探討益智仁調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝對糖尿病腎病小鼠的保護(hù)作用

倪雅麗，姚宇劍，武 素，謝毅強

（1.海南省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，海南 五指山 572200；2.海南省中醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，海南 ?？?570203；3.海南省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 ?？?570203；4.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是全球發(fā)病率和導(dǎo)致死亡率增加的主要疾病之一。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最嚴(yán)重的腎臟并發(fā)癥，是引起終末期腎病的最主要原因之一［1-3］。DN 發(fā)病的分子機制復(fù)雜多樣，目前尚未完全闡明［4，5］。益智仁（FructusAlpiniae oxyphyllae），性味辛，性溫，入腎、脾經(jīng)，是補腎溫腎之良藥，同時又長于固澀縮尿，辛而不循經(jīng)走竄，溫而不燥，具有溫脾止瀉攝涎，暖腎縮尿固精之功效。臨床常用于遺尿，遺精，腎虛等癥，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及抗應(yīng)激等方面的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，益智仁可以明顯降低DN 小鼠血糖濃度、過氧化氫及超氧陰離子含量，減少尿白蛋白排泄量，改善腎臟功能，調(diào)節(jié)腸道微生物的豐富度［6，7］。

代謝組學(xué)可以識別特定生理和病理條件下的特異性分子標(biāo)記物，并可用于研究代謝性疾病的發(fā)病機制和治療藥物的作用機制。研究表明，以代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的研究可以闡明中醫(yī)藥治療DN 的部分作用機制［8-10］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在系統(tǒng)生物學(xué)理論基礎(chǔ)上的一門新興學(xué)科，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)現(xiàn)代研究的新方法和重點之一，并在分子和系統(tǒng)水平上提供關(guān)于單一草藥或潛在處方的生物活性成分及其作用機制的豐富信息［11］。因此，基于上述原理采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及代謝組學(xué)技術(shù)，篩選益智仁治療的DN 相關(guān)潛在生物標(biāo)志物及代謝通路，系統(tǒng)性的分析益智仁治療DN 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及動物

益智仁，購自海南同仁堂藥業(yè)有限公司。厄貝沙坦片（安博維），購自賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：9A275。實驗小鼠［生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2015-0001，批號T002407］，由南京動物研究所提供。

1.2 試劑

尿素氮測試盒（批號C013）、尿肌酐測定試劑盒（批號C011），上述試劑均購自南京建成生物工程研究所。尿白蛋白試劑盒（批號ml037573），購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。甲醇（CAEQ-4-003302-4000）、甲酸（CAEQ-4-014784-0500）、乙腈（CAEQ-4-000308-4000）均購置CNW 公司。L-2-氯苯丙氨酸（14091-11-3），購自上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 儀器

血糖儀（強生，英國）；全波長酶標(biāo)儀（BioDeKInstruments，Inc.）；冷 凍 離 心 機（Eppendorf）；移液槍（Eppendorf，Germany）；恒溫水浴鍋（藍(lán)天化驗儀器廠，杭州）；恒溫箱（思昊科學(xué)儀器，湖北）；全自動樣品快速研磨儀（凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，上海）；超聲波清洗機（新芝生物科技有限公司，寧波）；漩渦振蕩器（汗諾儀器有限公司，上海）；高分辨質(zhì)譜儀（Waters）；高效液相色譜儀（Waters）；色譜柱（Waters）。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖”構(gòu)建

以“益智仁”為檢索詞，于TCMSP 在線數(shù)據(jù)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索主要活性成分及其相應(yīng)的靶點。以“Diabetic nephropathy”為檢索詞，應(yīng)用Genecards（https：//www.genecards.org/）檢索疾病相關(guān)基因。使用在線工具Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）篩選益智仁治療DN 的作用靶點，并運用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖”。

1.5 基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

將益智仁治療DN 的作用靶點輸入Omicshare在線工（https：//www.omicshare.com/tools/），選擇物種“Homo sapiens”，查找益智仁治療DN 的信號通路，并將信號通路進(jìn)行注釋分析。

