海南地區(qū)居民冠心病的相關(guān)基因表達(dá)差異性分析

張順利，謝彩嬋，廖陸梟，陳永昆，張石龍，王小啟

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬院心血管外科，海南 ?？?570311；2.云南省阜外心血管病醫(yī)院心外科，云南 昆明 650000）

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，冠心病（coronary heart disease，CHD）的發(fā)病率也顯著升高，發(fā)病年齡逐漸年輕化，冠心病已經(jīng)成為全世界主要致死原因之一。冠心病的并發(fā)癥多，如心絞痛、心律失常、心衰、血栓栓塞、心肌梗死，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心臟驟停。治療難度大，無論是藥物治療還外科手術(shù)治療均不能根治。外科手術(shù)是目前治療冠心病的最有效方法，然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在1 年的隨訪中，經(jīng)PCI 治療的冠心病人中死亡率為1.6%，再次行血運(yùn)重建率為5.9%；冠脈搭橋的病人死亡率為0.9%，再次行血運(yùn)重建率3.9%［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組2020 年發(fā)布的《全球衛(wèi)生估計(jì)》報(bào)告，2019 年全球因心血管疾病死亡的人數(shù)為5 540 萬人，而冠心病死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的16%［2］。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)2020 年心臟病和中風(fēng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更新的報(bào)告表明2016 年美國(guó)在20 歲以上的成人中冠心病人數(shù)為18.2 百萬人，總患病率為6.7%［3］。截止2018 年，心臟病成為美國(guó)所有死亡人數(shù)最多的疾病，冠心病的死亡人數(shù)在2017 年為365 914 人，死亡率為92.9%［4，5］。根 據(jù)《中 國(guó) 心 血 管 健 康 與 疾 病 報(bào) 告2021》［6］報(bào)告，中國(guó)的心血管病呈持續(xù)上升趨勢(shì)，目前估計(jì)約3.3 億，冠心病有1 139 萬，2019 年中國(guó)城市居民冠心病死亡率為121.59/10 萬，農(nóng)村為130.14/10 萬。2019 年中國(guó)心腦血管疾病的住院總費(fèi)用為3 133.66 億元。其中，心血管疾病的住院總費(fèi)用為1 773.38 億元，其中缺血性心肌病為1 256.25 億元，反復(fù)的治療給病人帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。經(jīng)過多年對(duì)冠心病的研究已經(jīng)明確了，冠心病是一個(gè)復(fù)雜的多因素疾病，包括環(huán)境因素和遺傳因素。Framingham 研究已經(jīng)證實(shí)了一系列冠心病的危險(xiǎn)因素，包括年齡、性別、家族史、吸煙、高血壓、血脂異常和糖尿病等，被稱之為冠心病的“傳統(tǒng)危險(xiǎn) 因 素”［7，8］。全 世 界 多 個(gè) 研 究 團(tuán) 隊(duì) 對(duì) 不 同 人 群 冠心病易感基因進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（GWASs）發(fā)現(xiàn)了161 個(gè)冠心病易感基因/位點(diǎn)，有力地推動(dòng)了冠心病遺傳學(xué)的發(fā)展［9-12］。一項(xiàng)對(duì)超過20 000 對(duì)瑞典雙胞胎的研究證實(shí)了近親之間冠心?。–HD）的風(fēng)險(xiǎn)增加，并估計(jì)致命性CHD 的遺傳率約為50%；另一項(xiàng)利用全基因組關(guān)聯(lián)研究的方法對(duì)遺傳率進(jìn)行量化的分析同樣估計(jì)了CHD 的遺傳率為40%～50%［13］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于載脂蛋白E 基因（ApolipoproteinE gene，ApoE）、載 脂 蛋 白B（ApolipoproteinB gene，APOB）、血 管 緊 張 素 基 因（Angiotensino gene，AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因（Angiotensin converting enzyme gene，ACE）、G 蛋白β3 亞單位基因（Guanine nucleotide binding protein subunit β three gene，GNB3）、亞甲基四氫葉酸還原酶基因（Methylene tetrahydrofolate reductase gene，MTHFR）、皮型一氧化氮合酶基因（Endothelial nitric oxide synthase gene，NOS3）、E-選擇素基因（E-selectin gene，ESLE）、白細(xì)胞介素6 基因（Interleukin-6 gene，IL-6）、腫瘤壞死因子基因（Tumor necrosis factor gene，TNF）、血漿纖維蛋白原B 基因（Plasma fibrinogen B gene，F(xiàn)GB）研究的主流觀點(diǎn)認(rèn)為與冠心病有關(guān)，能導(dǎo)致冠心病的發(fā)病與進(jìn)展，是冠心病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，這些冠心病相關(guān)基因有望在將來成為冠心病治療的靶點(diǎn)。

