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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的癡呆健腦方治療血管性癡呆作用機(jī)制研究*

    2023-06-19 01:09:12伊文剛董新剛董曉坤李偉峰
    中醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:健腦血管性低劑量

    伊文剛,董新剛,董曉坤,李偉峰

    1.河南省洛陽正骨醫(yī)院,河南 洛陽 471002; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 3.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046

    血管性癡呆(vascular dementia,VD)是缺血或出血性腦血管病引起腦組織損傷所致的癡呆類型[1]。作為影響老齡人群體健康的重要疾病,本病患病率伴隨著中國人口老齡化持續(xù)加劇和其他潛在危險(xiǎn)因素而呈逐年上升態(tài)勢,如腦血管病、糖尿病及肥胖等代謝綜合征患病人群日益增多[2-3]。中醫(yī)認(rèn)為,本病發(fā)病部位在腦,與心、肝、腎等臟器密切相關(guān),腎精虧虛、痰濁內(nèi)阻、瘀血阻滯乃日久損髓傷腦的主因,故本病基本病機(jī)為腎虛、瘀血、痰濁凝滯經(jīng)脈[4]。癡呆健腦方是依據(jù)“三元絡(luò)腦”學(xué)說擬定,該方由薯蕷丸和通竅活血湯的合方化裁而成,方中諸藥合用,共起益腎填髓、滌痰開竅和祛瘀通絡(luò)之功[4]。癡呆健腦方是全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師經(jīng)驗(yàn)方,初步臨床驗(yàn)證效果良好[5-6]。為進(jìn)一步明確癡呆健腦方對血管性癡呆的干預(yù)機(jī)制,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討癡呆健腦方的作用機(jī)制,并輔以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以期為后續(xù)臨床與實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

    1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

    1.1 資料與方法

    1.1.1 癡呆健腦方活性成分檢索在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)依次檢索熟地黃、山茱萸、肉桂、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、黨參、白術(shù)、生姜等各自活性成分,按照口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選;使用SwissADME篩選在化源網(wǎng)上獲取的遠(yuǎn)志的活性成分。癡呆健腦方有效活性成分通過Drugbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步預(yù)測潛在靶點(diǎn)。

    1.1.2 血管性癡呆靶點(diǎn)收集在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)及GeneCards數(shù)據(jù)庫以“vascular dementia(VD)”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲取血管性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.1.3 Venn圖構(gòu)建依據(jù)Venn2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線平臺(tái)取藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集,獲取癡呆健腦方治療血管性癡呆的潛在靶點(diǎn),并以Venn圖顯示。

    1.1.4 構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖將癡呆健腦方藥物組成、活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行映射,運(yùn)用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.1.5 蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction networks,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建把藥物和疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為“Homo sapiens”,構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.1.6 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析把藥物和疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html)在線數(shù)據(jù)庫,把物種設(shè)置為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO富集分析,得到癡呆健腦方對血管性癡呆的生物功能注釋,包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組成(cellular component,CC),同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。以相同方法進(jìn)行KEGG通路富集分析,得到癡呆健腦方作用于血管性癡呆的主要通路,結(jié)果以表格形式展現(xiàn)。

    1.2 結(jié)果

    1.2.1 癡呆健腦方活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)及血管性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)的獲取在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索癡呆健腦方的藥物活性成分,按照OB≥30%和DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)篩選,獲得癡呆健腦方有效活性成119個(gè),其中白術(shù)21個(gè)、川芎7個(gè)、黨參21個(gè)、茯苓15個(gè)、肉桂10個(gè)、山茱萸20個(gè)、生姜5個(gè)、石菖蒲4個(gè)、熟地黃2個(gè)、桃仁23個(gè);化源網(wǎng)檢索遠(yuǎn)志26個(gè),經(jīng)SwissADME篩選后剩余有效活性成分5個(gè)。根據(jù)篩選得到的活性成分,從Drugbank數(shù)據(jù)庫中提取每個(gè)活性成分的潛在作用靶點(diǎn)信息,進(jìn)一步利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)檢索得到靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名,獲得癡呆健腦方活性成分潛在作用靶點(diǎn)208個(gè)。利用OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫共預(yù)測得到血管性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)133個(gè)。

    1.2.2 藥物和疾病交集靶點(diǎn)Venn圖將癡呆健腦方活性成分靶點(diǎn)映射到血管性癡呆靶點(diǎn)中,得到交集靶點(diǎn)10個(gè)。見圖1。

