芪藶強(qiáng)心膠囊對心肌梗死大鼠心臟IP3Rs/GRP75/VDAC1 基因調(diào)控的機(jī)制研究

紀(jì)曉迪，楊 丁，崔喜元，婁利霞，聶 波，趙久麗，趙明鏡，吳愛明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700）

心肌梗死（MI）是常見的心血管突發(fā)事件，可引起心臟廣泛的病理改變，包括細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)，心肌纖維化，能量代謝紊亂等。其中Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡是MI 后多種病理變化的基礎(chǔ)［1］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MI 大鼠存在過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡［2，3］。然而具體的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)心肌缺血伴隨線粒體Ca2+超載現(xiàn)象［4］，Ca2+凋亡信號會誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡。這嚴(yán)重?fù)p害了心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心臟收縮舒 張 功 能 解 耦 聯(lián)，進(jìn) 而 誘 發(fā) 心 律 失 常 和 心 衰［5，6］。因此，糾正線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡對于MI 的治療至關(guān)重要［7，8］。

臨床上，芪藶強(qiáng)心膠囊廣泛用于MI 后心衰的治療，能提高患者心功能，改善其生活質(zhì)量［9，10］。研究表明芪藶強(qiáng)心膠囊可以直接調(diào)控心肌細(xì)胞Ca2+信號而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［11，12］。但是其對于線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用尚未見報導(dǎo)。本研究旨在從基因?qū)用娉醪教接戃嗡瀼?qiáng)心膠囊調(diào)控線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運復(fù)合體IP3Rs/GRP75/VDAC1基因表達(dá)治療MI 的藥效機(jī)制，為芪藶強(qiáng)心膠囊的臨床應(yīng)用提供新的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，6 周齡，自維通利華實驗技術(shù)有限公司（北京）購入，［許可證號：SCXK（京）2012-0001］。本研究所用動物已取得北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動物管理委員會批準(zhǔn)。所涉及的研究方案均符合中國倫理委員會關(guān)于實驗動物的指導(dǎo)原則。

1.1.2 藥物及試劑 芪藶強(qiáng)心膠囊，由以嶺藥業(yè)股份有限公司（石家莊）提供（國藥準(zhǔn)字Z20040141）；卡托普利，由中美上海施貴寶制藥有限公司提供（批號：AAN9869）；Trizol （美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號：15596026）；PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國Applied Biosystems 公司，批號：4472897）；TUNEL 試劑盒（美國Promega 公司，批號：G3250）；細(xì)胞固定液（上海Beyotime，批號：P0098），熒光封片劑（北京中杉金橋，批號：ZLI-9557），RIPA 裂解液（上海Beyotime，批號：P0013B），B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（proteintech，26593-1-AP），Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（proteintech，60267-1-Ig），GAPDH 抗體（proteintech，60004-1-Ig）。

1.1.3 主要儀器 FX-7202 心電圖機(jī)（北京福田）；ALC-V8S 小動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物公司）；Gene Amp PCR system 9700 基因擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems 公司）；包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)（德國徠卡），DM300 光學(xué)顯微鏡（德國徠卡）；JA1003N電子精密天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；4 ℃離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；生物顯微鏡（蔡司Axio Scope.A1）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法建立MI 模型［13］。首先，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉大鼠。隨后，進(jìn)行氣管插管并連接呼吸機(jī)（吸呼比1∶2，潮氣量7 mL，呼吸頻率80 次/分）。于心前區(qū)胸骨左緣第3、4 肋間橫向開胸，在肺動脈圓錐與左心耳之間的下緣2 mm 處進(jìn)行結(jié)扎，術(shù)中可見結(jié)扎位點下心肌缺血變白，隨即逐層縫合關(guān)胸。假手術(shù)組作為對照組，只開胸穿線不做接扎。手術(shù)后連續(xù)3 d 腹腔注射40 U 青霉素預(yù)防感染。

