五味子總木脂素超聲波微波協(xié)同輔助提取工藝及其主要成分含量

張金朋 趙 碩 郭曉帆 陳玉鳳 齊永秀 劉媛媛

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，山東 泰安 271016

2020年版《中國藥典》記載，五味子的入藥部位為果實(shí)，其主要分布在我國東北部，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效［1］。五味子果實(shí)含豐富的營養(yǎng)成分［2］，其應(yīng)用范圍從中藥制劑行業(yè)延伸到了食品工業(yè)領(lǐng)域［3］，成為當(dāng)代新型“藥食同源”產(chǎn)品。市場上流通的五位子保健品主要有五味子膠囊（軟膠囊）、五味子口服液、五味子含片（咀嚼片、泡騰片）、五味子果酒和茶等［4］，其原材料五味子可增強(qiáng)血和腦的抗氧化酶活性，減弱丙二醛的氧化作用，具有延緩衰老［5］和改善學(xué)習(xí)記憶的能力［6］，可促進(jìn)膽汁酸的代謝，預(yù)防膽汁淤積導(dǎo)致的肝損傷，保肝護(hù)膽［7］，以及增強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸與5-羥色胺對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，促進(jìn)睡眠，改善睡眠質(zhì)量［8］。除此之外，五味子對(duì)于多種癌癥如胃癌［9］、直腸癌［10］、肝癌［11］等均有一定抑制作用，這主要取決于五位子中的主要活性成分木脂素［12］。然而，五位子產(chǎn)品中有效成分含量低是當(dāng)下市場存在的問題之一［13］，探索五味子活性成分的提取技術(shù)至關(guān)重要。超聲波協(xié)同微波提取的方式結(jié)合了超聲波的空化作用［14］、微波作用于細(xì)胞使細(xì)胞破裂和作用于極性分子后的升溫作用［15-16］，且微波的加熱作用可以彌補(bǔ)超聲波產(chǎn)熱不足的缺陷［17］，可縮短提取時(shí)間，降低工業(yè)成本，提高提取效率。本研究通過超聲波-微波協(xié)同提取法，以浸泡過的五味子濾渣為原料，通過單因素和正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化五味子總木脂素的提取工藝，并利用超高效液相色譜（ultrahigh performance liquid chromatography，UPLC）法對(duì)最優(yōu)條件粗提物中7 個(gè)木脂素成分的含量進(jìn)行測定，以期為五味子在食品藥品行業(yè)的研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

五味子（批號(hào)03820021）購于河北仁心藥業(yè)有限公司；五味子甲素（批號(hào)D1911039，純度 > 98%）、乙素（批號(hào)E1822053，純度 > 98%）、丙素（批號(hào)D1608128，純度 > 98%）、醇甲（批號(hào)D1827017，純度 > 98%）、醇乙（批號(hào)F1508140，純度 > 98%）、酯甲（批號(hào)A1403056，純度 > 98%）、酯乙（批號(hào)C1132591，純度 > 98%）均購于阿拉丁生化科技股份有限公司。

Nexera X2 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；超純水系統(tǒng)（美國Merck 公司）；ES-E120AⅡ型十萬分之一分析天平（天津德安特傳感技術(shù)有限公司）；濃縮設(shè)備（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；xinyi-1A 型微波萃取儀、JY92-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取五味子酯甲2.67 mg，用甲醇配制濃度為0.534 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取10、20、40、60、80、100 μL 于試管中，揮干溶劑，依次添加0.5 mL 1%變色酸，3 mL濃H2SO4和1.5 mL蒸餾水，搖勻，沸水浴30 min。冷卻到室溫，570 nm 處測定吸光度3次，取平均值。分別以質(zhì)量、吸光度為橫縱坐標(biāo)，擬合五味子酯甲的線性回歸方程。

1.2.2 五味子濾渣的提取工藝

精密稱取60 ℃烘干至恒重的五味子適量，粉碎，加15倍體積的蒸餾水，常溫浸泡過夜，分裝后置8 000 r/min 離心10 min，濾渣置于60 ℃烘箱干燥至恒重，稱重，計(jì)算濾渣得率（濾渣得率 = 濾渣質(zhì)量/五味子中藥材的質(zhì)量× 100%），備用。

