LncRNA CYTOR對大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷及炎性因子的影響

殷德振 陳聰 王鵬 王元浩 李宏達(dá)

脊髓損傷是一種具有高致殘率與致死率的疾病類型之一,并可促使肢體癱瘓或勞動力喪失,已嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量,目前脊髓損傷尚無有效的治療方法[1]。脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及其突出結(jié)構(gòu)及功能喪失是脊髓損傷的病理學(xué)基礎(chǔ),缺氧或相關(guān)應(yīng)激條件下,脊髓神經(jīng)元細(xì)胞可產(chǎn)生大量氧自由基從而促使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)差異性表達(dá)與脊髓損傷密切相關(guān),并可能作為脊髓損傷診斷及治療的潛在靶點[3,4]。LncRNA CYTOR低表達(dá)于損傷的軟骨細(xì)胞中,上調(diào)其表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。但LncRNA CYTOR與脊髓損傷相關(guān)性研究尚未見報道。Starbase預(yù)測顯示LncRNA CYTOR與miR-136-5p存在互補(bǔ)序列。研究表明,miR-136-5p在脊髓損傷中表達(dá)上調(diào),并可促進(jìn)炎性因子表達(dá)[6]。但筆者發(fā)現(xiàn),LncRNA CYTOR/miR-136-5p分子軸在脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展過程中具體作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究通過構(gòu)建大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞損傷模型,探討LncRNA CYTOR對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷過程的影響及與miR-136-5p的關(guān)系。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞(上?，u科生物科技有限公司);H2O2(美國Sigma);Trizol試劑(美國Thermo Fisher);miRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司);Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen);pcDNA、pcDNA-LncRNA CYTOR、miR-NC、miR-136-5p mimics(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);MTT試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);IL-6、IL-21 ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega);兔抗鼠Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體(美國Santa Cruz)。9602A酶標(biāo)儀(北京普朗醫(yī)療器械公司);StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國ABI);FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter)。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理及分組:大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞放入含有濃度為100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[7],記為H2O2組。同時將正常培養(yǎng)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞記為con組。培養(yǎng)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞生長融合至70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染方法:以不含血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,另外以不含血清的培養(yǎng)基稀釋pcDNA、pcDNA-LncRNA CYTOR、pcDNA-LncRNA CYTOR和miR-NC、pcDNA-LncRNA CYTOR和miR-136-5p mimics,將二者充分混勻后于37℃條件下靜置20 min。加入大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,6 h后更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。實驗分組:轉(zhuǎn)染完成后將上述細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為H2O2+pcDNA組、H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR組、H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC組和H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p組。

1.2.2 LncRNA CYTOR、miR-136-5p表達(dá)水平檢測:取大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞加入Trizol試劑,通過miRNA提取試劑盒提取總RNA保存于-80℃冰箱內(nèi)。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后置于-20℃冰箱內(nèi)保存。cDNA稀釋后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),通過制備qRT-PCR反應(yīng)體系后設(shè)置反應(yīng)程序(預(yù)變性95℃ 2 min,變性95℃ 30 s,退火60℃ 30 s,延伸72℃ 30 s,共40個循環(huán))。GAPDH作為LncRNA CYTOR的內(nèi)參照物,U6作為miR-136-5p的內(nèi)參照物,用2-ΔΔCt法統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測:取4組大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,加入0.25%胰蛋白酶消化后接種至96孔板(1×103個/孔),然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并加入20 μl的MTT溶液,孵育4 h后棄上清,每孔加入150 μl DMSO,室溫下振蕩反應(yīng)5 min,置于多功能酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光度值(A),并計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測:首先用0.25%胰蛋白酶消化并收集4組大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,后將細(xì)胞放入離心機(jī)內(nèi)離心,棄上清液,重懸于500 μl的結(jié)合緩沖液中,分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl,室溫條件下避光振蕩孵育5 min,然后用流式細(xì)胞儀檢測并計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 IL-6、IL-21的水平檢測:分別取4組大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測IL-6、IL-21的水平。

1.2.6 LncRNA CYTOR與miR-136-5p的靶向關(guān)系檢測:LncRNA CYTOR與miR-136-5p的結(jié)合位點及其突變位點分別克隆至pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建野生型載體wt-LncRNA CYTOR、突變型載體mut-LncRNA CYTOR,參照“1.2.1”轉(zhuǎn)染方法將含有結(jié)合位點的wt-LncRNA CYTOR及其突變位點的mut-LncRNA CYTOR分別與miR-NC、miR-136-5p mimics共轉(zhuǎn)染大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,分別檢測各細(xì)胞的熒光素酶活性。參照“1.2.1”轉(zhuǎn)染方法將pcDNA、pcDNA-LncRNA CYTOR分別轉(zhuǎn)染至大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并采用qRT-PCR法檢測miR-136-5p相對表達(dá)量。

