運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)促進(jìn)GSH/Bcl-2合成及相互作用抑制阿霉素心臟損傷

王傳志，張雙雙，郝月蓉，羅立杰，原陽(yáng)*

運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)促進(jìn)GSH/Bcl-2合成及相互作用抑制阿霉素心臟損傷

王傳志1，張雙雙1，郝月蓉1，羅立杰2，原陽(yáng)1*

（1. 青島大學(xué) 體育學(xué)院，山東 青島 266071；2. 濟(jì)寧學(xué)院 體育學(xué)院，山東 濟(jì)寧 273155）

目的：基于代謝組學(xué)分析，探究GSH與B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相互作用在一次性運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）抑制阿霉素（doxorubicin，DOX）治療癌癥產(chǎn)生心肌毒性中的作用機(jī)制。方法：40只19周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照（control，C）組、DOX組、EP組、EP＋DOX組，每組10只。DOX組注射DOX，EP組大鼠進(jìn)行1次大強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)，EP＋DOX組于EP后24 h注射DOX。通過心臟超聲檢測(cè)大鼠心功能；通過化學(xué)熒光免疫分析法檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物表達(dá)水平；通過組織學(xué)染色、透射電鏡觀察和分析大鼠心肌組織病理變化；通過Western Blot檢測(cè)心肌凋亡及促存活基因相關(guān)蛋白表達(dá)；通過代謝組學(xué)分析探究心肌代謝物和代謝通路變化；通過免疫共沉淀法檢測(cè)Bcl-2與GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2-酮戊二酸載體（2-oxoglutarate carrier，OGC）的結(jié)合活性；通過免疫熒光雙標(biāo)法分析GSH與Bcl-2共定位水平。結(jié)果：DOX組大鼠心肌線粒體腫脹、外膜破裂、體積增大、線粒體嵴排列紊亂甚至斷裂，線粒體基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)云絮狀結(jié)構(gòu)。與C組相比，DOX組大鼠心功能顯著更低；心肌損傷指標(biāo)血清c Tn I、LDH、丙二醛含量顯著更高；心肌細(xì)胞損傷、纖維化、炎癥癥狀明顯；心肌細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著更低，Bad、Bax、Caspase3等凋亡蛋白表達(dá)顯著更高；YAP磷酸化水平顯著更高；GSH、NAD＋代謝水平顯著更低；Bcl-2與OGC結(jié)合程度顯著更低；Bcl-2與GSH共定位水平顯著更低。與DOX組相比，EP＋DOX組上述指標(biāo)均呈不同程度改善。結(jié)論：經(jīng)典形式的EP通過促進(jìn)GSH/Bcl-2相互作用，可以減輕DOX治療引起的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥及纖維化，改善心功能。

運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)；阿霉素；心臟毒性；B細(xì)胞淋巴瘤-2；谷胱甘肽

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）發(fā)布的全球癌癥2020年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌發(fā)病率超越肺癌，已成為全球癌癥發(fā)病率最高的癌種，約有230萬新發(fā)病例，占全部新發(fā)病例的11.7%（Sung et al.，2021）。阿霉素（doxorubicin，DOX）作為一種廣譜、高效、低廉的蒽環(huán)類抗癌一線用藥，在乳腺癌化療方案中處于核心地位（Pilco-Ferreto et al.， 2016）。但研究發(fā)現(xiàn)，該藥物由時(shí)間和劑量依賴性導(dǎo)致的心臟毒性，可造成嚴(yán)重的心肌病和充血性心力衰竭，臨床應(yīng)用受到限制（蘇毅馨等，2020）。DOX的心臟毒性機(jī)制包括心肌氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡和代謝異常，由于相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，難以從精準(zhǔn)藥物干預(yù)靶點(diǎn)角度找到干預(yù)措施（Rawat et al.， 2021）。右雷佐生（dexrazoxane，Dex）可在一定程度抑制DOX的心臟毒性，但有研究表明，與DOX連用可加重化療骨髓抑制（Reichardt et al.， 2018）。應(yīng)用β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管緊張素II受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）等間接治療手段對(duì)DOX心臟毒性的療效也有待進(jìn)一步循證證據(jù)佐證（蘇毅馨等，2020）。

運(yùn)動(dòng)對(duì)心血管機(jī)能的促進(jìn)效果被廣泛認(rèn)可，關(guān)于運(yùn)動(dòng)心臟保護(hù)效應(yīng)的抗氧化應(yīng)激、凋亡、線粒體質(zhì)量控制等機(jī)制的研究已較為充分，表明運(yùn)動(dòng)具備抗DOX損傷的潛力，作為補(bǔ)充療法具有重要價(jià)值（Bernardo et al.， 2018），經(jīng)典形式的運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）通過高強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)造成心肌反復(fù)短暫的缺血缺氧，觸發(fā)內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)，使心肌在隨后持續(xù)性缺血缺氧損傷中得到保護(hù)，機(jī)制層面認(rèn)為可能與線粒體能量代謝相關(guān)（原陽(yáng)等，2015）。在DOX治療前24 h進(jìn)行1次運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防心功能障礙，短期和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可有效抑制急性單次劑量DOX（10～20 mg/kg體質(zhì)量）所致的心臟氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡（Lien et al.， 2015），但更多的相關(guān)物質(zhì)代謝機(jī)制仍不明確。研究指出，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合精氨酸補(bǔ)劑可增強(qiáng)谷胱甘肽（glutathione， GSH）活性，促進(jìn)抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力（Ranjbar， 2022）。但運(yùn)動(dòng)是否通過改善GSH代謝及GSH/Bcl-2相互作用促進(jìn)GSH轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，發(fā)揮抗DOX心臟損傷的作用，還有待進(jìn)一步證實(shí)。

心肌炎癥、心肌纖維化、心力衰竭是DOX心臟毒性的主要表現(xiàn)形式，線粒體氧化應(yīng)激損傷是誘導(dǎo)DOX心臟毒性的重要因素（Rawat et al.， 2021）。GSH是生物體內(nèi)含量最為豐富的抗氧化因子，可清除ROS以維持機(jī)體抗氧化防御水平，調(diào)節(jié)氧化還原依賴性細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，主要通過線粒體膜內(nèi)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2-酮戊二酸載體（2-oxoglutarate carrier，OGC）進(jìn)入線粒體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用（Wilkins et al.， 2014），Bcl-2可通過與OGC相互作用促進(jìn)GSH轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，并協(xié)同GSH對(duì)抗線粒體氧化應(yīng)激損傷（Wilkins et al.， 2014）。此外，Bcl-2還可抑制GSH泄漏，改善Bax途徑的細(xì)胞凋亡（Chong et al.， 2020）。本研究在大鼠注射DOX前進(jìn)行1次EP，從EP抗氧化應(yīng)激損傷、抗凋亡角度分析EP抑制DOX心肌毒性的內(nèi)在機(jī)制，為EP干預(yù)抑制DOX心臟毒性提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 動(dòng)物分組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