1.2.3 五味子總木脂素提取工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)五味子總木脂素得率的影響精密稱取4.0 g五味子濾渣5份，分別加入5、10、20、40、60 倍體積的80%乙醇，在超聲功率和微波功率均為300 W，60 ℃下提取40 min。提取液置3 000 r/min離心15 min，取上清液測定五味子總木脂素的質(zhì)量，并計(jì)算其得率（五味子總木脂素得率 = 五味子總木脂素質(zhì)量/五味子中藥材的質(zhì)量× 100%）。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)五味子總木脂素得率的影響 精密稱取4.0 g 五味子濾渣5 份，加20 倍體積80%乙醇，在超聲功率和微波功率均為300 W，60 ℃的條件下分別提取5、10、20、40、60 min，試驗(yàn)結(jié)束后，分別同法測定樣品中五味子總木脂素的質(zhì)量，并計(jì)算其得率。

1.2.3.3 微波功率對(duì)五味子總木脂素得率的影響 精密稱取4.0 g 五味子濾渣5 份，加20 倍體積80%乙醇，設(shè)置超聲功率300 W 和溫度60 ℃，分別在微波功率為50、100、200、400、600 W提取40 min。試驗(yàn)結(jié)束后，分別同法測定樣品中五味子總木脂素質(zhì)量，并計(jì)算其得率。

1.2.3.4 超聲波功率對(duì)五味子總木脂素得率的影響 精密稱取4.0 g 五味子濾渣5 份，加20 倍體積80%乙醇，設(shè)置微波功率300 W 和溫度60 ℃，分別在超聲波功率為50、100、200、400、600 W 條件下提取40 min。試驗(yàn)結(jié)束后，分別同法測定樣品中五味子總木脂素質(zhì)量，并計(jì)算其得率。

1.2.4 五味子總木脂素提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，如表1所示，按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 最優(yōu)提取條件下五味子總木脂素的含量測定

按照最優(yōu)提取條件提取五味子濾渣，將提取液凍干后，得五味子總木脂素粗提物的凍干粉，精密稱定凍干粉的重量并以變色酸-濃硫酸反應(yīng)測其總木脂素質(zhì)量。分別記錄稱取的五味子濾渣質(zhì)量為M1，五味子木脂素粗提物粉末的質(zhì)量為M2及五味子木脂素粗提物粉末中總木脂素的質(zhì)量為M3。五味子木脂素粗提物的得率= M2/ M1× 100%；五味子木脂素粗提物中總木脂素成分的含量= M3/ M2× 100%。

1.2.6 基于UPLC 最佳提取工藝所得五味子總木脂素粗提物中7個(gè)成分的含量測定

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate? UHPLC XB-C18（1.8 μm，2.1×100 mm）；柱溫：40 ℃；檢測波長：267 nm；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：1 μL；梯度洗脫程序見表2。

表2 五味子總木脂素粗提物梯度洗脫程序

1.2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取7 個(gè)五味子木脂素對(duì)照品各1 mg，分別配置成濃度為500 μg/mL 的儲(chǔ)備液。經(jīng)稀釋后配制這7 個(gè)木脂素成分的一系列濃度混合對(duì)照溶液，最終使五味子醇甲濃度為：2.5、10、20、40、60、80、100 μg/mL；其余6個(gè)物質(zhì)濃度均為：0.25、1、2、4、6、8、10 μg/mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.3 供試品溶液的制備 精密稱取最優(yōu)提取條件下所得的凍干粉6.00 mg，以甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0 對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析，采用LSD 和SNK 方法進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線

在五味子酯甲質(zhì)量為0 ～ 0.053 4 mg 的范圍內(nèi)，其與吸光度具有良好線性關(guān)系，回歸方程為：y = 4.032 5 x + 0.300 9，R2= 0.995 5。

2.2 五味子濾渣得率

精密稱取五味子粉末（過40目篩）500.00 g，加15 倍體積的蒸餾水浸泡過夜，除水溶性雜質(zhì)后，8 000 r/min 離心15 min 得殘?jiān)恋?，烘干后稱其質(zhì)量為225.10 g，計(jì)算濾渣得率為45.02%。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對(duì)五味子總木脂素得率的影響 在其他條件保持不變時(shí)，料液比影響木脂素得率的結(jié)果見表3。料液比增大，得率升高，在20 mL/g 時(shí)到達(dá)峰值，隨后得率因料液比的增大而降低。因此，本研究最終采用料液比為1∶20 的溶劑來提取五味子總木脂素。

