何文迪 陳新江 岑葉平
(寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 寧波 315010)
烏靈菌別名烏靈參、烏苓參、烏麗參、雷震子等,是生長在土棲白蟻廢巢或向陽溫暖山坡的藥用真菌黑柄炭角菌Xylarianigripes(Kl.) Sacc.的菌核,是我國的珍稀名貴中藥材[1]。在我國主要分布于四川、云南、江蘇、浙江、江西、廣東及中國臺(tái)灣[2]等溫帶、亞熱帶地區(qū)。烏靈菌是四川、云南等地的著名補(bǔ)氣中藥,對治療脾虛食少,產(chǎn)后及手續(xù)后失血過多,產(chǎn)后乳少,胃下垂,疝氣,小兒驚風(fēng)、跌打損傷等癥都有明顯功效[3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,烏靈菌含有氨基酸、多糖、核苷類化合物等有效成分,具有祛濕、鎮(zhèn)靜安神、提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)造血等功效[1]。
由于烏靈菌生長環(huán)境和生長條件特殊,自然資源稀缺,近年來其人工栽培技術(shù)取得突破,如翁榕安[4]篩選出黑柄炭角菌人工栽培最適培養(yǎng)基為木屑培養(yǎng)基,最佳培養(yǎng)條件為:在25 ℃的生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)至菌絲滿瓶后轉(zhuǎn)到室內(nèi)培養(yǎng),在溫度25 ℃、濕度85%、自然光照條件下,黑柄炭角菌子座形成早、數(shù)量多、質(zhì)量好。本文對烏靈菌主要的化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為烏靈菌實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。
烏靈菌的化學(xué)成分研究主要以天然烏靈參菌核及其人工發(fā)酵產(chǎn)物為樣品,目前較明確的成分有初級代謝產(chǎn)物氨基酸、核苷、多糖及常見次生代謝化學(xué)成分甾體、色原酮類化合物等。
陳宛如等[3]及翁榕安[4]在黑柄炭角菌不同組織(野生子座、野生菌核、栽培子座及發(fā)酵菌絲)中發(fā)現(xiàn)了谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、門冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)等17 種水解氨基酸,其中必需氨基酸7 種;游離氨基酸29 種,其中必需氨基酸8 種,且栽培子座和發(fā)酵菌絲的氨基酸種類和含量高于天然烏靈參菌核。華巍巍等[5]在烏靈菌發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)18 種氨基酸,蛋白質(zhì)含量達(dá)33%~40%,氨基酸總量為27.5%,其中人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的41.5%。與氨基酸含量僅占9%的天然菌核相比,烏靈菌發(fā)酵物具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。
鐘榮華等[6]對烏靈菌粉經(jīng)超聲處理、過濾后使用高效液相色譜法(HPLC 法)測得樣品中腺苷平均含量約0.1%。翁榕安[4]、廖瓊等[7]對烏靈菌野生菌核、野生子座、栽培子座和發(fā)酵菌絲的測定發(fā)現(xiàn),烏靈菌中含有的核苷類化合物主要為尿苷和腺苷,且野生子座和人工栽培子座中的含量高于發(fā)酵菌絲和野生菌核。湯俊等[8]研究發(fā)現(xiàn)烏靈參發(fā)酵菌粉中除含尿苷和腺苷外,還有鳥苷成分。陸靜嫻等[9]測定烏靈菌粉制品烏靈膠囊的成分發(fā)現(xiàn)含有尿苷、腺苷、鳥苷和腺嘌呤。以上對烏靈菌及其發(fā)酵物的測定研究均采用HPLC 法,但因使用的儀器、設(shè)置的參數(shù)及所選樣品有所不同,導(dǎo)致其核苷類化合物檢出結(jié)果存在差異。
據(jù)陳宛如等[3]研究,烏靈菌天然菌核中含有甘露醇、葡萄糖和棉子糖,粗多糖含量為12.5%;而烏靈菌發(fā)酵菌絲體中不僅多糖含量高達(dá)36%,且含有果糖、乳糖和蔗糖;以甘露醇在天然菌核和發(fā)酵菌絲體的多糖類化合物中含量最高。翁榕安[4]采用水提醇沉法測得烏靈菌發(fā)酵菌絲和野生菌核中每克菌粉含粗多糖的量分別為1.76 mg 和1.65 mg,總糖含量達(dá)20.60%和23.65%。楊小龍等[10]從黑柄炭角菌子實(shí)體中分離得到α-kojibiose 及D-阿洛糖醇。