健康19周齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量為（300±20）g，購(gòu)自斯貝福動(dòng)物中心［合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，中國(guó)北京］。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)（5只/籠），自由飲食，室溫為22～24 ℃，相對(duì)空氣濕度為40%～70%，光照時(shí)間為12 h/d。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：對(duì)照（control， C）組、DOX組、EP組和EP＋DOX組，10只/組，每天監(jiān)測(cè)大鼠存活率。干預(yù)方案如圖1所示，正式實(shí)驗(yàn)處理前，EP組和EP＋DOX組進(jìn)行連續(xù)5天的跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，速度為15 m/min，時(shí)間為15 min，坡度為0°；適應(yīng)訓(xùn)練期間C組和DOX組置于跑臺(tái)環(huán)境，適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后休息2天進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)中，EP組和EP＋DOX組進(jìn)行1次大強(qiáng)度間歇性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為25 m/min（75%V.O2max），運(yùn)動(dòng)10 min，休息10 min，重復(fù)4次，全程80 min（陳天然等，2021）。EP干預(yù)24 h后，EP＋DOX組和DOX組腹腔注射DOX（20 mg/kg）（Kosoko et al.， 2017； Saleh et al.， 2022），各組大鼠5天后取材（Cao et al.， 2014）。

1.2 動(dòng)物取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.2.1 心臟超聲

采用心臟超聲檢測(cè)采集各組大鼠心臟功能指標(biāo)。將大鼠放置于含有2%動(dòng)物用吸入式麻醉氣體異氟烷的麻醉機(jī)（瑞沃德R5835，中國(guó)）中進(jìn)行麻醉，麻醉完畢后，將大鼠胸前毛發(fā)剃除暴露出心臟部位皮膚，固定于心肺功能測(cè)試和心電圖（electrocardiogram，ECG）檢測(cè)平臺(tái)上，應(yīng)用超聲傳導(dǎo)導(dǎo)電膠優(yōu)化清晰度，使用高分辨率超聲心動(dòng)圖成像系統(tǒng)（飛依諾V6，中國(guó)）檢測(cè)心臟功能。在長(zhǎng)軸視圖中對(duì)心臟進(jìn)行二維M-mode成像，并評(píng)估心臟功能。

圖1 運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)方案示意圖

Figure 1.Exercise Experimental Protocol

1.2.2 血液樣本和心肌組織樣本采集與處理

腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg體質(zhì)量）進(jìn)行麻醉，將麻醉后大鼠仰臥位固定于解剖臺(tái)，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血5 mL，常溫靜置30 min后，放入低溫離心機(jī)以4 000 r/min 離心10 min，提取血清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

每組隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行灌注固定：于心尖處插入灌注針，先注入1%的肝素2 mL，再快速灌注0.9%生理鹽水230～250 mL，待流出血液基本無色后，取出心臟并用PBS洗凈殘留血液，放入4%多聚甲醛室溫固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，制作相鄰切片，用于后續(xù)組織學(xué)染色，每組其余5只大鼠麻醉取血后，打開胸腔，取出心臟，-80 ℃保存，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 心肌形態(tài)觀察與心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

取約1 mm3心尖組織，戊二醛4 ℃固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS漂洗15 min×3次，1%鋨酸溶液固定2 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗10 min×2次，丙酮梯度脫水（30%、50%、70%、90%）各10 min，100%脫水10 min×3次，Epon812樹脂浸透、包埋、聚合。超薄切片機(jī)切片（50～60 nm），鈾染色30 min，鉛染色10 min，透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

使用心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，c Tn I）檢測(cè)試劑盒（索萊寶科技有限公司，中國(guó)）檢測(cè)c Tn I含量。使用乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（lactate dehydrogenase，LDH；索萊寶科技有限公司，中國(guó)）測(cè)定LDH，按照試劑盒說明書操作，待測(cè)液混勻，室溫靜置5 min，酶標(biāo)儀450 nm線性范圍測(cè)定吸光度。采用丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（索萊寶科技有限公司，中國(guó)），檢測(cè)心肌組織勻漿上清中MDA含量。

1.2.4 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)

1.2.4.1 心肌組織HE染色

心肌組織4%多聚甲醛后固定，OCT包埋冰凍切片厚度10 μm，每組5個(gè)切片：依次將切片放入二甲苯I 20 min—二甲苯II 20 min—無水乙醇II 5 min—無水乙醇II 5 min—75% 酒精5 min，用純凈水洗凈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）。蘇木素染色：切片入蘇木素染色3～5 min，用純凈水清洗，分化液分化，用流水沖洗，直至核返藍(lán)（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水5 min，入伊紅染液染色5 min（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。脫水封片：切片依次放入無水乙醇I 5 min—無水乙醇II 5 min—二甲苯I 5 min—二甲苯 II 5 min透明，用中性樹膠封片（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)），留作顯微鏡鏡檢和圖像采集（Leica Microsystems Ltd，德國(guó)）分析。

1.2.4.2 心肌組織纖維化Masson染色

常規(guī)脫蠟至水，方法同前。切片浸入Masson A液中浸泡過夜（碧云天生物技術(shù)，中國(guó)），流水沖洗；切片放入Masson B液及Masson C液等比混合的染液，浸染1 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，自來水洗；切片入Masson D液浸染6 min，純凈水漂洗；Masson E液浸染1 min，不水洗，稍瀝干直接入Masson F液染色20～30 s；切片用1%冰醋酸漂洗分化，梯度酒精脫水、中性樹膠封片，進(jìn)行圖像采集（Leica Microsystems Ltd，德國(guó)）并分析。

1.2.4.3 心肌組織免疫組化炎性標(biāo)記物IL-1β染色

對(duì)于IL-1β免疫組織化學(xué)染色，切片在3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，山羊血清封閉，4 ℃加入IL-1β抗體孵育過夜。隨后37 ℃二抗孵育15 min，組織PBS下清洗，0.05%二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）1 min分色與蘇木精復(fù)染5 min。最后，經(jīng)過脫水和滲透，中性樹膠密封。顯微鏡（Nikon AIR HD25，日本）下觀察IL-1β染色陽(yáng)性的細(xì)胞，采用Image J進(jìn)行圖像處理，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積。

1.2.5 心肌組織蛋白免疫印跡檢測(cè)

利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blotting）測(cè)定大鼠心肌組織與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。大鼠心肌組織提取總蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量分析調(diào)整蛋白濃度。加上樣緩沖液，100 ℃恒溫加熱10 min使蛋白變性。SDS凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜完畢后，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別孵育一抗（Beclin1、Bcl-2、Bnip3、Bad、Bax、Caspase3、TNF-α、YAP，抗體稀釋濃度均為1∶1 000，抗體購(gòu)自塞維爾生物技術(shù)有限公司），4 ℃過夜，加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)各蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 心肌組織代謝組學(xué)LC-MS分析