表3 五味子總木脂素得率單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 超聲波功率對(duì)五味子總木脂素得率的影響 在其他條件保持不變時(shí)，超聲波功率影響木脂素得率的結(jié)果見表3。隨超聲功率的增大，得率升高，200 W時(shí)達(dá)到最大，隨后與超聲波功率呈負(fù)相關(guān)。因此，選擇150、200、300 W 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 微波功率對(duì)五味子總木脂素得率的影響在其他條件保持不變的情況下，微波功率影響木脂素得率的結(jié)果見表3。五味子總木脂素得率隨微波功率升高而增大，在微波功率到達(dá)200 W后開始下降。因此，本研究使用微波功率為150、200、300 W 3個(gè)階段設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)五味子總木脂素得率的影響當(dāng)其他條件一定時(shí)，提取時(shí)間影響木脂素得率的結(jié)果見表3。0～20 min，得率隨時(shí)間延長而升高，到達(dá)20 min以后，得率達(dá)到平衡，且有下降的趨勢。提取時(shí)間為20 min 和40 min 時(shí)，得率相差甚小，因此，選擇了20、30、40 min設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

鑒于對(duì)木脂素及儀器的保護(hù)，提取溫度設(shè)定為60 ℃。最終規(guī)定料液比為1∶20，提取溫度為60 ℃，以提取時(shí)間、微波功率和超聲功率作為影響因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。

2.4.1 五味子總木脂素提取正交試驗(yàn)結(jié)果 以總木脂素得率為指標(biāo)，在150、200、300 W 3 種超聲功率下提取的五味子總木脂素，以200 W提取到的得率最高。提取時(shí)間從20 min 到40 min，木脂素得率在30 min 時(shí)最佳。微波功率在該正交試驗(yàn)中未能發(fā)現(xiàn)其功率大小與得率之間存在的關(guān)系，但微波功率為200 W時(shí)五味子總木脂素的得率均值較高，見表4。綜合以上因素考慮，最優(yōu)提取條件參數(shù)為A2B2C2，即超聲和微波功率均為200 W、提取時(shí)間30 min。由極差可知，得率受3個(gè)因素影響的程度大小分別為：超聲功率（A）>提取時(shí)間（B）>微波功率（C）。

表4 五味子總木脂素的得率L9（34）正交表及實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

2.4.2 五味子總木脂素提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析 在本試驗(yàn)考察的影響五味子總木脂素得率的3個(gè)因素中，對(duì)得率影響較為顯著的有超聲波功率與提取時(shí)間（P< 0.05），微波功率的影響不明顯（P>0.05），見表5。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果確定A2為最佳超聲功率，B2為最佳提取時(shí)間。在一定溫度范圍內(nèi)，微波功率大小會(huì)直接影響溫度升高的快慢，不會(huì)影響溫度的高低，大功率的微波會(huì)影響儀器使用壽命，且微波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響，150 W和200 W微波功率的得率均值接近，所以為了維護(hù)儀器的壽命，選擇C1為最優(yōu)條件。綜上，確定五味子總木脂素提取的最優(yōu)提取條件為A2B2C1，即超聲功率為200 W，提取時(shí)間為30 min，微波功率為150 W。

表5 五味子總木脂素得率正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5 最優(yōu)提取條件下五味子總木脂素的含量測定

精密稱取3 份4.00 g 濾渣，按最優(yōu)提取條件提取。如表6 所示，五味子木脂素粗提物中總木脂素的含量和得率均值分別為48.31%和8.55%。

表6 最優(yōu)提取條件下五味子總木脂素的得率和含量

2.6 最優(yōu)提取條件所得木脂素粗提物中7 個(gè)化學(xué)物質(zhì)含量測定方法學(xué)考察及含量測定

2.6.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按“1.6.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析7個(gè)木脂素成分的對(duì)照品溶液和供試品溶液，考察結(jié)果見圖1，五味子木脂素粗提物中7個(gè)化學(xué)成分的保留時(shí)間分別為3.76、4.51、8.31、8.57、12.24、13.13 和13.54 min，各色譜峰之間均能達(dá)到較好分離效果，且峰形對(duì)稱。

