基于RhoA/ROCK通路探究復方中藥對腹水綜合征肉雞肝纖維化的影響

王慧敏，崔 亮，韓宇峰，張 劍，王珂瑤，鄧瑞強，康 杰，郭東清，段智變

（山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801）

肉雞腹水綜合征（Ascites syndrome，AS）是一種營養(yǎng)代謝疾病，由遺傳、缺氧、低溫、營養(yǎng)等多因素引起，4~5周齡肉雞多發(fā)，嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)經(jīng)濟發(fā)展[1]。肺動脈高壓是AS主要發(fā)病機理[1]，持續(xù)肺動脈高壓導致肝纖維化發(fā)生[2]。研究AS 肝纖維化發(fā)病機理及相關(guān)防治藥物具有重要意義。

Rho/ROCK 通路通過介導下游因子調(diào)控細胞遷移、凋亡、增殖等功能，參與多種生理病理過程，在肺動脈高壓和肝纖維化形成發(fā)病機制中，Rho/ROCK通路發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）、Rho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated oiled coil forming protein kinase，ROCK）、肌球蛋白輕鏈磷酸酶（Myosin light chain phosphatase，ML?CP）、MLCP 調(diào)節(jié)亞基（Myosin-phosphatase target?ing subunit 1，MYPT1）和磷酸化的肌球蛋白輕鏈（Phosphorylated myosin light chain，P-MLC）是RhoA/ROCK通路核心因子。

顧慶云、韓博等研究發(fā)現(xiàn)，復方中草藥和L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）均可有效防治AS[5-6]。本課題組前期研究，由黃芪、丹參、當歸、茯苓等組成的自擬復方中藥水提液和L-Arg通過抑制肝纖維化而有效防治AS[7]。本試驗研究RhoA/ROCK通路在AS 肉雞肝纖維化中損傷機理及自擬復方中藥水提液和L-Arg 作用機制，為AS 發(fā)病機制和有效防治藥物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

分期配合飼料購自山西大象農(nóng)牧集團，黃芪、當歸、茯苓、丹參等均購自山西省太谷縣藥材公司，RNAiso Plus 試劑盒、SYBR Prime ScripTMRT Reagent Kit（TaKaRa，日本），ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix（諾唯贊，南京），RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC ELISA 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

光學顯微鏡（Olympus，BX51TF 型），核酸蛋白濃度測定儀（NanoDrop，ND-1000）。

1.2 試驗動物及分組

以分期配合飼料作為基礎(chǔ)日糧，100 羽1 日齡羅斯肉雞常規(guī)喂養(yǎng)7日后，隨機分為5組：空白對照組（K 組）、AS 模型對照組（M 組）、復方中藥水提液高劑量組（G 組）、復方中藥水提液低劑量組（D 組）和L-Arg 對照組（L-Arg 組）。K 組常規(guī)飼養(yǎng)，M 組與G、D 組及L-Arg 組以低溫（9~11 ℃）、高能（日糧添加3%豬油與4%魚粉）、高鹽（飲水添加0.12%NaCl）多因素法復制AS 模型[8]，同時，G、D組中飲水添加2.0、1.0 mL·kg-1·bw·d復方中藥水提液，L-Arg 組中飼料給予1% L-Arg。試驗期為28 d。具體見表1。

表1 試驗分組和飼養(yǎng)方式Table 1 Groups and breeding ways

分別于15、25、35日齡隨機選取各組肉雞5羽，稱重，觀察整體狀態(tài)，尤其是AS 特征癥狀，并作剖檢觀察。取35 日齡心臟，除去表面血凝塊及脂肪，分離全心室和右心室并分別稱重，測定腹水心臟指數(shù)（Ascitesheartindex，AHI），以AHI>0.250作為標準，判斷AS發(fā)生[9]。

AHI=右心室重量/全心室重量（RV/TV）。

采集各組35日齡肉雞肝左葉用4%多聚甲醛固定，觀察肝臟形態(tài)，右葉用-80 ℃液氮冷凍，用于測定RhoA、ROCK、MLCP、MYPT1、P-MLC 等RhoA/ROCK通路相關(guān)因子。

1.3 復方中藥水提液制備

黃芪、丹參、當歸、茯苓=3∶2∶2∶2 配比，湯劑采用水煎法制備：水浸30 min→武火煮沸→文火40 min→濾3 層紗布3 次→濾液3 次→減壓蒸餾濃縮成1 g·mL-1湯劑。-20 ℃保存，加熱后混合供料。

