骨形態(tài)發(fā)生蛋白9在成骨分化中的作用與信號通路研究進展

沈思遠，梁鋒，張云鵬，肖守允，丁惠民

南京醫(yī)科大學附屬明基醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210019

長久以來，各種因素造成的骨缺損是臨床常見問題之一。較為復雜的骨缺損會增加不愈合或延遲愈合的風險，從而影響患者活動，降低生活質(zhì)量，增加患者負擔。因此如何促進骨形成具有重要臨床意義和社會效益。

隨著細胞信號通路研究的不斷深入，利用生物活性分子和生物相容性材料的骨再生及骨組織工程逐步向前發(fā)展。生長因子在骨再生中發(fā)揮重要作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）來自轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族，在間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）成骨分化中起關(guān)鍵作用。BMP 最早被發(fā)現(xiàn)可以誘導肌肉組織中的骨形成［1］。

BMP-9是BMP家族的一員，其與目前研究較多的BMP-2、BMP-4、BMP-7 相似，具有介導MSC 成骨分化的能力。近幾年研究表明，相比其他BMP 蛋白，BMP-9 具有更強的成骨分化潛能。既往研究表明，BMP-9 主要通過SMAD 依賴信號通路來介導干細胞成骨分化，但同時與其他信號通路之間也存在調(diào)控關(guān)系。由BMP 觸發(fā)的SMAD 細胞信號通路通常被Noggin（諾金）抑制。然而，BMP-9 所介導的SMAD 通路不受Noggin 抑制［2］，因此BMP-9 可以更好地促進骨祖細胞向前成骨細胞和成骨細胞分化。本文主要對BMP-9 配體、信號通路及成骨、成軟骨分化能力進行綜述。

1 BMP-9介導成骨分化的配體及信號通路

BMP-9 在調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化的過程中，與BMPⅠ型受體（type Ⅰbone morphogenetic protein receptor，BMPRⅠ）和BMPⅡ型受體（typeⅡbone morphogenetic protein receptor，BMPRⅡ）相結(jié)合，進而激活下游的信號通路，引發(fā)級聯(lián)反應。BMP-9可以與BMPRI 中的間變性淋巴瘤激酶1（anaplastic lymphoma kinase 1，ALK1）和間變性淋巴瘤激酶2（anaplastic lymphoma kinase 2，ALK2）相結(jié)合，其中與ALK1有較高的親和性，與ALK2親和性較弱［3-4］。對于BMPRⅡ，BMP-9 可以與它的多個亞型結(jié)合［4-6］。這些受體多數(shù)為跨膜蛋白受體，包含細胞膜外面富含半胱氨酸的胞外結(jié)合區(qū)域、跨膜區(qū)域蛋白和胞漿內(nèi)富含絲氨酸與蘇氨酸的胞內(nèi)區(qū)域［5-7］。

BMP-9 的信號轉(zhuǎn)導過程通常是由BMP-9 形成的同源二聚體特異性地結(jié)合到BMPRⅠ、BMPRⅡ異源二聚體復合物上，進而形成異源四聚體聚合物，從而引起富含甘氨酸-絲氨酸基序列的BMPRⅡ胞內(nèi)區(qū)域的磷酸化，從而激活BMPRⅠ及其下游信號通路［7］。相關(guān)研究表明，BMP-9 可以通過作用于多條信號通路從而調(diào)控不同組織來源的MSC 的成骨分化過程（圖1）。

圖1 BMP-9信號通路Figure 1 BMP-9 signaling pathway

1.1 BMP-9-SMAD信號通路

BMP-9-SMAD 途徑，是BMP-9 調(diào)控干細胞成骨分化的經(jīng)典信號通路。細胞內(nèi)SMAD的激活是該信號通路級聯(lián)反應的關(guān)鍵靶點。其主要機制為BMP-9與BMP受體結(jié)合形成異源四聚體復合物，并招募細胞內(nèi)信號激酶SMAD-1/5/8，隨后啟動磷酸化過程。磷酸化的SMAD-1/5/8 復合物結(jié)合SMAD-4，形成SMAD-1/5/8-SMAD-4復合物，其隨后易位到細胞核，從而調(diào)控下游成骨相關(guān)基因組的表達［8］。