1.2.7 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量檢測:分別收集4組大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后將蛋白沸水浴變性。按40 μg/孔蛋白加入凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜后并進(jìn)行室溫封閉2 h,分別加入Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)抗體稀釋液4℃孵育過夜,次日加入IgG(1∶5 000)二抗稀釋液,室溫下孵育2 h后用TBST充分洗滌,通過Quantity One軟件分析Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中LncRNA CYTOR和miR-136-5p的表達(dá) 與con組比較,H2O2組LncRNA CYTOR的表達(dá)量降低(P<0.05),miR-136-5p的表達(dá)量升高(P<0.05)。見表1。

表1 LncRNA CYTOR和miR-136-5p表達(dá)的檢測 n=9,

2.2 LncRNA CYTOR和miR-136-5p轉(zhuǎn)染效率的檢測 與pcDNA組比較,pcDNA-LncRNA CYTOR組LncRNA CYTOR的表達(dá)量升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-136-5p組miR-136-5p的表達(dá)量升高(P<0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染效率檢測 n=9,

2.3 LncRNA CYTOR對大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的影響 與con組比較,H2O2組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和、Bax蛋白表達(dá)及IL-6、IL-21水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與H2O2+pcDNA組比較,H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)及IL-6、IL-21水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 LncRNA CYTOR對大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 LncRNA CYTOR對大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞抑制率、凋亡率、炎性因子的檢測 n=9,

2.4 LncRNA CYTOR靶向、調(diào)控miR-136-5p LncRNA CYTOR和miR-136-5p的互補(bǔ)序列。與miR-NC相比,miR-136-5p過表達(dá)可抑制wt-LncRNA CYTOR的熒光素酶活性(P<0.05),而未能影響mut-LncRNA CYTOR的熒光素酶活性。與pcDNA組比較,pcDNA-LncRNA CYTOR組miR-136-5p的表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖2,表4、5。

圖2 LncRNA CYTOR和miR-136-5p的互補(bǔ)序列

表4 雙熒光素酶報告實驗 n=9,

表5 LncRNA CYTOR調(diào)控miR-136-5p的表達(dá) n=9,

2.5 miR-136-5p對LncRNA CYTOR處理的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的影響 與H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC組比較,H2O2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)及IL-6、IL-21水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 miR-136-5p對LncRNA CYTOR處理的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 miR-136-5p對LncRNA CYTOR處理的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞抑制率、凋亡率、炎性因子的檢測 n=9,

3 討論

脊髓損傷是指多種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)缺損及其功能喪失導(dǎo)致運動、感覺等異常,尋找新的脊髓損傷干預(yù)靶點成為研究重點,LncRNA可參與基因轉(zhuǎn)錄激活等調(diào)控過程,LncRNA可通過充當(dāng)miRNA的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)而參與脊髓損傷過程[8-10]。

LncRNA CYTOR表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)病理性心臟肥大[11]。LncRNA CYTOR過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)miR-24/XIAP分子軸而減輕膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷[12]。但筆者發(fā)現(xiàn)LncRNA CYTOR在大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷中的影響及機(jī)制尚不可知。本研究結(jié)果顯示,H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中LncRNA CYTOR的表達(dá)量降低,提示LncRNA CYTOR可能參與脊髓損傷的發(fā)生過程。研究表明Bcl-2基因家族是在caspase家族蛋白上游,并可通過抑制caspase-3蛋白合成而抑制細(xì)胞凋亡,而Bax對細(xì)胞凋亡的作用與之相反[13]。本研究結(jié)果顯示,H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低,而LncRNA CYTOR過表達(dá)可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡,提示LncRNA CYTOR過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡從而減輕H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷。另有研究表明,IL-6、IL-21屬于促炎性細(xì)胞因子,其水平的升高提示細(xì)胞炎性反應(yīng)程度加重[14]。本研究結(jié)果顯示,在H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中,IL-6、IL-21水平升高,而LncRNA CYTOR過表達(dá)可降低IL-6、IL-21水平,提示LncRNA CYTOR過表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞炎性反應(yīng)。

本研究證實LncRNA CYTOR與miR-136-5p存在靶向調(diào)控作用,LncRNA CYTOR可充當(dāng)miR-136-5p的ceRNA。研究表明,miR-136-5p可通過引起炎性反應(yīng)從而促進(jìn)脊髓損傷[15]。miR-136-5p在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)水平升高,并可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示,H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)量升高,miR-136-5p過表達(dá)可減弱LncRNA CYTOR過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞增殖、凋亡及炎性反應(yīng)的作用。提示LncRNA CYTOR可通過靶向結(jié)合miR-136-5p而參與脊髓損傷過程。

綜上所述,H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中LncRNA CYTOR表達(dá)下調(diào),miR-136-5p表達(dá)上調(diào),LncRNA CYTOR過表達(dá)可通過抑制miR-136-5p表達(dá)而促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠背脊髓神經(jīng)元細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng),LncRNA CYTOR可能作為脊髓損傷的潛在治療靶點。但仍需體內(nèi)實驗驗證LncRNA CYTOR/miR-136-5p分子軸在脊髓損傷中的作用機(jī)制。