隨著對(duì)冠心病研究的深入，對(duì)于冠心病發(fā)病的早期預(yù)防越來越凸顯出它的重要地位?！傲慵?jí)預(yù)防”近來被國(guó)內(nèi)學(xué)者引入主要局限于心血管領(lǐng)域?！傲慵邦A(yù)防”最早由國(guó)外學(xué)者Toma Strasser 于1978 年提出的一個(gè)概念名稱。Toma Strasser 認(rèn)為應(yīng)采取措施阻止心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素的出現(xiàn)，從而預(yù)防風(fēng)險(xiǎn)因素在人群中的流行，進(jìn)而預(yù)防心血管疾病的發(fā)生?！傲慵?jí)預(yù)防”的理念是指人的健康為中心，以健康或疾病風(fēng)險(xiǎn)因素發(fā)生前的防控為重點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)從“新的生命出生之前”“風(fēng)險(xiǎn)未出現(xiàn)時(shí)”“病變未發(fā)生時(shí)”和“身體未衰老時(shí)”的全生命周期健康管理，與中醫(yī)“治未病”的核心理念一致［14］。冠心病相關(guān)基因的表達(dá)存在個(gè)體、種族及地域的差異，因此對(duì)區(qū)域冠心病基因表達(dá)情況的深入了解，有助于為該區(qū)域冠心病高危人群的篩查提供一個(gè)科學(xué)的方法，有利于該地區(qū)冠心病的零級(jí)預(yù)防。中國(guó)作為一個(gè)統(tǒng)一的多民族的國(guó)家，各個(gè)民族間對(duì)于冠心病基因的表達(dá)也可能存在不同，因此，我們選取11 個(gè)國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的與冠心病相關(guān)包含了冠心病的傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素的基因，研究他們?cè)诤Ｄ系貐^(qū)的表達(dá)情況，以期為海南居民提供一個(gè)早期篩查冠心病高危人群的方法，為海南人冠心病的“零級(jí)預(yù)防”提供一定的理論依據(jù)，改善醫(yī)療質(zhì)量，綜合提高海南地區(qū)冠心病的綜合防控能力。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究采用病例對(duì)照，選取了2020 年1 月1 日～2022 年6 月30 日，到自海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管病外科和心內(nèi)科就診的住院患者，樣本籍貫均為海南籍。本課題的研究?jī)?nèi)容符合赫爾辛基宣言的條款，并且通過了海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。與患者簽署相關(guān)知情同意書。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）2020 年1 月1 日～2022 年6 月30 日在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心外科或心內(nèi)科就診的成年住院病人；（2）籍貫是海南，在海南地區(qū)生活滿30 年以上；（3）住院期間完善冠狀動(dòng)脈造影；