楊小龍等[10]從黑柄炭角菌子實(shí)體中分離得到10種化合物,鑒定后發(fā)現(xiàn)其中含(22E,24R)-麥角甾-5,7,22-三烯-3β醇和5α,8α-過氧-(22E,24R)-麥角甾-6,22-二烯-3β-醇。龔慶芳等[11]采用硅膠、凝膠和大孔樹脂等分離柱對黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲體進(jìn)行分離純化,通過核磁共振波譜分析法(NMR)、質(zhì)譜分析法(MS)等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,得出其含有5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-二烯-3β-醇、麥角甾-7,22-二烯-3β-5α,6β-三醇、大戟醇、β-谷甾醇及2-(4-羥基苯)-乙醇等甾醇類化合物。
吳根福[12]從黑柄炭角菌深層發(fā)酵制品中獲得了具有DPPH 自由基捕捉活性成分,推斷其為5,8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素,但龔慶芳等[13]在黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲抗氧化有效成分研究中并未發(fā)現(xiàn)這一物質(zhì)。陳勇等[14]采用HPLC 法建立了同時(shí)測定烏靈膠囊中5-hydroxymellein、5-carboxylmellein、金雀異黃素及5-甲基蜂蜜曲霉素含量的方法。陸靜嫻等[15]從烏靈菌粉乙醇回流提取后經(jīng)石油醚、乙醇萃取的部分分離得到5-hydroxymellein(1)、5-carboxylmellein(2)、金雀異黃素(3)和 5-methylmellein(4)四種化合物(圖1),其中化合物2、3、4 為首次從烏靈菌粉提取分離獲得,而化合物1、2、3 被認(rèn)定為烏靈菌粉的特征性成分。
圖1 從烏靈菌粉中分離得到的四種化合物結(jié)構(gòu)式[15]
色原酮屬于次生代謝產(chǎn)物,龔慶芳等[11]首次從黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲體中分離得到5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮,5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮和5-羥基-2-甲基-4-二氫色原酮。
天然烏靈參菌核及其深層發(fā)酵物中含有豐富的微量元素鐵、錳、鋅及常量元素鎂、鈣、鉀、鈉等,其中作為人體重要造血原料的鐵元素在100 g 天然烏靈參菌核和深層發(fā)酵菌絲體中含量分別達(dá)25.6 mg 和459 mg[3]。翁榕安[4]發(fā)現(xiàn)烏靈菌發(fā)酵菌體中含有16 種人體必需的礦質(zhì)元素,其中人體易缺乏的元素含量較高。烏靈菌及其發(fā)酵制品中還含有豐富的維生素D2、維生素K1、維生素E 以及β-胡蘿卜素[5]。
綜上,研究已證實(shí)天然烏靈菌中含有豐富的氨基酸、核苷類及多糖等初級代謝產(chǎn)物,而人工栽培子座及發(fā)酵制品中的主要化學(xué)成分種類、含量均優(yōu)于天然烏靈菌,這為烏靈菌人工栽培和發(fā)酵提供了重要依據(jù)和理論基礎(chǔ)。但烏靈菌次級代謝產(chǎn)物形成過程復(fù)雜,不同研究的結(jié)論差異較大,有待開展深入、系統(tǒng)性的研究,以進(jìn)一步明確具體成分及其生物活性,制定合適的發(fā)酵過程質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),不斷拓展和提升烏靈菌的藥用價(jià)值。
烏靈菌及其發(fā)酵制品具有廣泛的生物活性,目前報(bào)道較多的主要集中在調(diào)節(jié)神經(jīng)、改善認(rèn)知功能、調(diào)節(jié)免疫、抗貧血、抗氧化及抗前列腺增生方面。
研究發(fā)現(xiàn),烏靈菌可能通過Glu-GABA、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺(5-HT)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等多種機(jī)制調(diào)節(jié)神經(jīng),起到鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁和焦慮作用[16]。馬志章等[17]發(fā)現(xiàn),連續(xù)喂服烏靈菌粉的小鼠注入同位素30 min 后腦內(nèi)Glu 和GABA 的標(biāo)記物含量明顯增高,認(rèn)為烏靈菌粉可能通過改變腦組織對Glu 和GABA 的通透性而提升攝取量,并通過提高谷氨酸脫羧酶(GAD)活性及激活GABA受體實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)靜、催眠作用。