1.6 藥物制備、小鼠分組及DN 小鼠造模

實驗室制備濃度為0.25 g/mL 益智仁水煎液及1.67 mg/mL 厄貝沙坦水溶液。小鼠分為4 組，其中DB-/DB-小鼠8 只一組；db-/db-小鼠24 只，隨機分為3 組，每組8 只。所有小鼠置于溫度為（22±1）℃與相對濕度為50%±5%環(huán)境中飼養(yǎng)，光照周期為12 h，給予無限的水喂養(yǎng)。DB-/DB-小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。db-/db-小鼠為自發(fā)型2 型糖尿病小鼠，給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)4～5 周后，小鼠明顯出現(xiàn)肥胖，8～9 周出現(xiàn)微量白蛋白尿?？崭寡牵?6.7 mmol/L（強生血糖儀）、24 h 尿白蛋白含量≥20 mg的為DN 小鼠模型。DN 小鼠造模成功后分為3 個組，分別為益智仁組（db-/db-Y）、厄貝沙坦組（db-/db-IRB）及生理鹽水組（db-/db-S）；益智仁灌胃劑量（預(yù)實驗）與厄貝沙坦灌胃劑量（人與小鼠劑量換算公式：小鼠的劑量＝9.1×人的劑量mg/kg）分為1.5 mg/g 與0.01 mg/g，灌胃量大約為0.2 mL 左右；正常組與生理鹽水組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃8 周。

1.7 尿素氮、尿肌酐及尿白蛋白按試劑盒說明書測定。

1.8 PAS 染色

腎臟制成石蠟切片→石蠟切片脫蠟→至蒸餾水水洗，過碘酸酒清液10 min→自來水沖洗10 min后，Schiff 氏液染色10 min→流水沖洗5 min，用哈瑞蘇木精染核3 min→流水沖洗5 min，常規(guī)脫水、透明、封固。

1.9 糞便樣品的預(yù)處理

1.9.1 稱取60 mg 糞便，向糞便中加入20 μL 的L-2-氯苯丙氨酸、20 μL 的Lyso PC17：0 與600 μL 的甲醇∶水（V∶V=4∶1）。

1.9.2 樣品中加入小鋼珠，在-20 ℃冰箱中放置2 min 預(yù)冷，放入研磨機（60 Hz，2 min），超聲提取10 min，隨后將樣品靜置于-20 ℃冰箱中30 min。

1.9.3 將樣品從冰箱中取出，置于離心機上，13 000 r/min，4 ℃，離心10 min，移液槍吸取200 μL 上清液，使用0.22 μm 的有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC 進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行LC-MS 分析。

備注：所有提取試劑使用前均在-20 ℃進(jìn)行預(yù)冷。

1.10 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 um）；流動相為 A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）。柱溫 45 ℃，流速 0.4 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

尿素氮、尿肌酐、尿白蛋白等數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以（±s）表示，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。代謝產(chǎn)物用UNIFI 1.8.1.軟件采集原始數(shù)據(jù)，采集的數(shù)據(jù)用SIMCA 軟件包處理；兩組多元統(tǒng)計分析比較用PLS-DA 分析分析。采用Omicshare 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omicshare.com），將P值和Fold change 進(jìn)行可視化處理。通過Metabo-Analyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）將 篩選到的差異代謝產(chǎn)物富集相應(yīng)的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量

給藥8 周后，測定各組小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量，結(jié)果如表1 所示。與正常組相比，生理鹽水組24 h 尿液中的尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量均顯著升高（P＜0.01 或P＜0.001）；與生理鹽水組相比，厄貝沙坦組和益智仁組小鼠24 h 尿液中的白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量（n=8，M/24 h，±s）Tab 1 Contents of urinary albumin，urea nitrogen and creatinine in mice of each group（n=8，M/24 h，±s）

表1 各組小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量（n=8，M/24 h，±s）Tab 1 Contents of urinary albumin，urea nitrogen and creatinine in mice of each group（n=8，M/24 h，±s）

注：與生理鹽水組比*P＜0.05、**P＜0.01；與正常組相比##P＜0.01、###P＜0.001。

組別正常組厄貝沙坦組益智仁組生理鹽水組尿白蛋白0.09±0.01 0.17±0.02**0.38±0.02**1.12±0.04##P—P—P—0.003 0.007 0.000 0.002 0.003 0.001尿素氮19.17±1.27 29.35±3.36**31.16±4.90*56.89±6.20###0.001 0.017 0.000尿肌酐5.84±1.93 11.78±1.74**9.54±2.01**22.81±2.34###

2.2 腎臟切片

結(jié)果如圖1 所示，給藥灌胃8 周后，與正常組相比，生理鹽水組可見腎小球彌漫性系膜擴張伴系膜細(xì)胞增殖；與生理鹽水組相比，益智仁組與厄貝沙坦組可見腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜擴張相對減少。

圖1 腎臟病理切片PAS 染色（箭頭處為腎小球）Fig 1 PAS staining of renal pathological section （the arrow is glomerulus）