    圖1 潛在靶點(diǎn)韋恩圖

    1.2.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中顯示節(jié)點(diǎn)337個(gè),其中藥物活性成分119個(gè)、藥物節(jié)點(diǎn)10個(gè)(熟地黃成分有兩個(gè)且均為共同成分,未顯示)、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)208個(gè),見圖2。圖中淺藍(lán)色為靶點(diǎn),RG為肉桂活性成分,DS為黨參活性成分,BZ為白術(shù)活性成分,SDH為熟地黃活性成分,SJ為生姜活性成分,SZY為山茱萸活性成分,SCP為石菖蒲活性成分,FL為茯苓活性成分,CX為川芎活性成分,TR為桃仁活性成分,A1、B1、C1、D1為共同成分。

    圖2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

    1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖將藥物和疾病交集靶點(diǎn)傳至STRING數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建蛋白間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,其中節(jié)點(diǎn)為靶蛋白,邊為靶蛋白間相互作用關(guān)系。見圖3。

    圖3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

    1.2.5 GO功能富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對癡呆健腦方作用于血管性癡呆的有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,得到GO條目867條,其中BP 730條、MF 90條、CC 47條,選擇前20條作圖。由BP分析結(jié)果可知,癡呆健腦方對血管性癡呆的治療作用主要與對異種物質(zhì)刺激的發(fā)應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、異種物質(zhì)分解代謝過程(xenobiotic catabolic process)、單萜類代謝過程(monoterpenoid metabolic process)等生物過程有關(guān)。MF分析表明共同靶點(diǎn)主要涉及氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)、花生四烯乙醇胺8,9環(huán)氧氧化酶活性(anandamide 8,9 epoxidase activity)等分子功能?;贑C分析結(jié)果,突出后膜(postsynaptic membrane)、樹突(dendrite)及突出膜(synaptic membrane)等細(xì)胞組分在癡呆健腦方對血管性癡呆的治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見圖4—圖6。

    圖5 潛在靶點(diǎn)MF分析

    圖6 潛在靶點(diǎn)CC分析

    1.2.6 KEGG通路富集分析運(yùn)用Metascape在線數(shù)據(jù)庫對癡呆健腦方治療血管性癡呆有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05及FDR<0.05,取前20條通路。分析顯示,共同靶點(diǎn)主要富集于AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。見表1。

    表1 KEGG富集分析結(jié)果

    2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    2.1 材料

    2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性健康大鼠100只,體質(zhì)量(250±20)g,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(豫)2020-0010,購于鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場,飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)操作均符合有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理規(guī)范,福利倫理審查批準(zhǔn)編號(hào):DWLL20200156。

    2.1.2 藥物與試劑熟地黃、山茱萸、肉桂、遠(yuǎn)志、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、黨參、白術(shù)、生姜飲片來自河南省中醫(yī)院藥劑科;鹽酸多奈哌齊片[商品名:安理申,衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司,規(guī)格:10 mg,國藥準(zhǔn)字:H20070181]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、NF-κB抗體、p65/p50抗體(英國Abcam公司,貨號(hào):ab255730、ab178013、ab215539、ab181421、ab16502、ab131546);熒光二抗(美國Proteintech公司,貨號(hào):SA00007-2)。

    2.1.3 儀器TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司);MultiSkan3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Mini P-4型電泳槽、VE-186型濕轉(zhuǎn)電泳槽、5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);Mini-Sbucell GT型電泳儀(美國Bio-Rad公司);XK-802型水平脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司);pH211型酸度計(jì)(意大利Hanna公司);F10型電動(dòng)組織勻漿器(美國Fluka公司)。

    2.2 方法

    2.2.1 動(dòng)物造模采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈分次結(jié)扎法建立VD模型。術(shù)前禁食水12 h,稱大鼠質(zhì)量,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉,麻醉成功后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,取頸正中切1.5~2.0 cm切口,鈍性分離皮下軟組織及肌層,充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng),用1號(hào)手術(shù)線將右側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎,傷口縫合3 d后拆線;腹腔注射慶大霉素 0.05 mL,每天1次,連續(xù)5 d;左側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎同上。假手術(shù)組僅做麻醉和頸總動(dòng)脈分離,不結(jié)扎。術(shù)后自由獲取水源及飼料,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用水迷宮篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,首次跨越平臺(tái)時(shí)間明顯延長、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯少于正常大鼠者為造模成功。