取100 mg液氮研磨的組織樣本，置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000 g，4 ℃離心20 min；取一定量的上清液加質(zhì)譜級(jí)的水稀釋至甲醇含量為53%；15 000 g，4 ℃離心20 min，收集上清，進(jìn)樣LC-MS進(jìn)行分析。

本研究中，使用色譜（Xselect HSS）分析大鼠心肌組織代謝物。采用T3色譜柱（2.1 mm×150.0 mm，2.5 μm）進(jìn)行色譜分離。使用乙腈中含0.1% 甲酸的溶液作為流動(dòng)相A，水中含0.1%甲酸的溶液作為流動(dòng)相B。柱溫50 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫。在質(zhì)譜儀（Q Exactive? HF，中國(guó)）上用電噴霧進(jìn)行質(zhì)譜分析。m/z范圍設(shè)定為100～1 500的全景掃描模式。電離模式的條件設(shè)置如下：電噴霧毛細(xì)管電壓3.2 kv；氣體溫度為550 ℃。

將下機(jī)數(shù)據(jù)（格式為.raw）文件導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1軟件進(jìn)行處理，對(duì)每個(gè)代謝物進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡(jiǎn)單篩選，然后設(shè)置保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm對(duì)不同樣品進(jìn)行峰值比對(duì)和選取，使鑒定更準(zhǔn)確，隨后設(shè)置質(zhì)量偏差5 ppm、信號(hào)強(qiáng)度偏差30%。信噪比、最小信號(hào)強(qiáng)度、加和離子等信息進(jìn)行提取，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用空白樣本去除背景離子，并對(duì)原始定量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)代謝物進(jìn)行定量。

1.2.7 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)GSH與Bcl-2共定位

每組隨機(jī)選取5個(gè)樣本，石蠟切片（5 μm）室溫下進(jìn)行30 min×3次的二甲苯脫蠟，確保脫蠟完全，以防止石蠟的非特異性熒光干擾。梯度酒精依次通過10 min×2次的100%酒精、5 min×2次的95%酒精、5 min的85%酒精、5 min的75%酒精，水洗3 min×3次。PBS（1 mM）平衡5 min×3次后，室溫10 min復(fù)合消化液消化，PBS浸洗5 min×4次，10%山羊血清封閉20 min，甩去封閉液，滴加不同源的兔抗大鼠GSH與小鼠抗大鼠Bcl-2一抗混合液，一抗?jié)舛确謩e為1∶100。濕盒4 ℃過夜，復(fù)溫10 min，PBS浸洗5 min×3次，滴加山羊抗兔FITC和山羊抗小鼠CY3混合二抗，稀釋濃度分別為1∶100，37 ℃孵育1 h。PBST（PBS中添加1∶1 000的Tween 20）浸洗5 min×4次，滴加1∶1 000稀釋的DAPI，室溫條件下對(duì)細(xì)胞核復(fù)染10 min，PBS浸洗5 min×3次，滴加少量抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，2天內(nèi)完成拍攝。利用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中，一抗孵育后所有步驟均避光進(jìn)行。

采用共聚焦顯微鏡（Nikon AIR HD25，日本）進(jìn)行圖像采集，激光掃描參數(shù)保持一致。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每組25個(gè)視野。采集的圖像包括紅、綠、藍(lán)3個(gè)通道，以及合成圖。圖像分析采用IMARIS X64 9.0.1軟件，利用四象限散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)紅綠熒光像素點(diǎn)離散情況。

進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性區(qū)域熒光強(qiáng)度、Bcl-2與GSH的共定位系數(shù)百分比（Manders’ co-localization coefficients）等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.8 免疫共沉淀檢測(cè)Bcl-2與OGC的相互作用

心肌組織剪成細(xì)小碎片，IP細(xì)胞裂解液加入PMSF混勻，按照20 mg組織加入100～200 μL裂解液，玻璃勻漿器勻漿，勻漿后4 ℃在離心機(jī)中以14 000 g離心5 min，收集上清液備用。進(jìn)行磁珠預(yù)處理，對(duì)磁珠進(jìn)行混懸，取50 μL磁珠，加入400 μL PBST放于磁力架，進(jìn)行磁性分離，棄上清，重復(fù)2次。將稀釋好的400 μL抗體加入磁珠中，在4 ℃翻轉(zhuǎn)混合儀混懸2 h，棄上清液搜集磁珠。加入400 μL PBST磁性分離，棄上清，重復(fù)4次。加入400 μL離心后的勻漿上清液，充分將磁珠與抗原抗體混合，4 ℃過夜，加入400 μL PBST洗4次，棄上清，加入1×loading buffer 在95～100 ℃煮沸5 min，采用Western Blot分析Bcl-2與OGC的結(jié)合關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

代謝組數(shù)據(jù)使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//hmdb.ca/metabolites）和LIPID Map數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.lipidmaps.org/）對(duì)鑒定到的代謝物進(jìn)行注釋。使用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘法判別分析，進(jìn)而得到每個(gè)代謝物的VIP值。單變量分析部分，采用檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)各代謝物在2組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并計(jì)算代謝物在2組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）。差異代謝物篩選的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為＞1，＜0.05且≥2或≤0.5。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，同時(shí)滿足正態(tài)分布與方差齊性條件下，對(duì)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)，通過對(duì)數(shù)、倒數(shù)等轉(zhuǎn)換滿足條件后再進(jìn)行分析。采用LSD事后檢驗(yàn)比較組間差異性，以＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 EP對(duì)DOX誘導(dǎo)心臟功能損傷的影響

大鼠心臟功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，DOX組射血分?jǐn)?shù)（DOX組 vs C組，65.67%±7.58% vs 83.83%±6.96%，＜0.01；圖2B）、短軸縮短率（DOX組 vs C組，31.64%±5.52% vs 53.71%±8.83%，＜0.01；圖2C）、心臟收縮末期左室后壁厚度［DOX組 vs C組，（2.62±0.26）mm vs （3.56±0.33）mm，＜0.01；圖2D］、左心室收縮末期容積［DOX組 vs C組，（0.32±0.14）mL vs（0.13±0.07）mL，＜0.05）；圖2E］、每搏輸出量［DOX組 vs C組，（0.31±0.17）mL vs （0.61±0.36）mL，＜0.01；圖2F］顯著更低。與DOX組相比，EP＋DOX組上述指標(biāo)均顯著改善（＜0.05）。

圖2 運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心功能的影響

Figure 2.Effect of Exercise Preconditioning on Heart Function Induced by Doxorubicin in Rats