楊楠等[18]使用基因芯片技術(shù)觀察慢性輕度應(yīng)激(CMS)小鼠模型,發(fā)現(xiàn)烏靈菌粉具有 5-HT 再攝取抑制作用,使5-HT2C 受體表達(dá)顯著下降而起到抗抑郁作用。范恩宇等[19]通過觀察灌服不同劑量烏靈菌粉的小鼠發(fā)現(xiàn),小鼠腦組織內(nèi)GABA 和5-HT 濃度顯著增高,進(jìn)一步證實(shí)烏靈菌粉通過提高GABA 攝取、5-HT 再攝取抑制的多通路共同作用改善睡眠。而小鼠腦組織γ-氨基丁酸A 型受體(GABAAR)濃度的明顯增高,說明GABA 途徑主要通過增高GABAAR 的表達(dá)水平改善睡眠。黎功炳等[20]發(fā)現(xiàn)喂服烏靈膠囊后抑郁大鼠腦組織內(nèi)乙?;M蛋白H3 含量明顯升高,5-羥色胺受體(5-HTT)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的蛋白表達(dá)明顯增加,表明烏靈菌粉可能通過調(diào)控大鼠表觀遺傳從而實(shí)現(xiàn)緩解抑郁。舒忙巧等[21]發(fā)現(xiàn)一定劑量的烏靈菌粉水提物能夠減緩腦缺血引起的小鼠海馬GABA 和BDNF 表達(dá)水平的下降,對海馬神經(jīng)元和神經(jīng)纖維具有保護(hù)作用。
近年來,烏靈菌調(diào)節(jié)神經(jīng)的其他相關(guān)機(jī)制也被陸續(xù)報(bào)道。李鳳蕾等[22]發(fā)現(xiàn)喂服高劑量烏靈菌粉的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)大鼠焦慮樣行為得到顯著改善,大鼠腦部海馬組織中促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的水平顯著降低,顯示烏靈菌粉對焦慮樣行為的改善作用與其抗炎功能有關(guān)。李冬梅[23]的研究表明,烏靈菌粉能夠顯著提高TSPO(18 kDa 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)調(diào)控的線粒體自噬相關(guān)通路重要蛋白的表達(dá)水平,顯著對抗神經(jīng)元突觸發(fā)生障礙的作用以發(fā)揮抗抑郁作用。陳浩等[24]報(bào)道了烏靈菌能明顯降低大鼠海馬組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA 的表達(dá),通過激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)分子磷酸化抑制海馬神經(jīng)元過度凋亡和自噬,并通過抑制核心酶Caspase-3 的過度激活和表達(dá)來修復(fù)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙引起的海馬神經(jīng)元損傷,進(jìn)而調(diào)節(jié)PTSD 樣行為。
以上多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,烏靈菌通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng),通過增強(qiáng)腦部對有效成分的攝取、抑制不利成分的攝取,提高受體表達(dá)水平,從而具有一定的神經(jīng)元保護(hù)和修復(fù)作用。目前烏靈菌發(fā)酵物制成的藥品烏靈膠囊被廣泛應(yīng)用于治療各種因素引起的失眠癥,無論是單獨(dú)使用還是與常用治療失眠的西藥聯(lián)合使用,對患者的睡眠均有不同程度的改善作用,患者睡眠障礙量表評分(SDRS)、匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)等指標(biāo)均較治療前有顯著下降[25],在治療因心腦疾病、女性疾病、消化疾病、耳喉疾病等引起的焦慮和抑郁方面也取得了良好療效[26],且不良反應(yīng)少,值得大力推廣。
何旭東[27]報(bào)道烏靈菌粉雖不能阻斷癲癇點(diǎn)燃的最終形成,但能明顯延緩大鼠戊四唑點(diǎn)燃的過程,部分逆轉(zhuǎn)點(diǎn)燃過程中腦組胺含量的下降,表明烏靈菌增強(qiáng)了腦組胺能神經(jīng)的活性及增強(qiáng)磷酸化的環(huán)磷酸腺普反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCERB)表達(dá),從而改善了癲癇誘發(fā)的記憶障礙。李中春等[28]研究表明服用烏靈膠囊的卒中后抑郁大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙顯著改善,但與艾司西酞普蘭組大鼠對比,其異常腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)并無改變,因此烏靈膠囊可能是通過GABA 或其他神經(jīng)機(jī)制改善了卒中后抑郁大鼠的學(xué)習(xí)記憶。