    2.2.2 藥物干預(yù)將造模成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組,分為模型組、多奈哌劑組及癡呆健腦方高、低劑量組。假手術(shù)組和模型組以生理鹽水灌胃;多奈哌齊組以3 mg·kg-1劑量灌胃鹽酸多奈哌齊,癡呆健腦方高、低劑量組分別以32 g·kg-1、16 g·kg-1灌胃,藥物給藥劑量按人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比較表換算,各組連續(xù)干預(yù)1個(gè)月。

    2.2.3 空間學(xué)習(xí)記憶能力考察干預(yù)1個(gè)月后,Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,包括定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)完善準(zhǔn)備工作,水的高度為高過站臺(tái)0.5~1.0 cm,池子水溫保持在24 ℃左右,最后加入奶粉使水變渾濁,以看不見臺(tái)子為準(zhǔn),并在水迷宮上固定標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)前 30 min 讓動(dòng)物熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。把實(shí)驗(yàn)大鼠依次編號(hào),實(shí)驗(yàn)期間按照固定順序?qū)嶒?yàn),不能更改。取出實(shí)驗(yàn)大鼠按照順序依次從水迷宮第一象限面向池壁放入水中,然后開始記錄,保證周圍環(huán)境的穩(wěn)定。設(shè)置軟件記錄時(shí)間為1 min,當(dāng)實(shí)驗(yàn)大鼠到達(dá)站臺(tái)并上臺(tái)停留3 s則視為找到臺(tái)子,錄像自動(dòng)停止,若實(shí)驗(yàn)小鼠沒有找到臺(tái)子則1 min自動(dòng)停止。當(dāng)小鼠沒有找到臺(tái)子,實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在錄像停止后引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠上站臺(tái),讓其在臺(tái)子上停留 30 s 以熟悉周邊環(huán)境。前5 d訓(xùn)練,從第一象限開始,當(dāng)實(shí)驗(yàn)大鼠依次做完一遍,然后按照同樣要求在第二、三、四象限重復(fù)實(shí)驗(yàn),共做4遍。第6天實(shí)驗(yàn)需撤掉站臺(tái),然后選擇站臺(tái)所在象限的對側(cè)象限為入水點(diǎn),只做1次,數(shù)據(jù)采集完成后使用軟件進(jìn)行分析。

    2.2.4 炎性因子檢測按照試劑盒操作說明,用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定各指標(biāo)的水平。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的可測范圍分別為4~500 ng·L-1、30~4 000 ng·L-1、15~2 000 ng·L-1和2~200 ng·L-1,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

    2.2.5 NF-κB、p65/p50蛋白表達(dá)檢測運(yùn)用Western blot法檢測NF-κB、p65/p50蛋白的表達(dá)水平。取大鼠海馬組織,利用RIPA細(xì)胞裂解液(含PMSF和磷酸酶抑制劑)進(jìn)行裂解,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定后,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)法將樣本轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗按照1:1 000比例進(jìn)行稀釋,4 ℃孵育過夜,使用緩沖液重復(fù)洗滌3次,每次10 min,然后按照1:5 000 比例配置HRP標(biāo)記的二抗稀釋液,將條帶置于二抗,室溫孵育2 h后,使用緩沖液重復(fù)洗滌三次,每次10 min,按照化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書的步驟進(jìn)行顯影,利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測,并用圖像處理軟件Gelpro32對條帶進(jìn)行光密度分析。

    2.3 結(jié)果

    2.3.1 空間學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較與假手術(shù)組比較,模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05),目標(biāo)象限時(shí)間比明顯較小(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05),目標(biāo)象限時(shí)間比明顯較大(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組和低劑量組之間各項(xiàng)指標(biāo)比較差異不明顯(P>0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力對比

    2.3.2 海馬區(qū)炎性因子水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組和癡呆健腦方低劑量組IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α各項(xiàng)指標(biāo)比較差異不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    表3 各組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平比較

    2.3.3 NF-κB、p65/p50表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組及癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū) NF-κB、p65/p50蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組與癡呆健腦方低劑量組NF-κB、p65/p50蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4,圖7。