注：A.心臟超聲的代表性圖像，2.Time表示一個(gè)心率周期內(nèi)的第二次測(cè)試；EF.射血分?jǐn)?shù)；FS.短軸縮短率；LVPW.心臟收縮末期左室后壁厚度；LVESV.左心室收縮末期容積；SV.每搏輸出量；與C組相比，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001；與DOX組相比，#＜0.05，##＜0.01；下同。

大鼠心肌MDA、LDH、 c Tn I結(jié)果顯示，與C組相比，DOX組MDA ［DOX組 vs C組，（2.60±0.33）μmol/mL vs（1.20±0.21）μmol/mL，＜0.001；圖2G］、LDH［DOX組 vs C組，（150.52±19.23）U/L vs（47.68±2.50）U/L，＜0.001；圖2H］、c Tn I［DOX組 vs C組，（278.68±19.50）pg/mL vs（103.41±31.69）pg/mL，＜0.001；圖2I］均顯著更高；與DOX組相比，EP＋DOX組上述指標(biāo)均顯著更低，與EP組相比，EP＋DOX組c Tn I［EP組 vs EP＋DOX組，（147.96±31.31）pg/mL vs（145.64±8.49）pg/mL，＞0.05；圖2I］未呈現(xiàn)顯著性差異。

2.2 EP對(duì)DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌組織病理和超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，在3 000×倍數(shù)下，C組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，核膜平整、心肌細(xì)胞排列規(guī)整、肌原纖維排列緊密、線粒體形態(tài)飽滿、呈橢圓形緊密排列、線粒體嵴電子密度較高。DOX組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性改變，核膜不規(guī)則凸起增多、染色質(zhì)邊集、肌原纖維斷裂、肌絲排列紊亂、明暗帶不清晰，線粒體則出現(xiàn)變形變小，數(shù)量增多，間隙變大，呈球形，閏盤排列紊亂，橋粒連接斷開，并出現(xiàn)一定的縫隙連接擴(kuò)張。EP明顯改善上述結(jié)構(gòu)損傷。5 000×、8 000×倍數(shù)下可見DOX組部分線粒體腫脹外膜破裂，腫脹的線粒體體積增大，線粒體嵴排列紊亂甚至斷裂，線粒體基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)云絮狀結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，在各個(gè)組別均發(fā)現(xiàn)不同程度的線粒體自噬體，DOX組的自噬體初級(jí)溶酶體顆粒增多，存在線粒體降解痕跡，提示線粒體自噬的發(fā)生，EP＋DOX組上述情況有所改善（圖3）。

圖3 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡結(jié)果

Figure 3.Transmission Electron Microscopic Results of the Ultrastructure of Myocardial Cells in Rats

HE染色發(fā)現(xiàn)C組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列相對(duì)整齊規(guī)則，胞漿紋理清晰，纖維化表現(xiàn)少見；而DOX組心肌細(xì)胞間隙有增大趨勢(shì)，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞間隙變寬（圖4A），Image J軟件測(cè)量細(xì)胞面積結(jié)果表明DOX組細(xì)胞顯著小于C組［DOX組vs C組，（283.43±80.15）μm2vs （426.12±113.35）μm2，＜0.05；圖4B］，1次EP抑制DOX引起細(xì)胞皺縮。Masson染色可見DOX組藍(lán)色膠原纖維（黑色箭頭）、心肌纖維化明顯，而EP＋DOX組纖維化程度較小，進(jìn)一步利用圖像分析軟件測(cè)量藍(lán)色膠原纖維面積，EP＋DOX組較DOX組更?。跡P＋DOX組vs DOX組，（17 347.23± 2 125.34）μm2vs （21 657±3 987.98）μm2，＜0.01；圖4C］。IL-1β免疫組織染色顯示（圖4A），C組染色陽(yáng)性褐色顆粒較少，DOX組陽(yáng)性區(qū)域明顯，分散于心肌組織。EP＋DOX組仍可見陽(yáng)性區(qū)域，但較DOX組陽(yáng)性面積更小。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，DOX組陽(yáng)性面積顯著高于C組［DOX組vs C組，（13 142.38±5 825.34）μm2vs （5 687.32±4 215.65）μm2，＜0.05；圖4D］，EP＋DOX組陽(yáng)性區(qū)域面積顯著低于DOX組［EP＋DOX組vs DOX組，（8 743.13±5 646.91）μm2vs （13 142.38±5 825.34）μm2，＜0.05］。

2.3 EP對(duì)DOX誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

大鼠心肌免疫印跡結(jié)果顯示，與C組相比，DOX組的大鼠心肌組織Bax（DOX組vs C組，1.38±0.02 vs 1.17±0.16，＜0.05；圖5B）、Bad（DOX組vs C組，1.06±0.05 vs 0.69±0.13，＜0.05；圖5C）、Bnip3（DOX組vs C組，1.30±0.09 vs 0.79±0.12，＜0.01；圖5D）、TNF-α（DOX組vs C組，1.03±0.21 vs 0.60±0.11，＜0.01；圖5E）、Caspase3（DOX組vs C組，1.38±0.10 vs 0.79±0.21，＜0.01；圖5F）表達(dá)均顯著更高。與C組相比，DOX組Bnip3/Bcl-2（DOX組vs C組，1.84±0.55 vs 0.55±0.17，＜0.001；圖5H）、Beclin1/Bcl-2（DOX組vs C組，0.42±0.17 vs 0.21±0.08，＜0.01；圖5I）、Bax/Bcl-2（DOX組vs C組，1.93±0.49 vs 0.82±0.29，＜0.001；圖5J）、Bad/Bcl-2（DOX組vs C組，1.50±0.44 vs 0.49±0.18，＜0.001；圖5K）均顯著更高（＜0.01，＜0.001，Bcl-2（DOX組vs C組，0.75±0.22 vs 1.49±0.25，＜0.01；圖5L）、YAP（DOX組vs C組，0.48±0.12 vs 0.98±0.11，＜0.05；圖5M）表達(dá)顯著更低（＜0.01，＜0.05；圖5L、M）。與DOX組相比，EP＋DOX組Bax（EP＋DOX組vs DOX組，0.94±0.06 vs 1.38±0.02，＜0.05；圖5B）、Bad（EP＋DOX組vs DOX組，0.73±0.13 vs 1.06±0.04，＜0.05；圖5C）、Bnip3（EP＋DOX組vs DOX組，0.63±0.43 vs 1.30±0.11，＜0.05；圖5D）、TNF-α（EP＋DOX組vs DOX組，0.35±0.07 vs 1.03±0.21，＜0.01；圖5E）、Caspase3（EP＋DOX組vs DOX組，1.11±0.49 vs 1.37±0.10，＜0.05；圖5F）、P-YAPS127/YAP（EP＋DOX組vs DOX組，1.00±0.19 vs 1.39±0.15，＜0.05；圖5O）顯著更低，Beclin1（EP＋DOX組vs DOX組，0.23±0.02 vs 0.28±0.05，＜0.05；圖5G）未呈現(xiàn)顯著性差異，Bcl-2（EP＋DOX組vs DOX組，1.84±0.44 vs 0.75±0.23，＜0.01；圖5L）表達(dá)顯著上升。與DOX組相比，EP＋DOX組Bnip3/Bcl-2（EP＋DOX組vs DOX組，0.32±0.17 vs 1.84±0.55，＜0.001；圖5H）、Beclin1/Bcl-2（EP＋DOX組vs DOX組，0.13±0.02 vs 0.42±0.17，＜0.01；圖5I）、Bax/Bcl-2（EP＋DOX組vs DOX組，0.53±0.13 vs 1.93±0.49，＜0.001；圖5J）、Bad/Bcl-2（EP＋DOX組vs DOX組，0.41±0.04 vs 1.50±0.44，＜0.001；圖5K）均顯著更低。