除SMAD-1/5/8-SMAD-4復合物外，SMAD-6/7同樣參與了BMP-9-SMAD 信號通路。SMAD-6/7 又被稱作抑制性SMAD（inhibitory SMAD，I-SMAD），在BMP-9-SMAD信號通路中，過表達的SMAD-6/7可以抑制BMP-9 對干細胞成骨分化的影響。當BMP-9刺激時，過表達的SMAD-6/7從細胞核進入細胞質(zhì)。SMAD-6/7競爭性結(jié)合Ⅰ型受體，抑制SMAD-1/5/8的磷酸化過程，同時抑制SMAD-1/5/8 和SMAD-4 復合物的形成和活性。SMAD-6/7 還可以調(diào)控泛素連接酶Smurf 1 的表達水平，使其與Ⅰ型受體結(jié)合，促進SMAD-1/5/8泛素化，從而抑制BMP-9-SMAD信號的轉(zhuǎn)導［9］。

1.2 BMP-9-絲裂原活化蛋白激酶（BMP-9-mitogenactivated protein kinase，BMP-9-MAPK）信號通路

BMP-9-MAPK信號通路是BMP-9信號通路的重要組成部分之一，MAPK 成員包括細胞外信號相關(guān)激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）和ERK5、c-Jun 氨基（N）末端激酶1/2（JNK1）以及p38 亞型（p38α、p38β、p38γ和p38δ）。當BMP-9 與BMPR 相結(jié)合后，BMPRⅡ受體會激活轉(zhuǎn)化生長因子β 激活激酶-1（transforming growth factor-β-activated kinase-1，TAK-1）/轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1 結(jié)合蛋白（transforming growth factor-activated kinase binding protein，TAB-1）復合物，從而激活絲裂原活化蛋白激酶激酶-3/6（mitogen-activated proteinkinase kinase-3/6，MKK-3/6），進而激活下游的p38或ERK-1/2 并使其磷酸化，最終啟動下游信號轉(zhuǎn)導［10］。p38選擇性抑制劑可以明顯抑制BMP-9 介導的C3H10T1/2 細胞成骨分化過程。BMP-9 介導的C3H10T1/2 細胞成骨分化過程中，磷酸化的p38 表達上調(diào)。使用SB203580（p38抑制劑）后，C3H10T1/2細胞的成骨分化能力下調(diào)，提示p38 在BMP-9 介導的成骨分化過程中可能發(fā)揮重要作用［11］。

1.3 BMP-9-Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin 信號通路具有調(diào)節(jié)骨組織代謝、介導成骨分化及促進軟骨發(fā)育的作用［12］。Wnt配體首先與Frizzled 和LRP-5/6受體相結(jié)合，隨后磷酸化Dvl 蛋白，進而募集糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、Axin、APC、CK1，從而形成GSK3β/Dvl/Axin/APC/CK1復合物，未被抑制的β-catenin 進入細胞核內(nèi)結(jié)合到TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子上，啟動下游成骨分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［7，12］。BMP-9可以介導β-catenin 表達和調(diào)控其磷酸化過程，進而增強磷酸化的GSK3β水平，從而促進高磷酸鹽狀態(tài)下血管平滑肌細胞中成骨標志物Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）的表達，增加礦化作用［13］。有研究表明，BMP-9可以通過Wnt/β-catenin 信號通路來介導牙胚來源的間充質(zhì)干細胞（tooth germ mesenchymal cell，TGMC）成骨分化，當敲低β-catenin時，BMP-9 組的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和OCN表達水平下降［14］。

1.4 BMP-9與Notch信號通路

Notch 信號被認為是骨形成的重要調(diào)節(jié)分子，涉及胚胎發(fā)育、細胞增殖分化和細胞穩(wěn)態(tài)等多個生物學過程。Notch 信號通路主要由5 種配體（JAG1、JAG2、DLL1、DLL3 和DLL5）和4 種受體（Notch1～4）構(gòu)成［15］。在骨相關(guān)病癥中，Notch 受體或配體通常發(fā)生表達異常；以往研究也表明，在成骨、成軟骨和破骨分化過程中Notch 信號廣泛表達［15］。Notch 信號由Notch受體結(jié)合的配體激活，隨后Notch被金屬蛋白酶腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶（TNF-α converting enzyme，TACE）裂解，然后被早老素1（presenilin 1）和早老素2（presenilin 2）的γ-分泌酶復合物進一步裂解，成為Notch 細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain，NICD）。NICD 易位進入細胞核并與DNA 結(jié)合蛋白CSL（CBF1/Suppressor of hairless/LAG-1）相互作用并調(diào)節(jié)下游基因，從而介導細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導過程［16］。