1.1.2 分組標(biāo)準(zhǔn) 按照《穩(wěn)定性冠心病基層診療指南（2020 年）》冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，造影結(jié)果證實(shí)心外膜下冠狀動(dòng)脈直徑狹窄＞50%，且患者有典型的心絞痛癥狀或無創(chuàng)檢查提示心肌缺血診斷為冠心病的病人歸冠心病組；不符合該診斷標(biāo)準(zhǔn)的病人歸為非冠心病組。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）籍貫不是海南；（2）伴有嚴(yán)重感染、肝腎功能不全、腫瘤疾病、心衰、合并慢性感染風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料的收集 收集所有研究對(duì)象年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、膽固醇。吸煙史：根據(jù)1984 年WHO 對(duì)于吸煙標(biāo)準(zhǔn)界定，吸煙每日＞1 支，持續(xù)時(shí)間＞1 年，或者患者曾經(jīng)吸煙，但戒煙時(shí)間＜10 年。飲酒史：飲酒每次＞100 g，每星期超2 次及以上，持續(xù)時(shí)間＞半年。

1.2.2 樣本收集及處理 所有患者入院后48 h 內(nèi)完善抽血，單獨(dú)抽取3 mL 外周靜脈全血放入含有抗凝劑的試管中，常溫保存，當(dāng)日即送往海南普瑞特科技有限公司基因公司完成相關(guān)基因提取及基因定量表達(dá)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS26.3 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.一般正態(tài)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，非正態(tài)計(jì)量資料用中位數(shù)M描述，計(jì)數(shù)資料用率、構(gòu)成比描述。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用非參數(shù)檢驗(yàn)，分類資料、計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。運(yùn)用Spearman 相關(guān)性分析探討冠心病基因表達(dá)量與冠心病、一般臨床資料的相關(guān)性；探討冠心病基因在兩組人群的表達(dá)差異性；探討高表達(dá)基因與一般臨床資料的相關(guān)性；有差異的因素與冠心病組中高表達(dá)基因的相關(guān)性；冠心病中高表達(dá)基因與冠心病合并高血壓、糖尿病、冠心病家族史的相關(guān)性?；虮磉_(dá)量采用Studentst檢驗(yàn)檢測(cè)是否有顯著性差異，P＜0.05 表示有顯著性差異，使用GraphPad Prism 8.0 作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

冠心病組病例數(shù)（170），高于非冠心組病例數(shù)（55），在性別方面，冠心病組男性數(shù)（126）高于非冠心病組女性（26），非冠心病組女性數(shù)（26）低于男性數(shù)（29），并且兩個(gè)組別之間性別比率存在差異，（P=0.03，P＜0.05）。吸煙史、飲酒史、糖尿病、高血壓、冠心病家族史、年齡冠心病組均高于非冠心病組，并且兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）。總膽固醇冠心病組高于非冠心病，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0，P＜0.05）。甘油三酯、低密度蛋白、高密度蛋白，冠心病組均低于非冠心病組，兩組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 CHD 與NCHD 兩組基線資料比較Tab 1 Comparison of baseline data between the CHD and NCHD groups

2.2 冠心病基因與冠心病的關(guān)系

由表2 發(fā)現(xiàn)冠心病與AGT基因呈負(fù)相關(guān)（r=-0.163，P=0.011，P＜0.05）、APOB基因呈正相關(guān)（r=0.75，P=0，P＜0.01）、FGB基因呈負(fù)相關(guān)（r=-0.163，P=0.011，P＜0.05），GNB基因呈負(fù)相關(guān)（r=-0.165，P=0.011，P＜0.05）、SELE基因呈負(fù)相關(guān)（r=-0.171，P=0.007，P＜0.01）、MHTHR基因呈負(fù)相關(guān)（r=-0.210，P=0.001，P＜0.01）、TNF基因 呈 負(fù) 相 關(guān)（r=-0.131，P=0.04，P＜0.05），與APOE、NOS3、ACE、IL6等 基 因 無 相 關(guān) 性（P＞0.05）。

表2 冠心病基因表達(dá)量與冠心病的相關(guān)性（斯皮爾曼 Rho）Tab 2 Correlation between coronary heart disease gene expression and coronary heart disease（Spearman Rho）