2.4 EP抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞代謝紊亂

大鼠心肌組織代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，DOX組GSH（DOX組vs C組，1.40×107±5.29×106vs 3.22×107±6.74×106，＜0.01；圖6A）、亞精胺（DOX組vs C組，1.93×106±5.1×105vs 2.51×106±6.1×105，＜0.05；圖6F）、鳥氨酸（DOX組vs C組，3.59×105±6.64×104vs 5.41×105±1.12×105，＜0.05；圖6G）、NAD＋（DOX組vs C組，7.66×104±3.84×104vs 11.39×104±7.08×104，＜0.05；圖6I）、NMN（DOX組vs C組，1.01×105±3.65×104vs 2.11×105±1.12×105，＜0.05；圖6K）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（DOX組vs C組，7.21×103±5.09×103vs 2.75×104±4.66×103，＜0.05；圖6L）、脫氧三磷酸腺苷（DOX組vs C組，5.29×103±2.12×103vs 7.16×103±4.61×103，＜0.05；圖6P）等代謝物相對(duì)富集含量顯著更低，而氧化谷胱甘肽（DOX組vs C組，3.63×106±1.08×106vs 2.75×106±2.59×105，＜0.05；圖6B）、谷氨酸（DOX組vs C組，1.28×108±2.49×107vs 1.06×108±1.95×107，＜0.05；圖6C）、谷氨酰胺（DOX組 vs C組，2.41×108±1.16×107vs 2.29×108±1.61×107，＜0.05；圖6D）、精氨酸（DOX組vs C組，1.92×107±3.27×106vs 1.51×107±6.92×105，＜0.05；圖6E）、甘氨酸（DOX組 vs C組，3.19×105±7.34×104vs 2.84×105±6.78×104，＜0.05；圖6H）、丙酮酸（DOX組vs C組，1.78×104±4.94×103vs 1.44×104±5.64×103，＜0.05；圖6M）水平顯著更高。與DOX組相比，EP＋DOX組GSH（EP＋DOX組vs DOX組，3.03×107±9.48×106vs 1.40×107±5.29×106，＜0.01；圖6A）、亞精胺（EP＋DOX組vs DOX組，4.73×106±7.66×105vs 1.93×106±5.1×105，＜0.01；圖6F）、NAD＋（EP＋DOX組vs DOX組，4.73×106±7.66×105vs1.93×106±5.1×105，＜0.05；圖6I）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（EP＋DOX組vs DOX組，2.07×105±5.96×104 vs 7.27×104±1.63×104，＜0.01；圖6J）、β煙酰胺單核苷酸（EP＋DOX組vs DOX組，5.32×105±2.54×105vs 1.01×105±3.65×104，＜0.001；圖6K）等代謝物富集水平顯著更高。而氧化谷胱甘肽（EP＋DOX組vs DOX組，2.19×106±6.16×105vs 3.63×106±1.08×106，＜0.05；圖6B）、谷氨酸（EP＋DOX組vs DOX組，1.07×108±1.97×107vs 1.28×108±2.49×107，＜0.05；圖6C）、谷氨酰胺（EP＋DOX組vs DOX組，1.85×108±3.19×107vs 2.41×108±1.16×107，＜0.01；圖6D）、精氨酸（EP＋DOX組vs DOX組，1.13×107±4.05×106vs 1.92×107±3.28×106，＜0.01；圖6E）等代謝物富集程度顯著更低。

圖4 EP對(duì)DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌組織的影響（400×）

Figure 4.Effect of EP on DOX-Induced Myocardial Tissue in Rats （400×）

注：A.心肌組織病理染色；B.大鼠心肌HE定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C.大鼠心肌纖維化的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D.大鼠心肌IL-1β定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

EP對(duì)抗DOX心臟損傷涉及GSH合成通路、NAD＋合成通路，精氨酸代謝通路，具體表現(xiàn)在下調(diào)精氨酸和谷氨酸等氨基酸水平、促進(jìn)谷氨酰胺代謝上調(diào)GSH、NAD＋水平（圖6A、E），對(duì)DOX引起的GSH、NAD＋、精氨酸、鳥氨酸等物質(zhì)代謝具有顯著改善效果（圖7C～E）。

2.5 GSH與Bcl-2相互作用影響EP抗DOX心臟損傷效果

大鼠心肌GSH與Bcl-2免疫熒光共定位檢測(cè)結(jié)果（400×，bar=100 μm）顯示，C組GSH為綠色免疫熒光陽(yáng)性產(chǎn)物均勻分布于心肌細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核為藍(lán)色。C組Bcl-2為紅色免疫熒光陽(yáng)性產(chǎn)物，成顆粒狀聚集分布于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核為藍(lán)色。C組圖像融合，可見GSH與Bcl-2共定位部分為黃色。與C組相比，DOX組GSH綠色熒光分散，GSH與Bcl-2共定位程度顯著更低（DOX組vs C組，38.30%±13.08% vs 55.78%±9.28%，＜0.05；圖8D），EP＋DOX組的GSH與Bcl-2的熒光強(qiáng)度以及共定位情況與C組相近，顯著高于DOX組（EP＋DOX組 vs DOX組，58.16%±12.15% vs 38.30%±13.08%，＜0.01；圖8D）。

Figure 5.Results of the Expression of Apoptosis-Related Proteins in Rats Myocardial Tissues