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖”的構(gòu)建與分析

結(jié)果如圖2 所示，益智仁共篩選出治療DN 的4個有效成分及其28 個作用靶點。粉色六邊形表示4種有效成分，分別是胡蘿卜素（Daucosterol）、谷甾醇（sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）及谷甾醇棕櫚酸酯（sitosterol palmitate）。藍(lán)色圓形表示28 個作用靶點，包括NFKB1、BAX、PTGS1 及PTGS2 等。每種活性成連接多個靶點，多個靶點也連接多種成分，側(cè)面表明益智仁多成分、多靶點治療DN 的作用特點。

圖2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig 2 ＂Drug-component-target-disease＂ network

2.4 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析共篩選出與28 個作用靶點相關(guān)的43 條通路（P＜0.05），

剔出P值較小排名靠前的癌癥及其他疾病等假陽性相關(guān)通路，并繪制排名前20 的KEGG 富集分析氣泡圖，主要涉及的信號通路有：NF-κB 信號通路、TNF 信號通路、鞘脂信號通路及細(xì)胞凋亡等，見圖3A。將富集的43 條相關(guān)通路進(jìn)行注釋分析，其中與代謝作用相關(guān)的為脂質(zhì)代謝、輔因子和維生素代謝、外源生物降解與代謝及其他物質(zhì)的代謝等，見圖3B。查閱文獻(xiàn)［12］，筆者認(rèn)為脂質(zhì)代謝是益智仁治療DN 過程中主要的代謝途徑之一。

圖3 益智仁治療DN 作用靶點KEGG 富集分析氣泡圖（A）及KEGG 富集通路注釋分析柱狀圖（B）Fig 3 Bubble diagram （A）and annotation histogram （B）of KEGG pathways enriched by the potential targets of Yizhien in the treatment of DN

2.5 益智仁組與DN 組代謝產(chǎn)物初步分析

對實驗小鼠糞便質(zhì)譜信息進(jìn)行PCA 和PLSDA 多元統(tǒng)計比較。PCA 得分圖中模型組和益智仁組糞便樣品分別聚集在一起，結(jié)果見圖4A。PLSDA 圖中2 組樣本呈現(xiàn)較好的聚類效果，2 組明顯區(qū)分，結(jié)果見圖4B。上述結(jié)果均表明兩組樣本之間的存在代謝差異。

圖4 PCA（A）與PLS-DA（B）Fig 4 PCA（A）and PLS-DA（B）

2.6 益智仁組與DN 組差異代謝產(chǎn)物的分析

采用OPLS-DA 分析，根據(jù)VIP＞1 及t檢驗中P＜0.05 的條件，共篩選出益智仁組與DN 組潛在的584 個差異代謝物，包括磷脂酰膽堿PC（16∶0/0∶0）、溶血磷脂酰膽堿LysoPC（18∶1（9Z））及磷脂酰甘油PG（21∶0/0∶0）等。結(jié)果如圖5 所示，通過變量權(quán)重值（VIP 值），將VIP 值排名前30 對差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，VIP 值越大，表明該代謝產(chǎn)物在兩組中造成的影響越大。

圖5 VIP 值排名前三十的差異代謝產(chǎn)物熱圖Fig 5 Heatmap of differential metabolites in the top 30 VIP values

2.7 益智仁組與生理鹽水組差異代謝產(chǎn)物的代謝通路途徑分析

運用MetaboAnalyst 5.0 在線數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建差異代謝產(chǎn)物的相應(yīng)代謝途徑，篩選符合影響值＞0.10且-log（P）＞1.5 為條件的代謝途徑作為潛在靶標(biāo)代謝途徑。結(jié)果如圖6 所示，鞘脂代謝影響值與-log（P）值為0.154、2.355，甘油磷脂代謝影響值與-log（P）值為0.216、1.697，表明DN 小鼠模型代謝紊亂主要與鞘脂代謝與甘油磷脂代謝途徑有關(guān)。結(jié)合差異代謝產(chǎn)物分析結(jié)果，鞘脂代謝與甘油磷脂代謝途徑中包含的代謝產(chǎn)物主要為鞘磷脂、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺。與生理鹽水組相比，這4 種代謝產(chǎn)物在益智仁組中的均顯著下降（P＜0.01，P＜0.001 或P＜0.0001），結(jié)果如圖7所示。

圖6 DN 相關(guān)代謝途徑Fig 6 DN-related metabolic pathways

圖7 4 種代謝產(chǎn)物在兩組中的含量差異Fig 7 The content difference of four metabolites in two groups