1.2.2 分組及給藥 選擇術(shù)后即刻心電圖（ECG）出現(xiàn)ST 段抬高且術(shù)后24 h ECG 出現(xiàn)6～8 個病理性Q 波的大鼠入組，根據(jù)病理性Q 波個數(shù)將動物隨機(jī)均勻地分到模型組、芪藶強(qiáng)心組和卡托普利組。另外設(shè)有假手術(shù)組，每組8 只。術(shù)后第2 天開始灌胃給藥4 周，芪藶強(qiáng)心組給予芪藶強(qiáng)心藥物混懸液0.32 g·kg-1·d-1），卡 托 普 利 組 給 予 卡 托 普 利 混 懸 液2.25 mg·kg-1·d-1），假 手 術(shù) 組 和 模 型 組 給 予 等 體 積10 mL·kg-1·d-1）去離子水。

1.2.3 硝基藍(lán)四氮唑（NBT）染色 參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行NBT 染色觀察大鼠心臟梗死面積。打開胸腔，迅速取出大鼠心臟，在提前預(yù)冷的生理鹽水中浸泡以去除血漬。去除心房組織，沿心臟長軸連續(xù)橫切約2 mm 厚切片，置于2%NBT 染液，避光，37 ℃恒溫孵育1 h。

1.2.4 HE 染 色 取4 μm 厚 組 織 切 片 進(jìn) 行HE 染色：60 ℃烤片1 h，隨后二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，自來水沖洗5 min，蘇木素染核10 min，水洗10 s，鹽酸酒精分化30 s，水洗10 min。伊紅染色10 min，水洗1 min。隨后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，晾干后于顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。

1.2.5 實時熒光PCR 心肌組織總RNA 通過Trizol 方法提取，其純度確保在正常范圍，OD（260/280）在1.8～2.0 之間。參照說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Real-Time PCR 法檢測各組目的基因相對表達(dá)量，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共計40個 循 環(huán)。以GAPDH 做 為 內(nèi) 參，采 用2-△△CT法 計 算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequences

1.2.6 Western Blot 采用RIPA 裂解法提取心肌組織總蛋白。通過SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，隨后濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)到NC 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗Bcl-2，Bax 4 ℃過夜。次日，室溫孵育二抗1 h 隨后化學(xué)發(fā)光觀察蛋白條帶。

1.2.7 TUNEL 染色 將切好的心肌組織切片于二甲苯中充分脫蠟、梯度乙醇下行水化；隨后在細(xì)胞固定液中浸泡5 min，加入20 μg/mL 蛋白酶K 溶液，室溫孵育10 min，再次浸泡在細(xì)胞固定液中5 min，經(jīng)PBS 漂洗后，加入平衡液孵育10 min。在避光環(huán)境下滴加rTdT 緩沖液，37 ℃孵育1 h。最后用2X SSC 終止反應(yīng)。滴加含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片。顯微鏡下可觀察到表示凋亡細(xì)胞核的綠色熒光和表示正常細(xì)胞核的藍(lán)色熒光。使用Image-Pro Plus 計數(shù)凋亡細(xì)胞核以及正常細(xì)胞核數(shù)目，計算各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間方差齊則采用LSD 法，反之采用Dunnett's T3 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型評價

分別在將動物實施左冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)前，術(shù)后即刻，術(shù)后24 h 進(jìn)行ECG 檢測。結(jié)果顯示，手術(shù)前大鼠ECG 均處于正常范圍。假手術(shù)組大鼠的術(shù)后即刻和術(shù)后24 h ECG 均無明顯異常變化；而模型組大鼠術(shù)后即刻ECG 可見ST 段抬高，術(shù)后24 h ECG 出現(xiàn)明顯的病理性Q 波，提示出現(xiàn)心肌缺血損傷，心肌梗死模型造模成功。結(jié)果見圖1A。此外，進(jìn)一步通過NBT 染色評價心肌梗死模型造模情況，染色后非梗死區(qū)呈紫黑色，而梗死區(qū)不著色。結(jié)果可見，假手術(shù)組大鼠心臟表現(xiàn)為均勻一致的紫黑色，即無梗死區(qū)域；而模型組大鼠心臟存在大面積無著色的梗死區(qū)域，再次證明心肌梗死模型建立成功。結(jié)果見圖1B。