2.3 兩組基因的表達(dá)情況

載脂蛋白B 基因（ApoB）在冠心病組中高表達(dá)t=7.816，P＜0.000 1（圖1A）；AGT基因t=3.126，P=0.002 0（圖1B、ApoE基 因t=3.641，P=0.000 3（圖1C）、FGB基因t=3.384，P=0.000 8（如圖1D）、GNB基 因t=3.337，P=0.001（圖1E）、MTFHR基因t=3.937，P=0.000 1（圖1F）、SELE基 因t=3.132，P=0.002（圖1G）、TNF基 因t=2.585，P=0.010 4（圖1H）在非冠心病組高表達(dá)；NOS3基因t=1.719，P=0.087（圖1I）、IL6基 因t=1.755，P=0.080 6（圖1J）、ACE基因t=0.584 5，P=0.559 5（圖1K）在兩組間的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 兩組患者基因表達(dá)相對(duì)大小Fig 1 Relative size of gene expression in two groups of patients

2.4 冠心病組高表達(dá)基因與血脂的相關(guān)性分析

冠心病ApoB基因與甘油三酯呈負(fù)向相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r=-0.461，P=0.000），與年齡呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r=0.173，P=0.009），與總膽固醇呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為（r=0.499，P=0.000），與高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r=-0.181，P=0.007），與低密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r=-0.143，P=0.031），見表3。

表3 載脂蛋白B 基因與血脂的相關(guān)性（斯皮爾曼 Rho）Tab 3 Association between apolipoprotein B gene and blood lipids（Spearman Rho）

3 討論

冠心病因其發(fā)病率高，并發(fā)癥多，不可根治，發(fā)病機(jī)制不清，花費(fèi)高，對(duì)于病人來說經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，對(duì)其機(jī)制、流行病學(xué)、風(fēng)險(xiǎn)因素、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)基因的研究，尋找早期識(shí)別冠心病的方法，進(jìn)行早期干預(yù)，優(yōu)化冠心病的治療，一直吸引著各國(guó)科研研究者探索。海南位于我國(guó)最南端，地處亞熱帶，國(guó)內(nèi)多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)ACE基因多態(tài)性、AGT基因多態(tài)性、乙醛脫氫酶（ALDH）2 基因多態(tài)性、AOPE基因多態(tài)性、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）基因的突變、Klotho基因多態(tài)性、PCSK9基因的E670G 多態(tài)性、甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）基因異亮氨酸（Ile）796 纈氨酸（Val）多態(tài)性在海南地區(qū)人群中與冠心病相關(guān)，能增加冠心病的患病率及風(fēng)險(xiǎn)［15-20］。先前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)載脂蛋白B 與血液中脂質(zhì)代謝存在明顯的相關(guān)性，脂質(zhì)代謝異常與冠心病的發(fā)生關(guān)系較為密切，載脂蛋白B 基因編碼乳糜微粒及LDL的載脂蛋白，是冠心病的最強(qiáng)預(yù)測(cè)因子［21，22］。本研究發(fā)現(xiàn)在海南地區(qū)冠心病患者中，載脂蛋白B 基因與冠心病 呈 正相關(guān)關(guān)系（r=0.75，P=0.000，P＜0.01），與非冠心病組相比明顯高表達(dá)，t=7.816，P＜0.000 1，提示載脂蛋白B 基因的表達(dá)量可以用于海南地區(qū)人群冠心病“零級(jí)預(yù)防”篩查，對(duì)于篩查出現(xiàn)載脂蛋白B 基因高表達(dá)的人群，可對(duì)其早期進(jìn)行冠心病一級(jí)預(yù)防，進(jìn)而優(yōu)化海南地區(qū)冠心病的防控。本研究也發(fā)現(xiàn)在載脂蛋白B 基因與血液中總膽固醇呈正相關(guān)（r=0.499，P=0.000），提示載脂蛋白B 基因可能通過影響總膽固醇血漿濃度參與冠心病的發(fā)生過程。另發(fā)現(xiàn)與高密度脂蛋白（r=-0.181，P=0.007），低密度脂蛋白（r=-0.181，P=0.007）、甘油三酯呈負(fù)相關(guān)（r=-0.461，P=0），這與國(guó)外學(xué)者研究不同［22，23］。分析原因：（1）選取的樣本都是住院病人，非自然狀態(tài)下的冠心病人和健康人，這樣就不能真實(shí)反映冠心病和對(duì)照組的差異；（2）冠心病組和非冠心病的劃分依據(jù)目前臨床上冠心病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)于不符合冠心病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的病人劃分為非冠心病組，就使得非冠心病組實(shí)際上納入了冠心病的潛在病人，會(huì)影響兩組人群實(shí)際冠心病的表達(dá)情況；（3）由于資金有限，納入的樣本量有限，進(jìn)一步增大樣本量可能會(huì)減小抽樣誤差；（4）冠心病的基因在目前發(fā)現(xiàn)與冠心病有關(guān)的基因達(dá)161個(gè)，大多在西方國(guó)家，在中國(guó)人群得到驗(yàn)證的基因9p21.3、12q21.33、6p21.32、4q32.1、2p24.1 等 位 點(diǎn)，提示存在地域和種族的差異。海南地處熱帶、種族較多，納入種族的不同，也可能導(dǎo)致兩組基因表達(dá)的不同。