3 討論

DN 的特征是進(jìn)行性腎臟功能減弱與腎小球濾過率（GFR）＜60 mL/min/per1.73 m2。DN 常規(guī)診斷方法主要包括尿白蛋白排泄率增加、腎小球濾過率下降及腎臟病理發(fā)生變化等。本研究通過測定24 h 尿液中尿白蛋白、尿肌酐、尿素氮含量及觀察腎臟病理變化進(jìn)行療效評價，發(fā)現(xiàn)益智仁能顯著降低模型小鼠24 h 尿液中尿蛋白、尿肌酐及尿素氮排泄量，并且能減少模型小鼠腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜擴張。

“藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖”分析結(jié)果表明，益智仁治療DN 的相關(guān)基因為28 個，分別為NR3C1、BAX、KL及PTGS2等。糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor，NR3C1），主 要 位 于 腎 小球、近端小管和髓袢升支粗段，存在于內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮NR3C1 的缺失加速糖尿病腎病的發(fā)展，足細(xì)胞NR3C1 體對于糖尿病患者的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［13，14］。促凋亡蛋白（Bax）是Bcl-2 家族的成員，是細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的核心調(diào)節(jié)因子，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中，Bax 表達(dá)水平明顯上調(diào)［15］。KLKlotho（KL）為一種抗衰老分子，主要在腎臟和大腦的脈絡(luò)膜叢中表達(dá)，KL 過表達(dá)可能對治療糖尿病和糖尿病腎病具有潛在的治療作用［16］。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵基因。Singh 等［17］發(fā)現(xiàn)，抑制COX-2 上調(diào)可以改善糖尿病腎病大鼠疾病狀態(tài)。

KEGG 通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝是益智仁治療DN 過程中主要的代謝途徑之一。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示的鞘脂代謝與甘油磷脂代謝途徑也證實了這一觀點。基于益智仁組與DN 組差異代謝產(chǎn)物分析，上述代謝途徑中包含的代謝產(chǎn)物主要為鞘磷脂、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺，且模型組小鼠在益智仁給藥后，這四種代謝產(chǎn)物含量均有顯著下降。代謝產(chǎn)物會隨著腎臟損傷的進(jìn)程發(fā)展而變化，進(jìn)而成為新的敏感性生物標(biāo)記物。鞘磷脂是真核生物膜磷脂的主要成分之一，與磷脂酰膽堿一起構(gòu)成50%以上的膜磷脂。有報道稱，鞘磷脂調(diào)控炎癥、脂肪組織功能、肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的發(fā)展［18，19］。研究表明，高鞘磷脂水平可能導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，增加患終末期腎病的風(fēng)險［20］。磷脂酰膽堿是細(xì)胞膜的主要成分，是脂質(zhì)第二信使的來源和細(xì)胞周期進(jìn)展的決定因素，在體內(nèi)具有多種生物活性，如抗炎［21］、改善腦功能［22］及調(diào)節(jié)脂蛋白穩(wěn)態(tài)［23］等作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，DN 組小鼠代謝物磷脂酰膽堿含量顯著升高［24］。溶血磷脂酰膽堿是磷脂酰膽堿裂解形成的脂質(zhì)生物分子，通過G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路對多種細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，包括增強炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和胰島素抵抗等［25］。DN 患者出現(xiàn)腎功能障礙的快速進(jìn)展與溶血磷脂酰膽堿增加有關(guān)，溶血磷脂酰膽堿通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體δ 引起脂滴積聚，進(jìn)而引起脂滴包被蛋白Perilipin 2 的上調(diào)和自噬通量的減少，從而導(dǎo)致近端腎小管細(xì)胞器應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［26］。磷脂酰乙醇胺是真核細(xì)胞中含量排名第二的甘油磷脂，功能上與蛋白質(zhì)生物發(fā)生和活性、氧化磷酸化、自噬、膜融合及線粒體穩(wěn)定有關(guān)，并且是其他脂質(zhì)的重要前體。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰乙醇胺是促進(jìn)早期糖尿病腎損害的代謝產(chǎn)物，與非糖尿病對照組相比，糖尿病患者腎小球和腎小管中的磷脂酰乙醇胺水平顯著增加［27］。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步揭示益智仁治療DN 的效應(yīng)物質(zhì)、作用靶點、代謝產(chǎn)物及代謝通路，充分體現(xiàn)了益智仁治療DN 多成分、多靶點、多途徑的作用特點。該方法為今后益智仁治療DN 的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

倪雅麗：負(fù)責(zé)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)處理及文章撰寫；姚宇劍、武素：負(fù)責(zé)中醫(yī)藥理論解釋、動物造模、樣本采集及檢測；謝毅強：負(fù)責(zé)實驗思路及最終文章的修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。