圖1 心肌梗死模型評價Fig 1 Evaluation of myocardial infarction model

2.2 心臟大體結(jié)構(gòu)觀察

假手術(shù)組心臟大體結(jié)構(gòu)未見異常；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心臟體積變大，出現(xiàn)明顯缺血變白的梗死區(qū)，尤其左心室前壁變薄，梗死的心肌組織被結(jié)締組織取代而出現(xiàn)大范圍塌陷；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組和卡托普利組大鼠心臟大體結(jié)構(gòu)有所改善，缺血變白的梗死區(qū)范圍較小。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟大體結(jié)構(gòu)Fig 2 Gross structure of the heart of rats in each group

2.3 心肌組織HE 染色結(jié)果

HE 染色顯示，假手術(shù)組心肌組織形態(tài)無異常變化，心肌纖維橫紋清晰，排列致密整齊，細(xì)胞核大小基本一致，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染。模型組心肌組織可見明顯的細(xì)胞變性、壞死，心肌纖維斷裂，殘存的心肌細(xì)胞肥大，核固縮，細(xì)胞質(zhì)染色不均一。與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組和卡托普利組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所改善，組織病理損傷相對較輕。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果（400 ×）Fig 3 HE staining results of myocardial tissues of rats in each group （400 ×）

2.4 線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運相關(guān)基因mRNA 表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠三磷酸肌醇受體2（IP3R2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（GRP75）、電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組、卡托普利組IP3R2、GRP75、VDAC1、Mfn2mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表2，圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)比較Fig 4 Comparison of the expression of Ca2+ transport-related genes in each group

表2 各組大鼠心肌組織鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)情況（n=8，±s）Tab 2 Expression of Ca2+ transport-related genes in each group（n=8，±s）

表2 各組大鼠心肌組織鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)情況（n=8，±s）Tab 2 Expression of Ca2+ transport-related genes in each group（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

Mfn2 1.00±0.04 1.20±0.07**1.00±0.07##1.03±0.11##12.666 0.000組別假手術(shù)組模型組芪藶強(qiáng)心組卡托普利組FP IP3R2 1.12±0.52 1.78±0.12*1.02±0.28##1.17±0.30##8.196 0.000 GRP75 1.00±0.54 1.12±0.06**0.96±0.07##1.00±0.10##6.916 0.001 VDAC1 1.00±0.05 1.29±0.08**1.06±0.10##1.07±0.06##22.281 0.000

2.5 線粒體凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）mRNA 表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組、卡托普利組Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著升高，BaxmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見表3，圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較Fig 5 Comparison of the expression of apoptosis-related genes in each group

表3 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況（n=8，±s）Tab 3 Expression of apoptosis-related genes in each group（n=8，±s）

表3 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況（n=8，±s）Tab 3 Expression of apoptosis-related genes in each group（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

Bax 1.03±0.29 1.80±0.27**1.13±0.14##1.22±0.32##13.477 0.000組別假手術(shù)組模型組芪藶強(qiáng)心組卡托普利組F P Bcl-2 1.04±0.32 0.57±0.11**0.98±0.21##0.96±0.27##6.520 0.002

2.6 線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組、卡托普利組Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表4，圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig 6 Comparison of the expression of apoptosis-related proteins in each group

表4 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況（n=4，±s）Tab 4 Expression of apoptosis-related proteins in each group（n=4，±s）

表4 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況（n=4，±s）Tab 4 Expression of apoptosis-related proteins in each group（n=4，±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

Bax 0.97±0.11 1.43±0.21**1.09±0.12#1.01±0.19##6.748 0.006組別假手術(shù)組模型組芪藶強(qiáng)心組卡托普利組FP Bcl-2 1.00±0.05 0.81±0.09**0.97±0.05#0.96±0.10#4.992 0.018

2.7 心肌組織細(xì)胞凋亡率結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心組、卡托普利組心肌組織細(xì)胞凋亡率 顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表5，圖7～9。

圖8 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較Fig 8 Comparison of apoptosis rates in cardiac myocytes of each group of rats

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果（n=8，±s）Tab 5 Results of apoptosis rate of cardiac myocytes in each group of rats（n=8，±s）

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果（n=8，±s）Tab 5 Results of apoptosis rate of cardiac myocytes in each group of rats（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

細(xì)胞凋亡率（%）0.41±0.14 6.61±1.80**1.51±0.43##1.91±0.50##65.008 0.000組別假手術(shù)組模型組芪藶強(qiáng)心組卡托普利組FP