AGT基因（P=0.015 8）、ApoE基因（P=0.012 6）、FGB基因（P=0.005）、GNB基因（P=0.015 1）、MTFHR基 因（P=0.011 9）、SELE基 因（P=0.005）、TNF基因（P=0.029 8）等在非冠心病組高表達(dá)，ACE基因（P=0.785 2）等在兩組間的表達(dá)沒有差異，這與云美玲等［16］、周代鋒等［17］、張勇等［15］的研究結(jié)果不一致，考慮原因如下：（1）在非冠心病組納入了經(jīng)造影檢查冠脈有狹窄不滿足冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)的樣本，這使得非冠心病組的樣本可能也是冠心病的潛在患者，這樣就使得兩組基因表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。制定更詳細(xì)的納入標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)得到不同的結(jié)果。（2）選擇的樣本量較少，尤其是非冠心病組，增大樣本量或許會(huì)出現(xiàn)不一樣的結(jié)果。（3）不同人群具有不同的生活方式，暴露的危險(xiǎn)因素不盡相同。

本研究結(jié)果的優(yōu)勢(shì)是同時(shí)研究了國(guó)內(nèi)外比較認(rèn)可的與冠心病相關(guān)的11 個(gè)基因，通過成熟的PCR技術(shù)測(cè)定這些基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)量，探討在海南地區(qū)冠心病與非冠心病人群的表達(dá)差異，整個(gè)實(shí)驗(yàn)交由海南普瑞特科技有限公司測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。本研究存在如下不足：（1）納入的樣本量不夠大，可能出現(xiàn)選擇偏倚，應(yīng)擴(kuò)大樣本量；（2）基因與環(huán)境可能存在著更為復(fù)雜關(guān)系未被發(fā)現(xiàn)，因此需要擴(kuò)大影響因素的范圍進(jìn)一步研究；（3）在本研究中，這些基因?qū)谛牟〉陌l(fā)病不起作用或者起到很輕微的作用；（4）各基因表型及多態(tài)性在冠心病組和非冠心病組未進(jìn)行探索，在后續(xù)的研究中可以繼續(xù)研究。

綜上所述，載脂蛋白B 基因是海南地區(qū)冠心病人群的一個(gè)高危因素指標(biāo)，有可能豐富海南冠心病高危人群的篩查手段，能夠改善目前的預(yù)防策略。AGT、ApoE、FGB、GNB、MTFHR、SELE、TNF等基因可能是海南非冠心病人群的保護(hù)基因，這些基因的高表達(dá)可能會(huì)降低冠心病的發(fā)生，仍需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張順利：文章撰寫；王小啟：文章修改及指導(dǎo)；陳永昆、廖陸梟及張石龍：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。