1.4 方法

1.4.1 Masson染色法觀察肝纖維化

常規(guī)方法制備石蠟切片5 μm，二甲苯和梯度酒精脫蠟水化→Weigert 鐵蘇木素染色10 min→酸性乙醇適度分化→水洗后Masson 藍化液返藍→浸入蒸餾水→麗春紅品紅染色7 min→弱酸液和磷鉬酸溶液分別洗1 min→苯胺藍染液染色5 min→浸入弱酸→95%乙醇和無水乙醇快速脫水→透明封片。于光學顯微鏡下觀察膠原纖維沉積變化。

1.4.2 實時熒光定量PCR 檢測肝臟MYPT1 mRNA相對表達量

使用RNAiso Plus 試劑盒說明書提取肝臟總RNA，無菌無酶水溶解后用核酸蛋白濃度測定儀測定濃度并調(diào)整濃度為1 μg·μL-1，OD260/OD280和OD260/OD230確 定RNA 純 度。 采 用SYBR Prime ScripTM RT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 作實時熒光定量PCR 檢測。參照NCBI 中Gallus 相關(guān)基因CDS 序列設(shè)計并合成引物，引物具體信息見表2。PCR反應(yīng)體系：上下游引物（10 μmol·L-1）分別為0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 5 μL 及ddH2O 補至10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃30 s→95 ℃5 s→60 ℃30 s，循環(huán)40 次。2-??Ct法計算MYPT1 mRNA相對表達量。

表2 引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物長度Table 2 Primer sequence,annealing temperature,and PCR product length

1.4.3 ELISA 測定肝臟RhoA、ROCK、MLCP、PMLC蛋白含量

肝臟（0.1~0.2 g）冷生理鹽水中洗凈→干燥→稱重→按質(zhì)量體積比1∶9 添加生理鹽水→冰水浴均質(zhì)→5 000 r·min-1，5 min→取上清液→稀釋混勻備用。肉雞肝臟RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC 含量采用ELISA法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graph Pad Prism 8 軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析LSD 法，結(jié)果以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢變化

M組肉雞精神沉郁，倦怠喜臥，羽毛蓬亂，表現(xiàn)呼吸困難，腹部膨脹，觸之有波動感，內(nèi)有大量黃色液體，右心肥厚伴有心包積液。肺臟和腎臟淤血腫大，小腸黏膜表面有淤血點，肝臟淤血腫大，邊緣鈍圓，質(zhì)脆，觸之有油膩感，顏色呈暗紅色或棕黃色，有斑駁黃色條紋（見圖1）。G、D組和L-Arg組以上癥狀均明顯改善。

圖1 肉雞剖檢觀察Fig.1 Anatomical observation of broilers

2.2 復方中藥水提液對肉雞體重及AHI的影響

結(jié)果顯示，15、25、35 日齡M 組肉雞體重極顯著低于K 組（P<0.01）。15、25、35 日齡G、D 組 和L-Arg 組 體 重 顯 著 高 于M 組（P<0.01 或P<0.05）。35 日 齡G 組 體 重 顯 著 高 于L-Arg 組（P<0.05）（見圖2）。

?圖2 復方中藥水提液對AS肉雞體重的影響Fig.2 Effects of compound Chinese medicine water extract on body weight of AS broilers

結(jié)果顯示，35日齡M組肉雞AHI極顯著高于K組（P<0.01）。G、D 組和L-Arg 組肉雞AHI 極顯著低于M 組（P<0.01）。G、D 組肉雞AHI 均極顯著低于L-Arg 組（P<0.01）；G 組肉雞AHI 極顯著低于D組（P<0.01）（見圖3）。

2.3 復方中藥水提液對AS肉雞肝纖維化的影響

Masson 染色結(jié)果表明，35 日齡K 組肉雞肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列有規(guī)律，細胞間隙僅少量藍染的膠原纖維；與K組相比，35日齡M組肉雞肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，可見明顯膠原纖維沉積；與M 組相比，G、D 組和L-Arg 組肉雞肝臟膠原纖維沉積程度改善明顯（見圖4）。

圖4 復方中藥水提液對AS肉雞肝纖維化的影響（Masson染色，200×）Fig.4 Effects of compound Chinese medicine water extract on liver fibrosis in AS broilers(Masson-trichrome, 200×)