3 討論

MI 是持續(xù)缺血導(dǎo)致心肌損傷的病理事件，伴隨著細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的失衡以及心臟結(jié)構(gòu)和功能的損害［15］。而MI 所伴隨的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放失衡和線粒體Ca2+超載［16］，是造成細(xì)胞器損害進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。因此，MI 后線粒體Ca2+攝入異常的分子變化以及中醫(yī)藥的調(diào)控作用值得深入研究。

中醫(yī)認(rèn)為，MI 屬于脈絡(luò)病變范疇，氣虛血瘀是其基本病機(jī)，而絡(luò)塞積成是疾病進(jìn)展的另一關(guān)鍵病機(jī)［17］。芪藶強(qiáng)心膠囊是在中醫(yī)脈絡(luò)學(xué)說指導(dǎo)下研發(fā)的中成藥，具有益氣溫陽、活血通絡(luò)、利水消腫之功效，對于防治MI 后心衰療效顯著［18，19］。然而，這種心臟保護(hù)作用背后的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。線粒體作為細(xì)胞的動力源，其對Ca2+攝取的動態(tài)控制是心肌細(xì)胞實現(xiàn)生理功能或病理應(yīng)激的基礎(chǔ)［20］。本研究觀察了芪藶強(qiáng)心膠囊在調(diào)節(jié)線粒體Ca2+攝取通道相關(guān)基因表達(dá)方面的干預(yù)作用，希望為闡明其藥理機(jī)制提供新的實驗室證據(jù)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAMs）通道蛋白包括IP3Rs，GRP75，VDAC1 是維持線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)［21］。其中，IP3Rs 主要表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放；VDAC1 位于線粒體外膜上的Ca2+攝取通道，有研究發(fā)現(xiàn)VDAC1 在MI 后 的患者中顯著過表達(dá)［22］。此 外，VDAC1 可增加線粒體外膜通透性而被認(rèn)為是誘導(dǎo)凋 亡 所 必 需 的 分 子［23，24］。Zhao 等［25］研 究 發(fā) 現(xiàn)，MAMs 通道蛋白VDAC1，GRP75 上調(diào)與心肌肥厚進(jìn)展相關(guān)。GRP75 通過胞質(zhì)部分將IP3Rs 和VDAC1 相 互 連 接，形 成IP3Rs/GRP75/VDAC1 通道復(fù)合體介導(dǎo)線粒體Ca2+攝?。?6，27］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織IP3R2，GRP75，VDAC1mRNA 表達(dá)水平顯著升高，這從基因水平解釋了MI 后線粒體Ca2+攝取通道過度開放，繼而導(dǎo)致線粒體Ca2+超載的成因。而經(jīng)芪藶強(qiáng)心膠囊治療后，相關(guān)基因過表達(dá)的情況得到了改善，說明藥物可以通過調(diào)節(jié)IP3Rs/GRP75/VDAC1 通道復(fù)合體基因表達(dá)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Mfn2 是細(xì)胞不可或缺的多功能蛋白，在生理和病理條件下促進(jìn)線粒體融合、MAMs 的形成、細(xì)胞凋亡等生物過程［28］。目前研究表明Mfn2 與心衰的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。然而這種生物作用是保護(hù)性的還是損害性的，似乎與損傷的程度，以及其保護(hù)效應(yīng)與損害效應(yīng)之間的平衡相關(guān)［29］。作為線粒體Ca2+攝取通道的承載者，MAMs 是一個動態(tài)結(jié)構(gòu)，主要受Mfn2 調(diào)控，在生理狀態(tài)下為線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運提供一個穩(wěn)定的平臺。然而，MAMs 通道蛋白似乎不總是有利的。Riba 等［30］發(fā)現(xiàn)，在異丙腎誘導(dǎo)的心衰中，Mfn2 表達(dá)升高 ，Zhao 等［25］研究表明MAMs通路下調(diào)可能對心臟有保護(hù)作用。此外，Mfn2 基因敲除的心肌組織對Ca2+超載的耐受性更高［31］。在本研究中，模型組大鼠心臟Mfn2 mRNA 表達(dá)顯著升高，這似乎成為了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間過度Ca2+交流，并最終導(dǎo)致線粒體Ca2+超載的一個誘因。而與模型組相比，芪藶強(qiáng)心膠囊能夠明顯抑制Mfn2 mRNA 的過表達(dá)，這將有助于緩解MI 后線粒體Ca2+攝入過量的情況。