    表4 各組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白水平比較

    圖7 蛋白表達(dá)條帶圖

    3 討論

    血管性癡呆屬中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇,《雜病源流犀燭·中風(fēng)源流》“中風(fēng)后善忘”是有關(guān)本病的較早記載[7]。《類證治裁》載“血瘀于內(nèi),則善忘如狂”,即瘀血阻滯腦脈而致腦失充養(yǎng),神靈失用,則發(fā)為癡呆[8]。血管性癡呆與心、肝、脾、腎等臟腑功能失調(diào)相關(guān),其發(fā)病與年齡、情志、痰濁和瘀血關(guān)系密切,為本虛標(biāo)實(shí)之證[9]。目前,血管性癡呆西醫(yī)治療以預(yù)防和改善癥狀為主,尚無針對本病病理干預(yù)的藥物用于臨床,作為中西醫(yī)協(xié)同攻關(guān)優(yōu)勢病種,中醫(yī)藥治療本病優(yōu)勢逐漸彰顯[10-11]。癡呆健腦方是全國名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師臨床經(jīng)驗(yàn)方,方中諸藥合用,共奏益腎填髓、滌痰開竅和祛瘀通絡(luò)之功[4]。前期臨床小樣本研究已初見成效[12],但其治療本病的有效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理尚需進(jìn)一步探究。

    本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示,癡呆健腦方活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與血管性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)10個(gè);富集分析獲取GO條目867條,其中生物過程730條、分子功能90條、細(xì)胞組分47條;KEGG富集獲取通路26條;參與的信號(hào)通路主要為MAPK、PI3K-Akt、TNF和NF-κB等信號(hào)通路。

    鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限性,本研究同時(shí)以改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈分次結(jié)扎法[12]制作動(dòng)物模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。采用Morris水迷宮對大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力進(jìn)行檢測[13],結(jié)果顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加,目標(biāo)象限時(shí)間比明顯升高,提示該藥能有效提升血管性癡呆大鼠空間位置感和方向感。

    血管性癡呆發(fā)病機(jī)制雖不十分明確,但炎癥反應(yīng)機(jī)制卻備受關(guān)注[14-15],過度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡,觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),加劇本病發(fā)展;抑制炎癥反應(yīng)則有助于神經(jīng)元細(xì)胞存活,改善臨床癥狀與預(yù)后[16]。研究證實(shí),通過抑制VD大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化,降低IL-1β、IL-18、TNF-α等因子釋放,可減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞損害,改善學(xué)習(xí)記憶能力[17-19]。本研究顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等炎性因子水平降低明顯,提示癡呆健腦方可通過降低海馬區(qū)炎性因子表達(dá)水平改善血管性癡呆臨床癥狀。

    NF-κB主要由p65、p50的兩個(gè)亞基以同源或異源二聚體形式組成的轉(zhuǎn)錄因子,可以控制DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞存活,廣泛參與細(xì)胞對各種刺激的應(yīng)答[20]。作為腦缺血損傷反應(yīng)最早的關(guān)鍵炎癥因子,NF-κB通過增強(qiáng)TNF-α、IL-1β等促炎癥因子表達(dá),間接促進(jìn)炎癥反應(yīng)[21]。研究表明,NF-κB與腦內(nèi)免疫和應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[22],當(dāng)NF-κB 抑制劑濃度在腦外傷周圍組織中明顯升高時(shí),可減輕繼發(fā)性腦損傷并降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)。抑制NF-κB信號(hào)通路,可減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞功能,延緩血管性癡呆疾病進(jìn)程[23]。本研究顯示,與模型組比較,癡呆健腦方高、低劑量組大鼠海馬區(qū)NF-κB、p65/p50蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)合炎癥因子檢測結(jié)果,提示癡呆健腦方可通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路,抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展,從而改善認(rèn)知功能,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)于NF-κB信號(hào)通路作用機(jī)理的推測[24]。

    本研究整合了疾病基因和藥物PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),對癡呆健腦方治療血管性癡呆關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了有效篩選和富集分析,明確了藥物發(fā)揮療效的潛在機(jī)制,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其療效和作用機(jī)制。鑒于目前血管性癡呆患者樣本數(shù)據(jù)相對較少,本研究也存在一定局限性。隨著TCGA、GEO等大型疾病基因數(shù)據(jù)庫快速建設(shè),越來越多基因芯片信息將被整合到中藥研究中,因此,持續(xù)深化癡呆健腦方治療血管性癡呆關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制,闡明癡呆健腦方對血管性癡呆深層保護(hù)機(jī)制仍然是今后研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

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