2.4 復方中藥水提液對AS肉雞肝臟MYPT1 mRNA相對表達量的影響

結(jié)果顯示，35 日齡M 組肉雞肝臟MYPT1 mRNA 相對表達量顯著高于K 組（P<0.05）。G、D組肉雞肝臟MYPT1 mRNA 相對表達量顯著低于M組（P<0.01 或P<0.05），L-Arg 組與M 組無顯著差異（P>0.05）。G、D組肉雞肝臟MYPT1 mRNA 相對表達量與L-Arg 組均無顯著差異，但呈下降趨勢（P>0.05）（見圖5）。

圖5 復方中藥水提液對AS肉雞肝臟MYPT1 mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effects of compound Chinese medicine water extract on relative expression of MYPT1 mRNA in liver of AS broilers

2.5 復方中藥水提液對AS肉雞肝臟RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC蛋白含量的影響

結(jié)果表明，35日齡M組肉雞肝臟RhoA、ROCK、P-MLC 蛋白極顯著高于K組（P<0.01），MLCP蛋白活性極顯著低于K 組（P<0.01）。G、D 組和L-Arg組肉雞肝臟RhoA、ROCK、P-MLC 蛋白含量極顯著低于M組（P<0.01），MLCP 蛋白活性極顯著高于M組（P<0.01）。G、D組肉雞肝臟RhoA、ROCK蛋白含量極顯著低于L-Arg組（P<0.01），G組P-MLC蛋白含量顯著低于L-Arg組（P<0.05），G、D組MLCP蛋白活性顯著高于L-Arg組（P<0.01或P<0.05）；G組肉雞肝臟RhoA蛋白含量極顯著低于D組（P<0.01），MLCP蛋白活性顯著高于D組（P<0.05）；D組ROCK蛋白含量極顯著低于G組（P<0.01，見圖6）。

圖6 復方中藥水提液對AS肉雞肝臟RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC蛋白含量的影響Fig.6 Effects of compound Chinese medicine water extract on the contents of RhoA,ROCK,MLCP and P-MLC protein in AS broiler livers

3 討 論

本試驗以多因素法復制模型[8]，模擬AS發(fā)病因素的多樣性，結(jié)果顯示，M組肉雞表現(xiàn)出腹水、體重降低、AHI 升高，并可見肝臟大量膠原纖維沉積，發(fā)生纖維化，與前期研究結(jié)果一致[7]，本試驗還觀察到心肺組織形態(tài)異常等特征性變化，與楊慧萍等文獻報道結(jié)果相同[10]，表明成功復制AS 模型。G、D 組和L-Arg 組肉雞上述癥狀均有改善，表明復方中藥水提液和L-Arg均可有效防治AS。

Ayd?n等研究表明，RhoA/ROCK通路調(diào)控肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活、增殖和收縮，是肝纖維化一個重要機制[11]。RhoA/ROCK通路激活后，通過磷酸化MYPT1 抑制MLCP 活性，MLC 不能去磷酸化，導致P-MLC 含量增多，肌動-肌球蛋白相互作用增加，增強肌動蛋白骨架聚合，致使HSCs 發(fā)生大量活化增殖，細胞外基質(zhì)聚集，引發(fā)肝纖維化[11]。本試驗中，AS 肉雞肝臟RhoA、ROCK、P-MLC 及MYPT1 表達量均明顯升高，MLCP 活性顯著降低，表明RhoA/ROCK 通路被激活后，MYPT1 抑制MLCP 活性，從而抑制PMLC去磷酸化，導致大量HSCs 活化增殖發(fā)生肝纖維化，最終形成腹水。RhoA/ROCK 通路對心、肺等其他組織作用有待深入研究。

本課題組前期結(jié)果顯示，缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、結(jié)締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1/Smad 通路參與AS 肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。Wang、Mohamma?dalipour等研究表明，RhoA/ROCK通路作為HIF-1α上游通路，激活HIF-1α，并通過升高α-SMA、CTGF 表達，促進HSCs 活化，合成大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，引發(fā)肝臟纖維化[12-13]。Feng 等研究表明，RhoA/ROCK 通路與TGF-β1/Smad 通路相互作用參與纖維化調(diào)控，ROCK 抑制劑Y-27632 通過影響Smad2 和Smad3 磷酸化，抑制TGF-β1 對其下游信號分子Smad2、Smad3 正反饋，下調(diào)α-SMA、CT?GF 基因和蛋白表達。TGF-β1/Smad 通路可通過上調(diào)RhoA、ROCK1 蛋白表達，致使MLC 磷酸化增加，肌動蛋白細胞骨架重組，影響HSCs 收縮、遷移、增殖、自噬和凋亡等生物學行為和功能[14]。因此，RhoA/ROCK通路直接參與AS發(fā)生發(fā)展，作用機制與其調(diào)控的多靶點密切相關(guān)。