鄒小冬等[29]發(fā)現(xiàn)烏靈膠囊通過增加阿爾茨海默病模型小鼠縫隙連接蛋白43(Cx43)的分泌,促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的反應(yīng)性,從而改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能。王海等[30]發(fā)現(xiàn)烏靈菌粉能顯著改善APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茲海默病模型小鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力,認(rèn)為烏靈菌粉可能通過降低小鼠海馬中Aβ1-42含量減少了老年斑的形成,從而改善模型小鼠的認(rèn)知功能。癲癇、阿爾茨海默癥等疾病機(jī)制尚不明確,缺乏有效治療藥物,認(rèn)知功能逐步退化嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量,烏靈菌粉為輔助治療這些疾病引起的認(rèn)知功能障礙提供了新的策略。
烏靈菌中的多糖被認(rèn)為是參與機(jī)體免疫作用的主要成分。馬志章等[31]、華巍巍[32]的研究表明,黑柄炭角菌多糖雖無直接抑制腫瘤作用,但可通過激活正常小鼠或帶瘤小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞,促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,采用3H-TdR 后標(biāo)記法測定給藥后腫瘤細(xì)胞增殖抑制率達(dá)85%~90%。陸小蘭等[33]發(fā)現(xiàn)黑柄炭角菌多糖能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒細(xì)胞分化因子(Cytotoxic cell differentiation factor,CCDF)這一過程可能是通過誘導(dǎo)CCDF 而對淋巴因子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒細(xì)胞(LICC)起調(diào)節(jié)作用[34]。Ko 等[35]推測烏靈菌水提取物和乙醇萃取物可能通過抑制經(jīng)由NF-kB 信號通路的表達(dá),從而發(fā)揮對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。羅威[36]發(fā)現(xiàn)連續(xù)灌喂烏靈菌發(fā)酵液的小鼠耳腫脹度明顯增大,脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力提高,認(rèn)為烏靈菌發(fā)酵液通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的應(yīng)激能力、溶血素與凝集素抗體分泌、巨噬細(xì)胞的吞噬功能和淋巴細(xì)胞的增殖等多個(gè)免疫應(yīng)答環(huán)節(jié),增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)烏靈菌具有增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用,但是臨床治療腫瘤時(shí)更多的是將烏靈菌用于減緩腫瘤引發(fā)的抑郁和焦慮問題,現(xiàn)有烏靈菌及其發(fā)酵制品的抗癌活性成分和機(jī)制研究報(bào)道甚少,其在預(yù)防和治療腫瘤方面的潛力有待進(jìn)一步發(fā)掘。
《四川中藥志》中早有關(guān)于烏靈菌作為機(jī)體失血狀態(tài)治療藥物的記載[37],現(xiàn)代藥理學(xué)進(jìn)一步證實(shí)了烏靈菌抗貧血的功效。馬志章等[38]用烏靈菌發(fā)酵菌絲體連續(xù)灌喂失血50%的實(shí)驗(yàn)大鼠,發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)紅細(xì)胞和血紅蛋白的數(shù)量顯著升高,且兩項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)至放血前90%水平所需的時(shí)間明顯縮短,治療效果優(yōu)于Fe 片。華巍巍[39]采用不同劑量黑柄炭角菌菌絲體混懸液飼喂雄性大鼠和雌性大鼠,給藥1.5 個(gè)月、3個(gè)月后與未服藥大鼠體內(nèi)血紅蛋白含量進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)黑柄炭角菌發(fā)酵物有明顯增高大鼠血紅蛋白的作用。毒性試驗(yàn)結(jié)果表明烏靈菌發(fā)酵物安全性高,可作為抗貧血的潛在藥物。