線粒體中Ca2+穩(wěn)態(tài)對于呼吸鏈復(fù)合體和Krebs循環(huán)中酶活性發(fā)揮關(guān)鍵作用。線粒體攝入Ca2+過量則導(dǎo)致其生物功能紊亂，進(jìn)而激活細(xì)胞線粒體凋亡通路［32］?？沟蛲龌駼cl-2是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。它不僅作用于線粒體，還作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過靶向抑制IP3Rs 而影響Ca2+動態(tài)進(jìn)而對抗細(xì)胞凋亡［33，34］。Ca2+介導(dǎo)的凋亡信號可引起B(yǎng)ax激活并轉(zhuǎn)移至線粒體外膜誘導(dǎo)線粒體釋放促凋亡因 子 如 細(xì) 胞 色 素c［35］。VDAC1 不 僅 是 激 活Bax 的一個重要上游分子，同時還寡聚化，為細(xì)胞色素c 釋放 提供通道［23，36，37］。此外，Mfn2參與招募Bax 至線粒體膜誘導(dǎo)凋亡［38］。Bcl-2和Bax相互調(diào)控維持著線粒體膜穩(wěn)定。在本研究中，模型組大鼠Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)均下降，Bax mRNA 和蛋白表達(dá)均增加；同時，TUNEL 染色顯示，與假手術(shù)組相比，模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加。提示MI 發(fā)生時，IP3Rs 的高表達(dá)擺脫了Bcl-2 的抑制作用并釋放Ca2+凋亡信號。Ca2+凋亡信號通過VDAC1 激活Bax 膜易位，最終導(dǎo)致線粒體凋亡通路的激活。而芪藶強(qiáng)心膠囊治療4 周可以提高Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)，降低Bax mRNA 和蛋白表達(dá)，恢復(fù)Bcl-2 和Bax 的動態(tài)平衡并且顯著降低細(xì)胞凋亡率。

MAMs 通道蛋白IP3R2，GRP75，VDAC1 已被證明是應(yīng)激信號從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體的樞紐，最顯著的是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失的情況下參與未折疊蛋白反應(yīng)［39］。前期實驗發(fā)現(xiàn)，MI 伴隨過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象［3］。本研究結(jié)果則進(jìn)一步提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳遞到線粒體進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑的過程與線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運復(fù)合體IP3R2/GRP75/VDAC1基因過表達(dá)有關(guān)。而芪藶強(qiáng)心膠囊能夠調(diào)節(jié)MI 后IP3R2/GRP75/VDAC1通道復(fù)合體基因的過表達(dá)，從而抑制線粒體凋亡通路的激活，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

綜上所述，本研究從基因水平揭示了芪藶強(qiáng)心膠囊靶向IP3R2/GRP75/VDAC1通道復(fù)合體基因表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡的新機(jī)制。但mRNA 水平調(diào)控尚不足以完全證明抑制Ca2+通路與凋亡之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。這是本研究的局限性，也是課題組今后的研究方向，后續(xù)將在蛋白水平進(jìn)一步補充實驗證據(jù)，希望能夠更深入全面的闡釋芪藶強(qiáng)心膠囊對IP3R2/GRP75/VDAC1 通道復(fù)合體的調(diào)控機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

吳愛明：實驗進(jìn)行總體設(shè)計以及文章審核；趙明鏡：文章思路以及文筆進(jìn)行指導(dǎo)；婁利霞、聶波、趙久麗：實驗技術(shù)指導(dǎo)；紀(jì)曉迪、楊丁、崔喜元：動物飼養(yǎng)以及指標(biāo)檢測；紀(jì)曉迪：Figdraw 平臺繪制圖9 并撰寫文章。

圖9 芪藶強(qiáng)心膠囊對心肌梗死大鼠Ca2+轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用Fig 9 Regulation of Qiliqiangxin Capsule on Ca2+ transport in rats with myocardial infarction

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。