中獸醫(yī)學認為，AS 證候主要由氣血兩虛、氣滯血瘀和水濕停聚所致，治療宜補氣補血、活血行氣、利水滲濕[7]。本試驗采用的自擬復方中藥水提液由補中益氣的黃芪、活血祛瘀的丹參、補血養(yǎng)血的當歸、滲濕健脾的茯苓等中藥配伍而成，前期研究表明可有效防治AS[15]。本試驗檢測結(jié)果，G、D組肉雞肝臟RhoA、ROCK、MYPT1及PMLC 表達量均顯著降低，MLCP 表達量顯著升高，其中復方中藥水提液高劑量組因子變化趨勢最顯著，表明復方中藥水提液可通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK通路，抑制肝纖維化，有效防治AS，且G 組防治AS 的效果最顯著。研究表明，黃芪甲苷可通過抑制HSCs 活化發(fā)揮抗肝纖維化作用[16]，由黃芪為君藥的黃芪溫心組方具有益氣活血功效，可降低RhoA、ROCK表達，抑制心肌纖維化[17]；丹參活性成分可調(diào)控RhoA/ROCK 通路，導致p-MLC蛋白表達下降，阻斷HSCs 增殖，Ⅰ型膠原合成、分泌等生物學活性，逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程[18-19]；當歸紅芪多糖通過干預氧化應(yīng)激抑制RhoA/ROCK 通路活化[20]，具有活血利水功效的當歸芍藥散通過下調(diào)HSCs 中RhoA、ROCK2 蛋白表達，抑制內(nèi)皮素誘導的HSCs 收縮[21]；活血化瘀的桂枝茯苓丸可降低RhoA、ROCK1、P-MLC 表達，抑制RhoA/ROCK通路激活，治療子宮腺肌病[22]。本課題組前期試驗表明，復方中藥水提液可抑制HIF-1α、α-SMA、CTGF 及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路，有效防治AS 肝纖維化[7]，結(jié)合本試驗研究結(jié)果，復方中藥水提液有效防治AS 的作用機制與RhoA/ROCK 通路及其調(diào)控的多靶點密切相關(guān)，與復方中藥水提液配伍及其有效成分的藥理作用相關(guān)。RhoA/ROCK 通路介導的下游P-MLC 可作為研究AS病理機制及其防治藥物篩選的新靶點。

L-Arg是肉雞必需氨基酸，促進肉雞生長、降低AS 發(fā)生率[23]，在肉雞體內(nèi)可通過一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）轉(zhuǎn)化成一氧化氮（Nitri?coxide，NO），擴張血管，降低肺動脈高壓[23]。因此，L-Arg 常被用作防治AS 的藥物[6]。肝臟是NO主要合成場所，HSCs 通過表達內(nèi)皮型NOS（Endo?thelial nitric oxide synthase，eNOS）促進NO 合成，使血管產(chǎn)生舒張效應(yīng)[21]。研究表明，NO 通過轉(zhuǎn)換MYPT1 亞型，激活MLCP，發(fā)揮舒張血管的作用[24]。ROCK 是eNOS 和內(nèi)皮NO 產(chǎn)生的負調(diào)控因子[25]，ROCK 抑制劑可減少紅細胞ROCK 含量，上調(diào)eNOS 活性和促進NO 生成，延緩肺動脈高壓進程[26]。韓燁晨等研究表明，L-Arg 能夠調(diào)節(jié)肝臟TGF-β1/Smad通路，抑制HIF-1α、α-SMA、CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達[7]，結(jié)合本試驗結(jié)果，L-Arg可影響RhoA/ROCK 通路介導的下游MLC 磷酸化，抑制肝纖維化從而有效防治AS。

本研究發(fā)現(xiàn)，復方中藥水提液和L-Arg均可有效防治AS，高劑量復方中藥水提液效果最佳，與其能夠通過RhoA/ROCK通路抑制AS肉雞肝纖維化相關(guān)。