圖1 7個(gè)木脂素對(duì)照品及五味子木脂素粗提物供試品溶液UPLC色譜圖

2.6.2 線性 取“1.2.6.2”項(xiàng)下配制的7個(gè)系列濃度的混合對(duì)照溶液，分別按照“1.2.6.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣1 μL，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，擬合線性回歸方程。結(jié)果表明，五味子醇甲在2.5～100 μg/mL，五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素在0.25～10 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。見表7。

表7 五味子木脂素粗提物中7個(gè)化學(xué)物質(zhì)含量測定方法學(xué)考察

2.6.3 加樣回收率 精密稱取6.00 mg 凍干粉共9份，均置于10 mL容量瓶中，平均分為3組。3組分別根據(jù)凍干粉所含7 個(gè)木脂素成分的含量加入0.5倍、1倍、1.5倍質(zhì)量比的對(duì)照品溶液，定容至刻度后按照“1.2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析。由峰面積計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），如表7 所示，表明該方法的加樣回收率結(jié)果符合含量測定要求。

2.6.4 精密度試驗(yàn) 精密移取“1.2.6.2”項(xiàng)下配制的其中1份混合對(duì)照溶液，按照“1.2.6.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積的RSD 值，如表7。說明儀器的精密度良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“1.2.6.3”項(xiàng)制備1份供試品溶液，分別在溶液配制后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積的RSD值，見表7。表明待測物在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定6.00 mg 凍干粉6 份，按照“1.2.6.3”項(xiàng)平行制備6 份供試品溶液，分別于“1.2.6.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算6份供試品溶液含量的RSD 值，見表7。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 五味子總木脂素粗提物中7 個(gè)化學(xué)物質(zhì)的含量測定

精密移取1 μL“1.2.6.3”項(xiàng)下配制的供試品溶液，按照“1.2.6.1”項(xiàng)色譜條件分析，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中7個(gè)木脂素成分的含量。經(jīng)計(jì)算可知，五味子總木脂素粗提物中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的含量分別為4.22%、1.04%、0.28%、0.88%、1.6%、1.71%和0.05%。

3 討 論

本研究采用超聲波微波協(xié)同輔助提取的方法，以單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了五味子總木脂素的提取工藝。與傳統(tǒng)的加熱回流法相比，本研究的優(yōu)點(diǎn)在于引進(jìn)了能產(chǎn)生較強(qiáng)剪切效應(yīng)、空化效應(yīng)的超聲波和能夠直接作用于分子的微波。超聲波的作用使五味子總木脂素傳質(zhì)效率提高，得率升高［18-19］；而微波作用在分子上不僅可以使體系溫度迅速升高，還能促進(jìn)細(xì)胞的破裂，加快木脂素的溶解和擴(kuò)散，所以溶出速度變快，溶出量增多［20］。除此之外，單因素實(shí)驗(yàn)證明了能夠影響木脂素溶出率的因素還有料液比和提取時(shí)間，適當(dāng)增加提取過程的料液比和提取時(shí)間可以減少過飽和與溶出不徹底等現(xiàn)象。但是當(dāng)溶出速率達(dá)到平衡，提取時(shí)間將不再影響得率［21］，提取出來的木脂素長時(shí)間暴露在微波和超聲波狀態(tài)下，反而增加了結(jié)構(gòu)降解和破壞的可能性［22］。料液比過大可能會(huì)導(dǎo)致作用在物料上的超聲波與微波小于溶劑上的［23］，以及升溫時(shí)間延長［24］等問題。同樣的，高功率的微波存在明顯的過熱現(xiàn)象［25］，在較高加熱速率下，細(xì)胞快速破裂，提取物的純度可能降低，影響木脂素溶出速度和溶出量［22］；高強(qiáng)度的微波與超聲波還會(huì)增加木脂素結(jié)構(gòu)的破壞和降解，導(dǎo)致木脂素的得率下降［25-26］。因此，優(yōu)化出五味子總木脂素的最優(yōu)提取條件為：提取溶劑為80%的乙醇，料液比為1∶20，提取溫度為60 ℃，微波功率為150 W，超聲波功率為200 W，提取時(shí)間為30 min。五味子總木脂素的含量和得率分別高達(dá)48.31%和8.55%。在該提取條件下，通過UPLC法測得凍干粉中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素7 個(gè)化學(xué)成分含量分別為4.22%、1.04%、0.28%、0.88%、1.60 %、1.71%和0.05%。該方法準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性好，提取時(shí)間短，效率高，操作簡便，可為后續(xù)五味子總木脂素功能性及其機(jī)制研究提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突