免疫共沉淀結(jié)果表明，Bcl-2和OGC免疫共沉淀和Bcl-2與GSH共定位百分比的共聚焦結(jié)果一致。結(jié)果顯示，與C組相比，DOX組Beclin1（DOX組vs C組，0.13±0.06 vs 0.20±0.03，＜0.05；圖9B）、Bax（DOX組vs C組，0.83±0.19 vs 1.22±0.29，＜0.05；圖9C）、OGC（DOX組vs C組，0.75±0.22 vs 1.49±0.25，＜0.01；圖9D）與Bcl-2相互作用顯著更弱。與DOX組相比，EP＋DOX組Beclin1（EP＋DOX組vs DOX組，0.26±0.02 vs 0.13±0.06，＜0.01；圖9B）、Bax（EP＋DOX組vs DOX組，1.23±0.13 vs 0.83±0.19，＜0.05；圖9C）、OGC（EP＋DOX組vs DOX組，1.64±0.24 vs 0.75±0.22，＜0.001；圖9D）與Bcl-2相互作用顯著更強(qiáng)。

注：oxidized GSH.氧化谷胱甘肽；L-Glutamate.谷氨酸；D-Glutamine.谷氨酰胺；L-Arginine.精氨酸；Spermidine.亞精胺；L-Ornithine.鳥氨酸；Glycine.甘氨酸；NADP.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NMN.β煙酰胺單核苷酸；NADH.還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；pyruvic acid.丙酮酸；alpha-Ketoglutaric acid.α-酮戊二酸；L-Malate.蘋果酸；dATP.脫氧三磷酸腺苷。

Figure 6.Comparison between Groups in the Contents of Key Substances of GSH-Related Metabolic Pathways

利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)KEGG、Wiki pathway、NDEx、PISCQUIC、String等數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于本研究主要代謝分子及關(guān)鍵蛋白互作PPI數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Cytoscape 3.8.2（http：//cytoscape.org）對(duì)機(jī)制重疊部分進(jìn)行分選，進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)研究及本研究的發(fā)現(xiàn)對(duì)本文的機(jī)制進(jìn)行繪制。具體機(jī)制可能主要涉及（圖10）：1）GSH的氧化還原生成機(jī)制；2）GSH的底物合成機(jī)制；3）Bcl-2促進(jìn)GSH基因表達(dá)機(jī)制；4）Bcl-2促進(jìn)GSH胞內(nèi)再分配等。

3 討論

EP作為一種強(qiáng)烈刺激因素，在極大提高心肌耗氧量的同時(shí)，造成反復(fù)短暫的缺血缺氧，通過增強(qiáng)線粒體相關(guān)能量代謝調(diào)控機(jī)制觸發(fā)內(nèi)源性保護(hù)（原陽(yáng)等，2015）。本研究中的EP模型沿用Domenech等（2002）提出的概念，即通過反復(fù)短時(shí)間大強(qiáng)度間歇有氧運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生類似于缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning）的內(nèi)源性心臟保護(hù)效果，使心肌在隨后持續(xù)性缺血缺氧損傷中得到保護(hù)。DOX心臟損傷藥代動(dòng)力學(xué)模型表明，DOX在體內(nèi)峰值濃度時(shí)間為注射后2～12 h（Reich et al.， 1979），EP的心臟保護(hù)效應(yīng)能夠較好覆蓋DOX在體內(nèi)的急性損傷作用期（王傳志等，2022）。本研究中單次EP顯示出良好的心臟保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn)，DOX所致心肌發(fā)生明顯的纖維化，細(xì)胞發(fā)生皺縮和炎性變化，基質(zhì)中可見炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，心肌纖維溶解破裂，透射電鏡可見部分線粒體腫脹破裂，結(jié)合氨基酸代謝異常和能量代謝異常進(jìn)一步證明了DOX心臟毒性的線粒體相關(guān)機(jī)制。與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)DOX所致的心肌損傷，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生代償性改變，心室擴(kuò)大，心臟泵血功能LVEF下降，是DOX引起心衰的重要原因（Gomes-Santos et al.， 2021）。DOX急性損傷性應(yīng)激還使肌細(xì)胞膜破裂，肌原纖維斷裂，細(xì)胞內(nèi)部的LDH、c Tn I泄漏至血液，造成血漿c Tn I、LDH水平急劇升高（Zou et al.， 2022）。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，DOX使心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志產(chǎn)物MDA、LDH、c Tn I含量升高并泄漏至血液，致使血漿c Tn I和LDH含量升高。本研究中，EP＋DOX組的c Tn I水平接近C組水平，推測(cè)與干預(yù)5天后心臟損傷標(biāo)志物恢復(fù)至基線水平有關(guān)。先前研究表明，由運(yùn)動(dòng)引起的c Tn I升高會(huì)在24 h內(nèi)逐漸恢復(fù)至基線水平（Stewart et al.， 2016）。

Figure 7.Volcano Map， a Cluster Heat Map and a Metabolic Pathway Analysis Map of Differential Metabolites

Beclin1是哺乳動(dòng)物自噬的重要介導(dǎo)基因，對(duì)于自噬的發(fā)生起著重要促進(jìn)作用，Bcl-2與Beclin1相互作用抑制自噬過程。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX引起B(yǎng)eclin1/Bcl-2顯著增高，提示自噬發(fā)生，這種現(xiàn)象可能與DOX導(dǎo)致的Bcl-2基因表達(dá)抑制有關(guān)，DOX刺激導(dǎo)致Beclin1/Bcl-2復(fù)合體解離（李宏玉等，2020），也使Bax、Caspase3蛋白表達(dá)增加，因此，DOX可能通過誘導(dǎo)過度自噬引起心肌細(xì)胞功能障礙和心肌細(xì)胞的凋亡。Beclin1/Bcl-2的比值也在一定程度上反映前凋亡與凋亡性自噬的程度（Yuan et al.， 2018）。結(jié)合DOX導(dǎo)致心肌線粒體氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果，本研究認(rèn)為線粒體功能障礙是心肌細(xì)胞凋亡和心臟形態(tài)機(jī)能改變的起始因素。前期研究發(fā)現(xiàn)（原陽(yáng)等，2015），EP誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)可恢復(fù)線粒體跨膜電位（ΔΨm）并維持Ca2＋穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步抑制線粒體內(nèi)Ca2＋泄漏和線粒體腫脹的發(fā)生，可以抑制線粒體細(xì)胞色素C（Cytochrome c，Cyt-c）等凋亡因子釋放，進(jìn)而通過Caspase3級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡（Xing et al.， 2022）。