2 BMP-9的成骨分化能力

BMP-9具有促進成骨細胞分化及誘導體內(nèi)外成骨的作用。Fujioka-Kobayashi等［17］使用抗鼠核因子-κB 配體受體激活劑（monoclonal anti-murine receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）在小鼠體內(nèi)建立抗體介導的抗再吸收（antibody-mediated antiresorptive therapy，AMART）模型。在第3天和第14天時，與對照組比較，rhBMP-9 治療組的成骨標志物RUNX2、ALP、OSX（osterix）和OCN 的mRNA 表達水平顯著升高。隨后，將rhBMP-9 與膠原蛋白膜填充至小鼠顱骨缺損處，輔以mAb 治療。28 d時，顯微CT 和組織學分析顯示，相比對照組，rhBMP-9+mAb組新骨形成更多。Lu等［18］發(fā)現(xiàn)BMP-9 可以誘導小鼠胚胎骨髓間充質(zhì)干細胞（C3H10T1/2細胞）成骨分化，且與沉默交配型信息調(diào)節(jié)器2 同源物-1（silent mating type information regulator 2 homolog-1，SIRT1）的激活劑SRT2104 聯(lián)合應用，BMP-9 的成骨能力明顯增強。之后用BMP-9與GFP分別處理C3H10T1/2細胞，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BMP-9 組的成骨標志物OCN、α1-Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰalpha 1，COL1A1）及RUNX2 表達水平更高。此外，Lu等［18］用BMP-9+SRT2104處理C3H10T1/2細胞，在處理5、7 d 時發(fā)現(xiàn)與單純使用BMP-9 相比，BMP-9+SRT2104 組的OCN、COL1A1 及RUNX2 表達水平明顯增強，同時PCR檢測結(jié)果也證實了這一結(jié)論。

BMP-9 可以促進間充質(zhì)干細胞成骨分化，因此在骨組織工程、顱骨修復、骨缺損愈合中發(fā)揮重要作用。Freitas等［19］利用簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列相關(guān)核酸酶Cas-9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nulease Cas-9，CRISPR-Cas9）技術(shù)對MSC進行基因編輯，使其過表達BMP-9，同時構(gòu)建了大鼠顱骨缺損模型，結(jié)果顯示，BMP-9 組的RUNX2、OSX、ALP 等成骨標志物基因表達水平較對照組更高，同時注射后第21天時觀察到更強的細胞外基質(zhì)礦化作用。顯微CT 結(jié)果顯示，與對照組相比，BMP-9處理組的顱骨缺損處新骨形成更多。Wang等［20］發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)，相比對照組，負載BMP-9 和P-15 肽水凝膠的聚乳酸-乙醇酸（polylactic acid glycolic acid，PLGA）支架處理的MSC表達更高水平的ALP、RUNX2、OCN。這提示BMP-9 能更好地促進MSC的成骨分化。同時，該研究還觀察到在兔骨缺損模型中，BMP-9+P-15 肽水凝膠+PLGA 組的新骨形成更多。Shi等［21］研究報道，聯(lián)合應用生物活性玻璃（Bioglass）+BMP-9能夠更好地促進成骨分化。觀察到在體內(nèi)，相比單獨使用Bioglass，BMP-9+Bioglass 組ALP活性更高，且在BMP-9存在的情況下，RUNX2、OSX 表達水平也顯著上調(diào)。同時，在大鼠牙齒缺損模型中，也可以觀測到BMP-9+Bioglass組新骨形成更多。

3 BMP-9的成軟骨作用

BMP-9 具有介導軟骨祖細胞（chondroprogenitor，CPC）、MSC 等成軟骨分化的潛能。Kawin等［22］研究了BMP-9 在CPC 成軟骨分化中的作用。該研究分別用1-34 甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和BMP-9處理CPC，結(jié)果表明BMP-9組的成軟骨標志物SRY 相關(guān)的高遷移率族框-9（SRY-type high-mobility-group box-9，SOX-9）、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、α1-Ⅱ型膠原（collagen type Ⅰalpha 1，COL2A1）的mRNA表達水平，相比1-34PTH組升高，其中以COL2A1最為明顯。隨后，通過阿爾新藍、藏紅O 染色和甲苯胺藍染色測定糖胺聚糖沉積，研究顯示BMP-9 組對糖胺聚糖表現(xiàn)出更大的攝取量。同樣，免疫組化分析也表明BMP-9 組的COL2A1 沉積也更顯著。Morgan等［23］從未成熟牛軟骨中篩選出關(guān)節(jié)軟骨源性祖細胞，分別用TGF 和BMP-9 誘導，發(fā)現(xiàn)BMP-9 處理的祖細胞的ACAN 和COL2A1基因表達分別比對照組高11倍和5倍，培養(yǎng)14 d后的基因表達定量分析也證實了這一點。由此可見，BMP-9 可以促進成軟骨分化，但其誘導軟骨形成的機制目前尚不明確。