吳根福[12]從黑柄炭角菌深層發(fā)酵制品中分離得到5,8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素,其對DPPH自由基捕捉能力優(yōu)于維生素C 和維生素E。龔慶芳等[13]報(bào)道烏靈菌發(fā)酵物中含有的1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力和還原能力,認(rèn)為該物質(zhì)可能是烏靈菌發(fā)酵物發(fā)揮抗氧化功能的主要成分。武守華[40]發(fā)現(xiàn)黑柄炭角菌子實(shí)體和菌絲體甲醇提取物都有較好的DPPH 自由基清除能力、還原能力和螯合能力。翁榕安等[41]研究發(fā)現(xiàn)水溶性黑柄炭角菌肽能明顯降低鄰苯三酚自氧化速率,有極強(qiáng)的羥自由基清除能力,對DPPH 自由基清除率隨濃度升高而增加,表明水溶性黑柄炭角菌肽在體外具有明顯的抗氧化作用。白云霞等[42]用烏靈菌粉飼喂實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔,結(jié)果實(shí)驗(yàn)兔體內(nèi)清除超氧陰離子自由基損害的主要活性酶超氧化物歧化酶(SOD)及催化過氧化氫分解酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力增強(qiáng)。
許瑞珠等[43]發(fā)現(xiàn)良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia,BPH)患者使用烏靈參膠囊治療臨床癥狀的總有效率達(dá)96.9%,B 超顯示患者治療后前列腺體積明顯縮小,且用藥安全性高。黃秀梅等[44]發(fā)現(xiàn)烏靈菌能夠誘發(fā)雄性家兔膀胱三角肌條收縮,對抗由α1 受體激動(dòng)劑去氧腎上腺素引起的家兔膀胱頸平滑肌收縮,認(rèn)為烏靈菌具有減輕膀胱頸尿流阻力、增加膀胱逼尿肌排尿張力的雙重作用,達(dá)到改善BPH引起的膀胱出口梗阻癥狀。烏靈菌抗前列腺增生的主要成分和作用機(jī)制尚不明確,但以烏靈菌粉為君藥(又稱主藥)的靈澤片治療腎虛血瘀濕阻型BPH 患者,療效較好[45-47],治療后患者的國際前列腺癥狀評分(International Prostate Symptom Score,IPSS)、生活質(zhì)量指數(shù)評分(Quality of Life,QoL)及中醫(yī)癥候積分較治療前明顯降低,患者排尿無力、滴瀝不盡、夜尿頻多、小腹墜脹、腰膝酸軟、倦怠乏力等癥狀得到改善,出現(xiàn)不良反應(yīng)較少。
隨著烏靈菌及其產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用,烏靈菌多樣化的生物活性逐漸被發(fā)現(xiàn)。除上述功效外,近年來也有關(guān)于烏靈菌調(diào)節(jié)2 型糖尿病B 細(xì)胞功能[48]、抗輻射[49]的報(bào)道,但具體機(jī)理尚不明確。
珍稀藥用真菌烏靈參在我國已有2 000 多年的藥用歷史和豐富的治療經(jīng)驗(yàn),應(yīng)以新知識(shí)、新技術(shù)推動(dòng)烏靈菌及其發(fā)酵制品的現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,更好滿足新形勢下人民健康和經(jīng)濟(jì)建設(shè)需要,推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)走向國際舞臺(tái)。目前,針對烏靈菌及其發(fā)酵制品所含化學(xué)成分、藥用價(jià)值的研究已經(jīng)取得一定成果,烏靈菌發(fā)酵制品在臨床中廣泛應(yīng)用且取得了良好的療效。但烏靈菌及其發(fā)酵制品的化學(xué)成分復(fù)雜,藥理作用機(jī)制尚不明確,建議今后的研究側(cè)重以下方面:首先,對烏靈菌發(fā)酵制品的次級代謝產(chǎn)物開展深入研究,篩選藥效物質(zhì),并制定發(fā)酵過程質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),提升烏靈菌發(fā)酵制品的藥用價(jià)值;其次,借助生物組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,分析疾病相關(guān)網(wǎng)絡(luò)、烏靈菌影響網(wǎng)絡(luò),構(gòu)建烏靈菌制劑的中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò);最后,對烏靈菌作為食品、保健品的安全性進(jìn)行研究,在國家大力發(fā)展藥食同源產(chǎn)業(yè)的趨勢下,為烏靈菌產(chǎn)品的多樣化開發(fā)和應(yīng)用做好前期準(zhǔn)備。