唯BH-3類蛋白是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的前凋亡因子，也包括Beclin1。其他BH-3類凋亡蛋白與Bcl-2間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，加劇Beclin1介導(dǎo)的Ⅱ型凋亡發(fā)生，表明充分的Bcl-2合成對(duì)維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞活性起到重要作用（Yuan et al.， 2020）。Bcl-2也可通過抑制TNF-α降低炎性和凋亡信號(hào)表達(dá)（原陽(yáng)等，2015）（圖10），本研究中，DOX造成的TNF-α表達(dá)增加，炎性加重，EP有效促進(jìn)了Bcl-2表達(dá)，改善DOX引起的TNF-α高表達(dá)，因此EP改善DOX損傷可能與Bcl-2抑制炎性因子表達(dá)和降低細(xì)胞凋亡有關(guān)。Bcl-2腺病毒/E1B19k D相互作用蛋白3（bcl-2 adenovirus/E1B 19k D interacting protein 3，Bnip3）是另一種BH-3類促凋亡蛋白，在正常情況下也充當(dāng)自噬和線粒體自噬的誘導(dǎo)劑，以及造成線粒體膜通透性升高（Lee et al.， 2020）。在本研究中，DOX刺激導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bnip3，使Bnip3/Bcl-2比值升高。EP處理后，Bnip3和Beclin1表達(dá)顯著下降，因此，EP誘導(dǎo)的抗凋亡作用可能與Bnip3下調(diào)改善心肌線粒體穩(wěn)態(tài)、抗氧化狀態(tài)、抗凋亡水平密切相關(guān)。在EP＋DOX干預(yù)的情況下，Bnip3進(jìn)一步下調(diào)，可能與DOX誘導(dǎo)線粒體膜通透性提高有關(guān)，DOX激活線粒體外膜Bax/Bak造孔機(jī)制，誘導(dǎo)線粒體功能障礙和線粒體源的I型及Ⅱ型細(xì)胞凋亡（原陽(yáng)等，2015；El-Said et al.， 2019； Li et al.， 2018）。綜上，本研究DOX干預(yù)誘導(dǎo)了大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，前凋亡BH-3類蛋白/Bcl-2比值水平上升，凋亡蛋白解離程度升高，Caspase3表達(dá)上升，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，EP通過Bcl-2抑制上述機(jī)制改善DOX心臟毒性（Qiu et al.， 2022）。

圖8 大鼠心肌組織GSH和Bcl-2的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果（×400）

Figure 8.Immunofluorescence Double Labeled Results of GSH and Bcl-2 in Rats Myocardial Tissues （×400）

EP與DOX刺激引發(fā)凋亡因子含量變化可能與心臟組織代謝物改變密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，EP改善GSH代謝可能是EP抑制DOX心肌毒性的核心代謝機(jī)制。GSH是人體內(nèi)最豐富的內(nèi)源性抗氧化劑，約90%儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)，其余10%位于線粒體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，GSH在細(xì)胞質(zhì)中由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸通過連續(xù)2步合成，細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄因子活性、凋亡等與GSH/GSSG氧化還原偶聯(lián)密切相關(guān)（楊鳳娟等，2021）（圖10）。DOX誘導(dǎo)的線粒體損傷促使ROS顯著增加，導(dǎo)致GSH/GSSG氧化還原失衡，GSH耗竭，DOX導(dǎo)致氧化應(yīng)激平衡被打破，誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，本研究組學(xué)結(jié)果顯示出EP改善DOX損傷的相關(guān)程序性細(xì)胞死亡機(jī)制。進(jìn)一步，線粒體GSH耗竭發(fā)生在細(xì)胞程序性死亡的早期階段，ROS積累則晚于GSH耗竭，因此認(rèn)為線粒體GSH耗竭可能是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的初始原因（Guha et al.， 2011）。此外，GSH氧化還原反應(yīng)發(fā)生改變還可使TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性增加、線粒體凋亡信號(hào)通路異常，本研究DOX導(dǎo)致的TNF-α表達(dá)升高可能是GSH代謝異常的重要原因。鳥氨酸參與GSH的合成代謝，本研究結(jié)果表明，DOX刺激導(dǎo)致GSH代謝合成異常，鳥氨酸循環(huán)水平升高，提示氨基酸參與直接供能消耗而不是用于合成氨基酸或蛋白。谷氨酰胺等的降低，造成GSH再生降低，最終導(dǎo)致清除ROS能力下降（Circu et al.， 2012），本研究中DOX引起的GSH代謝異常可能是激活細(xì)胞凋亡或氧化應(yīng)激的先決條件。

圖9 大鼠心肌組織OGC蛋白、Bax、Beclin1與Bcl-2共沉淀情況

Figure 9.Coimmunoprecipitation of OGC Proteins， Bax and Beclin1 with Bcl-2 in Rats Cardiac Tissue

有研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠抑制一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（cationic amino acid transporters，CAT-2B）的表達(dá)，促進(jìn)NO合成所需的L-Arginine消耗（Madeo et al.， 2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，EP＋DOX組的亞精胺水平較EP組豐度更高，表明EP可以通過增加亞精胺代謝途徑調(diào)節(jié)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。精氨酸能夠通過刺激GSH的生物合成，激活Nrf2途徑誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化反應(yīng)，對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷（Liang et al.， 2018），本研究發(fā)現(xiàn)，DOX使精氨酸的利用度下降，致使GSH生物合成下降，造成了心臟氧化應(yīng)激損傷加劇。在DOX刺激前進(jìn)行一次性EP，可以調(diào)節(jié)GSH相關(guān)代謝產(chǎn)物的代謝，促進(jìn)GSH生物合成，對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。前人研究表明，GSH在腫瘤微環(huán)境中扮演重要角色，GSH可減少腫瘤細(xì)胞中基因毒性劑的積累，線粒體GSH的特異性增加導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2的增加，二者共同作用，從而抵消藥物介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與凋亡反應(yīng)（Wang et al.， 2016），本研究也驗(yàn)證了EP通過調(diào)節(jié)GSH代謝，促進(jìn)與Bcl-2的相互作用，發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。綜上，EP一方面促進(jìn)DOX應(yīng)激情況下能量的穩(wěn)定合成，另一方面有助于ROS的清除效率進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激損傷。針對(duì)谷氨酰胺、GSH的外源補(bǔ)充形式可能是未來協(xié)同EP治療和預(yù)防DOX心臟損傷的聯(lián)合作用靶點(diǎn)形式，EP誘導(dǎo)適度GSH存在其干預(yù)形式的便利和價(jià)值。但仍需要注意的是，過度攝入GSH可能會(huì)導(dǎo)致ROS信號(hào)傳遞的穩(wěn)態(tài)失衡，從而對(duì)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)產(chǎn)生不利影響（Gusarov et al.， 2021）。本研究還發(fā)現(xiàn)EP可誘導(dǎo)NMN合成，可能是EP上調(diào)GSH表達(dá)的重要因素，其中可能涉及谷氨酸底物合成的上調(diào)以及NAD＋本身在GSH氧化還原反應(yīng)中扮演的角色，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究（Yuan et al.， 2022）。