4 BMP-9的特性

與其他BMP家族成員相比，BMP-9的成骨分化能力最強。Bipin等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠顱骨缺損模型中，使用甲基纖維素（MC）和海藻酸鈣（Alg）的可注射給藥系統(tǒng)聯(lián)合搭載不同劑量（0.5、1.5 μg）的rhBMP-2 或rhBMP-9 的凝膠系統(tǒng)，相同劑量下，rhBMP-9組相比rhBMP-2組表現(xiàn)出更好的骨缺損修復效果，同時還觀察到0.5 μg rhBMP-9 組骨缺損修復效果弱于1.5 μg rhBMP-9 組。Fujioka-Kobayashi等［25］構(gòu)建新西蘭兔顱骨缺損模型，在該模型中通過脫蛋白牛骨骨粉搭載不同質(zhì)量（5、20 μg）的rhBMP-2或rhBMP-9，結(jié)果表明，5 μg rhBMP-9組表現(xiàn)出最佳的修復骨結(jié)構(gòu)。相較于5 μg rhBMP-9組，20 μg rhBMP-2組與20 μg rhBMP-9 組的骨修復效果較差，而5 μg rhBMP-2組則不能完全修復骨缺損。

此外，不同于其他BMP（如BMP-2、BMP-4、BMP-7），BMP-9不能被經(jīng)典的BMP受體拮抗劑Noggin所抑制。據(jù)報道，Noggin抑制BMP信號通路的機制是通過與BMPRⅠ和BMPRⅡ中的配體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻礙BMP 與其受體上的結(jié)合位點相結(jié)合。既往相關(guān)研究表明，Noggin 對BMP-9 誘導的干細胞成骨分化過程無明顯影響［26］。研究發(fā)現(xiàn)，在Noggin存在的情況中，用BMP-2和BMP-9刺激肌肉前體細胞系C2C12細胞，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)與BMP-2 處理組相比，BMP-9 處理組能夠在細胞核中觀察到更高水平的Smad-1/5/8［2］。與此同時，測定Smad-6/7 的表達水平，發(fā)現(xiàn)Noggin 存在時，與其他BMP 相比，BMP-9 更能誘導Smad-6/7 的表達，這一結(jié)果表明BMP-9 不受Noggin 抑制，且相比其他BMP，能夠更好地促進BMP-SMAD信號通路。此外，還發(fā)現(xiàn)BMP-9刺激的C2C12 細胞或小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）出現(xiàn)較多的異位骨形成，而BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7刺激的細胞異位骨形成較少或可忽略，這也證實了Noggin 對除BMP-9以外的其他BMP家族蛋白有明顯抑制作用。蘇木精和伊紅染色結(jié)果表明，BMP-9能夠在無或存在Noggin的情況下誘導C2C12和MEF的骨形成［2］。

5 結(jié)論與展望

近年的研究表明BMP-9 在骨再生及骨組織工程中起重要作用?，F(xiàn)有的研究表明，BMP-9 可以通過多條信號通路（如BMP-9-SMAD、BMP-9-MAPK、BMP-9-TGFβ、BMP-9-Wnt/β-catenin 與BMP-9-Notch信號通路）發(fā)揮調(diào)控作用［8-16］。但BMP-9 調(diào)控干細胞成骨分化的具體機制目前尚不明確，有待進一步探究。調(diào)節(jié)BMP-9的SMAD信號通路不受Noggin影響［2，26］，這是BMP-9 相比其他BMP 家族蛋白的優(yōu)勢之一。多項體內(nèi)外研究都是借助過表達BMP-9 基因的載體來探索BMP-9 在骨形成和骨再生過程中的作用，例如質(zhì)粒、腺病毒，或是搭載rhBMP-9 蛋白或腺病毒的支架材料，如瓊脂糖、磷酸鈣、石墨烯、膠原膜、凝膠等［7］。一些研究也可以明顯看出rhBMP-9 可以有效修復大鼠的顱骨缺損。且與目前了解較多的BMP（如BMP-2）相比，BMP-9 在低劑量時便能很好地介導足夠的新骨形成［24-25］。低劑量BMP-9 的應用效果表明，在局部缺損區(qū)域優(yōu)化BMP 的釋放動力學是控制BMP-9 介導骨再生的關(guān)鍵因素之一；當BMP 介導的成骨分化效率可能因BMP 攝取量較低和/或BMP 從載體中快速釋放而降低時，通常需要更高劑量的BMP 摻入。未來的研究可能會涉及各種生物聚合物復合材料，如納米材料等，從而能夠更好地吸附BMP-9 以及延長其釋放時間。