果更優(yōu)，與菌株能分泌胞外多糖相關(guān)[36]。研究表明，分泌胞外多糖的微生物與金屬離子復(fù)合，抑制難溶性磷酸鹽形成，提高磷利用率[37]。因此，具有分泌胞外多糖特性的解磷菌株增加可利用磷含量，提高磷酸三鈣溶解率。

IAA 屬于植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物細(xì)胞分裂、伸長、分化和種子萌發(fā)等方面具有重要作用。姜煥煥研究解磷菌TPM26分泌IAA含量為11.6 mg·L-1[24]。本研究表明，土壤中解磷細(xì)菌P-W13 分泌IAA 含量為41.67 mg·L-1。菌株發(fā)酵液、上清液及菌體在白菜型油菜發(fā)芽試驗中，經(jīng)菌株處理的白菜型油菜種子發(fā)芽勢、根長、芽長及發(fā)芽率均提高，其中菌株P(guān)-W13發(fā)酵液處理對白菜型油菜種子促生顯著，其種子發(fā)芽率、芽長、根長相比對照分別提高5.68%、68.35%、94.10%。姜煥煥研究中發(fā)現(xiàn)分泌IAA 菌 株TPM26 促 進 花 生 種 子 萌 發(fā)[24]。Bahadur 等研究解磷菌株分泌IAA并促進根長增加，提高營養(yǎng)元素利用率，促進植物在鹽堿土中生長[38]。王向英等研究解磷菌株對玉米生長具有顯著促進效果，表明分泌IAA的解磷菌株能夠促進植物生長[39]。

后續(xù)將探究溫度對篩選菌株溶磷能力的影響。將本文篩選得到的菌株，接種至鹽堿土后測定土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)變化，分析接種菌劑對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，探究菌株對改良鹽堿土壤的效果，以期為高效耐鹽堿解磷微生物菌肥研發(fā)提供優(yōu)良微生物菌種資源。

4 結(jié) 論

a.從鹽堿土壤中篩選得到一株解磷細(xì)菌P-W13，觀察菌落形態(tài)和經(jīng)16S rRNA 序列對比，該菌株屬于腸桿菌（Enterobactersp.）。

b. 細(xì)菌P-W13 在第6 天達到最大溶磷量89.86 mg·L-1，其溶磷量與溶液pH、OD 之間均存在顯著相關(guān)性。

c.細(xì)菌P-W13 在5% NaCl 鹽分濃度和pH 為8時解磷能力最強，在10%NaCl鹽分濃度和pH為10時仍表現(xiàn)出較好的解磷能力，細(xì)菌P-W13 具有較強耐鹽堿性，屬于耐鹽堿解磷菌。

d.菌株P(guān)-W13具有分泌IAA的能力，產(chǎn)生IAA含量為42.10 mg·L-1；其分泌胞外多糖含量為72.55 mg·L-1；同時產(chǎn)生富馬酸、丁二酸和丙酸，其產(chǎn)生丙酸含量最高，為1 518.2 mg·L-1；產(chǎn)生富馬酸和丁二酸含量分別為386.2 和94.2 mg·L-1；經(jīng)菌株P(guān)-W13 處理后的白菜型油菜種子其發(fā)芽率、根長、芽長均有提高，且菌種發(fā)酵液促生效果優(yōu)于上清液。