在協(xié)同層面，Bcl-2通過調(diào)節(jié)線粒體GSH池，有助于線粒體發(fā)揮抗氧化功能，抑制GSH向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，可使線粒體GSH耗竭，從而導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激加劇，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞死亡（D’Alessio et al.， 2004）。為了探究Bcl-2與GSH相互作用的機(jī)制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)基因?qū)用婵赡芘cYAP激活有關(guān)，GSH消耗可能觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，YAP轉(zhuǎn)錄因子激活參與GSH1表達(dá)，反饋機(jī)制促進(jìn)GSH合成（Wheeler et al.， 2003）。已有研究表明，Bcl-2是YAP-TED1活性復(fù)合物的直接靶向基因，并發(fā)現(xiàn)YAP敲除可誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)水平的下降，YAP能夠直接增加Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄（Chen et al.， 2018）。YAP在S127位點(diǎn)磷酸化剪切YAP蛋白，抑制其表達(dá)。抑制該位點(diǎn)磷酸化對(duì)于YAP信號(hào)的核定位和轉(zhuǎn)錄過程具有積極效應(yīng)，這可能有利于促進(jìn)Bcl-2與GSH轉(zhuǎn)錄，而產(chǎn)生心臟保護(hù)效應(yīng)（Tao et al.， 2021； Wang et al.， 2020）。有研究認(rèn)為，DOX上調(diào)YAPS127磷酸化水平，進(jìn)而抑制YAP是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的重要原因（Tao et al.， 2021），EP有效抑制了上述DOX對(duì)YAP的調(diào)節(jié)，促進(jìn)YAP/Bcl-2軸上調(diào)，這可能是EP心臟保護(hù)的新機(jī)制。

本研究中熒光雙染和免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)一步表明，Bcl-2與GSH的直接協(xié)同關(guān)系可能是EP抑制DOX心臟損傷的重要原因，GSH通過線粒體膜內(nèi)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（DIC、OGC、TCC）進(jìn)入線粒體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，通過化學(xué)抑制OGC轉(zhuǎn)運(yùn)功能或使用siRNA敲除Bcl-2導(dǎo)致線粒體GSH水平下降，穩(wěn)定的OGC細(xì)胞系對(duì)氧化應(yīng)激敏感性恢復(fù)，在使用重組蛋白或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的幾個(gè)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和OGC可以以GSH依賴的方式相互作用（Wilkins et al.， 2014）。本研究結(jié)果顯示，EPS提高Bcl-2與OGC相互作用水平，表明Bcl-2與OGC在促進(jìn)線粒體GSH轉(zhuǎn)運(yùn)方面的協(xié)同機(jī)制抑制了DOX引起的線粒體損傷以及GSH代謝的異常。此外，EP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NADPH的增加，提供了GSH再生的酶促環(huán)境，隨著GSH水平的增加，GSH與Bcl-2結(jié)合，形成線粒體GSH孔道促進(jìn)GSH進(jìn)入線粒體，發(fā)揮抗氧化作用，抑制DOX誘導(dǎo)的線粒體源的細(xì)胞凋亡，該機(jī)制為EP誘導(dǎo)的GSH心臟保護(hù)作用提供了分子基礎(chǔ)（Kowaltowski et al.， 2005； Wilkins et al.， 2012）。

圖10 Bcl-2與GSH在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)抑制阿霉素心臟毒性的可能機(jī)制

Figure 10.Possible Mechanism of Bcl-2 and GSH in Exercise Precondition to Inhibit Doxorubicin Cardiotoxicity

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，EP可顯著降低DOX心臟毒性，增強(qiáng)心功能、抑制心肌炎癥和纖維化，其作用與EP刺激抑制心肌氧化應(yīng)激損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。EP通過促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2高表達(dá)、抑制BH-3類蛋白等凋亡或前凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)GSH合成，及其相關(guān)NAD＋合成和精氨酸消耗，促進(jìn)GSH與Bcl-2相互作用，實(shí)現(xiàn)心臟保護(hù)效應(yīng)。調(diào)控線粒體GSH轉(zhuǎn)運(yùn)可能是EP治療DOX誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)下降致細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。

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Exercise Preconditioning Promotes GSH/Bcl-2 Synthesis and Interaction to Inhibit Cardiac Injury by Doxorubicin

WANG Chuanzhi1，ZHANG Shuangshuang1，HAO Yuerong1，LUO Lijie2，YUAN Yang1*

Objective:To investigate the mechanisms of GSH interaction with Bcl-2 following one-time exercise precondition (EP) in reducing cardiotoxicity induced by DOX treatment of cancer.Methods:Forty 19-week-old female SD rats were randomly divided into control group (C), doxorubicin group (DOX), exercise preconditioning group (EP), and exercise preconditioning ＋ doxorubicin group (EP＋DOX), 10 rats in each group. The Dox group rats were injected with doxorubicin, EP group rats were conducted about of high-intensity intermittent exercise, and the EP＋DOX group rats were injected with doxorubicin 24 h after EP. Cardiac ultrasound was used to detect cardiac function in rats; chemical fluorescence immunoassay was used to detect the expression level of myocardial injury markers; histological staining and transmission electron microscopy were used to observe and analyze the histopathological changes of myocardium; Western blot was used to detect myocardial apoptosis and pro-survival gene-related protein expression; Metabolomics analysis was performed to explore the changes of myocardial metabolites and metabolic pathways; immunoprecipitation was used to detect the interaction between Bcl-2 and OGC (GSH transporter protein); immunofluorescence double-labeling was used to analyze the co-localization of GSH and Bcl-2.Results:In the DOX group, the myocardial mitochondria were swollen, the outer membrane was ruptured, the volume increased, and the mitochondrial cristae were disorganized or even broken; in the mitochondrial matrix, the linear dense cristae were visible, and the cloudy flocculent structures were appeared. Compared with group C, the cardiac function of rats in the DOX group was significantly decreased; the serum c Tn I, LDH, and MDA contents of myocardial injury indexes were significantly higher; the symptoms of myocardial cell injury, fibrosis, and inflammation were obvious; the expression levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 and cardiomyocytes were significantly lower, and the expression of apoptotic proteins such as Bad, Bax and Caspase3 were significantly higher; YAP phosphorylation level was significantly increased; GSH and NAD＋metabolism level were significantly lower; Bcl-2 and OGC interaction was significantly lower; Bcl-2 and GSH co-localization level was significantly lower. Compared with the DOX group, the EP＋DOX group showed improvements in all of the above indicators.Conclusions: The classical EP can attenuate DOX treatment-induced apoptosis and oxidative stress injury in cardiac myocytes by promoting GSH/Bcl-2 interaction, and it also can inhibit inflammation and fibrosis, and improve cardiac function.

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2022-07-29；

2022-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（32000830）；中國(guó)博士后科學(xué)基金第14批特別資助（2021T140356）。

王傳志（1998-），男，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管健康，E-mail：1327472591@qq.com。

原陽(yáng)（1989-），男，講師，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管健康，E-mail：yuanyangofficial@ yeah.net。

G804.7

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